白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除及亞硝胺阻斷作用研究

1、加入頁眉 本科畢業(yè)論文首頁設(shè)計9目 錄摘要1關(guān)鍵詞1前言11試劑和儀器21.1試劑21.2儀器22 原理22.1亞硝酸鈉的清除率的測定22.2阻斷亞硝胺合成的原理23實驗方法33.1溶液的配制33.2 NaNO2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備及吸光度的測定33.3不同濃度白藜蘆醇溶液在pH=3時對亞硝酸鈉的清除率的測定43.4不同濃度白藜蘆醇溶液在pH=3時對亞硝胺合成的阻斷率測定44 結(jié)果及分析54.1 NaNO2溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制54.2不同濃度的白藜蘆醇在pH=3時對亞硝酸鈉的清除率及對亞硝胺的阻斷率55討論及結(jié)論7致謝7參考文獻(xiàn)8英文摘要9白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除及亞硝胺阻斷作用研究藥物制劑 ：劉玉

2、鋒指導(dǎo)老師 ：張孝林摘要：目的：以亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率為指標(biāo)，研究不同濃度的白藜蘆醇在酸性下對亞硝酸鹽的清除和對亞硝胺合成的阻斷作用。方法：分別配制0.1mg/mL、0.2mg/mL 、0.4mg/mL 、0.8mg/mL 、0.16mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL濃度的白藜蘆醇溶液和5ug/mL亞硝酸鈉溶液,在pH=3模擬胃酸條件下,采用分光光度法，分別測定不同濃度的白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除率及亞硝胺生成的阻斷率1。結(jié)果：在酸性條件下，不同濃度的白藜蘆醇對亞硝酸鈉均有較強清除作用，在濃度小于0.32 mg/mL時隨著濃度增大而增大，最大達(dá)到63.48%。同時

3、對亞硝胺的生成有較強的阻斷率，最大達(dá)到40.94%。結(jié)論：白藜蘆醇對亞硝酸鹽有很強的清除能力，對亞硝胺的生成有較強的阻斷能力。關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽，白藜蘆醇，分光光度法，亞硝胺，清除，阻斷前言癌癥是當(dāng)前威脅人類生活的最大殺手, 根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計, 全世界每年約有 500萬左右的人被癌癥奪去生命。在致癌物中, 亞硝胺是最令人關(guān)注的一類化學(xué)致癌物質(zhì)。亞硝酸鹽作為一種發(fā)色劑和防腐劑2，在肉制品加工中得到了普遍的應(yīng)用3 。許多蔬菜中天然含有的硝酸鹽，在人體內(nèi)通過細(xì)菌的作用也可被還原為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是合成亞硝胺的前體之一4，人體內(nèi)的這些亞硝酸鹽在一定條件下可以與食物中的仲胺、叔胺等形成亞硝胺。N-亞

4、硝基化合物是一種致癌性很強的化合物5，已研究的近300種N-亞硝基化合物中，約90%以上具有動物致癌性，并證明N-亞硝基化合物可在體內(nèi)外由前體物胺類與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成6。在體內(nèi)代謝過程中，特別是在胃液中容易形成亞硝胺7。因此，降低胃內(nèi)的亞硝酸鹽含量及阻斷亞硝胺前提的合成 7從而達(dá)到防癌抗癌的目的是人類同癌癥斗爭的有效途徑之一，而白藜蘆醇在這方面的研究鮮見報道。白藜蘆醇(resveratrol，簡稱Res)是非黃酮類的多酚化合物，日本人Tokaoka 1940年首次從毛葉藜蘆的根部分離得到。1963年Nonomura等提出白藜蘆醇是某些草藥治療炎癥、脂類代謝紊亂和心臟疾病等的有效成分，是存在

5、于植物中的天然抗氧化劑，如葡萄、虎杖等8被列為抗心血管、抗癌最有前景的藥物之一。白藜蘆醇具有優(yōu)良的藥理活性和保健功能，其市場需求很大且與日劇增。目前，已有大部分國家和地區(qū)都開發(fā)了白藜蘆醇的相關(guān)保健品和其他產(chǎn)品。中國已將含白藜蘆醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品，美國也已把白藜蘆醇作為膳食補充劑，日本已將從植物提取的白藜蘆醇作為食品添加劑9。白藜蘆醇的藥理功能引起了人們的廣泛興趣，因為它涉及到與人體健康密切相關(guān)的許多生理疾病，例如，動脈粥樣化、老年癡呆癥、病毒性肝炎、胃潰瘍、炎癥與過敏反應(yīng)等。隨著人們對白藜蘆醇的深入研究，已經(jīng)顯示白藜蘆醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎以及預(yù)防食物過敏等作用，

6、可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等領(lǐng)域。所以，對白藜蘆醇的研究及開發(fā)，特別是白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除及阻斷作用具有良好的市場前景及重要的意義。1 試劑和儀器1.1試劑白藜蘆醇（純度99%，購于陜西西慈生物技術(shù)有限公司）、蒸餾水、二乙胺鹽酸鹽、二水合檸檬酸三鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二甲胺鹽酸鹽、磷酸二氫鈉（均為AR，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、 亞硝酸鈉（AR，淮化試劑廠）、無水對氨基苯磺酸（AR，上海山浦化工有限公司）、95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為AR，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠）1.2 儀器紫外可見分光光度計 UV-5500PC型（上海元析儀器有限公司）、電子分析天平（上海精密科

7、學(xué)儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、超凈工作臺（蘇州蘇凈有限公司）2 原理2.1 亞硝酸鈉的清除率的測定10亞硝酸鈉在弱酸性的條件下, 能與氨基苯磺酸重氮化后, 再與 N -1-萘乙二胺鹽酸鹽偶合生成紅色的化合物，本實驗通過測定相同條件下亞硝酸鈉含量的變化來反映白藜蘆醇對亞硝酸根離子的清除能力，并計算清除率：清除率=( A 0 - A x ) / A0×100%A 0沒有加入白藜蘆醇的亞硝酸鈉溶液空白實驗的吸光度值； A x加入不同濃度白藜蘆醇溶液時的反應(yīng)液的平均吸光度值。溫度為37在pH=3的條件下，當(dāng)用相同量的亞硝酸鈉溶液同具有一定濃度梯度的白藜蘆醇

8、溶液反應(yīng)后，再測量吸光度。吸光度越小，溶液中殘存的亞硝酸鈉含量就越小，表明白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除率越高；反之，表明白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除率越低。2.2 阻斷亞硝胺合成的原理11 二甲胺與亞硝酸鈉在 37條件下, 可適宜地生成二甲基亞硝胺, 反應(yīng)式如下:(CH3)2NH+NaNO2 HCl (CH3)2NH·NO + NaCl + H2O其實質(zhì)為:(CH3)2NH+HONO (CH3)2NH·NO + H2O當(dāng)往白藜蘆醇溶液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時, 白藜蘆醇優(yōu)先同亞硝酸鈉作用, 使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應(yīng), 達(dá)到阻止二甲基亞硝胺生成的目的。據(jù)此可以比較相同條件下生

9、成二甲基亞硝胺量的多少來反映白藜蘆醇阻斷能力的強弱, 生成二甲基亞硝胺量少, 白藜蘆醇的阻斷能力就強, 反之則弱。在紫外光照射下, 二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根, 反應(yīng)式如下:H2O + (CH3)2N-N=O 紫外光 (CH3)2NH2+ + NO2- 亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后, 再與1-萘胺偶合生成紅色化合物。用紫外分光光度計測出該紅色化合物的吸光度值可反映出溶液中亞硝酸根離子的含量，亞硝酸根離子的含量可反映出原來溶液中二甲基亞硝胺含量的多少。3 方法3.1 溶液的配制3.1.1 0.4%對氨基苯磺酸溶液的配制：用分析天平精確稱取對氨基苯磺酸0.4g充分溶解后，定容至10

10、0mL。3.1.2 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液的配制：精確稱取鹽酸萘乙二胺0.2g充分溶解后，定容至100mL。3.1.3 0.1% 1-萘胺溶液的配制：精確稱取1-萘胺0.1g充分溶解后，定容至100mL。3.1.4 濃度為1mmol/L的二甲胺鹽酸鹽溶液的配制：精確稱取二甲胺鹽酸鹽0.08541g充分溶解后，定容至100mL。3.1.5 濃度為1mmol/L的亞硝酸鈉溶液的配制：精確稱取亞硝酸鈉0.069g充分溶解后，定容至1000mL。3.1.6不同濃度的白藜蘆醇溶液的配制：精確稱取64mg白藜蘆醇，置于燒杯中，加適量95%乙醇溶解，用蒸餾水定容于100mL 容量瓶中，配制成0.64mg/

11、mL的白藜蘆醇溶液并標(biāo)記為7號容量瓶，再分別稀釋配制成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL 、0.08mg/mL 、0.16 mg/mL和0.32mg/mL白藜蘆醇溶液，分別標(biāo)記為1,2,3,4,5,6號容量瓶，避光保存，備用。3.2 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液的制備及吸光度的測定12NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液制備:用天平精確稱取亞硝酸鈉20mg，充分溶解后，定容至1L即得20 mg/L的 NaNO2溶液。然后準(zhǔn)確取20 mg/ L的 NaNO2溶液250mL于一1L的容量瓶中并用蒸餾水稀釋、定容至刻度，搖勻后得到濃度為5ug/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液。NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別準(zhǔn)確吸取濃

12、度為5ug/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液0mL,0. 2mL ,0. 4mL , 0. 6mL ,0.8mL,1. 0mL ,1. 5mL ,2. 0 mL置于10 mL具塞試管中，并分別編號為0，1，2，3，4，5，6，7號試管。然后分別向各試管中加入0. 4%對氮基苯磺酸1 mL，搖勻，靜置35 min，再加入0. 2 %的鹽酸萘乙二胺溶液0.5 mL ,用水稀釋至刻度，搖勻得到濃度分別為0 ug/mL，0.1ug/mL，0.2ug/mL, 0.3ug/mL,0.4 ug/mL, 0.5ug/mL, 0.75ug/mL, 1.0ug/mL的NaNO2溶液，將所得到的溶液靜置15 min后，亞硝酸

13、根離子在538 nm下存在最大吸收峰，因此，本實驗在538 nm下測定其吸光度的值，繪制NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.3 不同濃度的白藜蘆醇溶液在pH=3時對亞硝酸鈉的清除率的測定13取8個10mL具塞試管，分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，5，6，7號試管，依次向各試管中加入5ug/mL的NaNO2 的溶液1mL。然后分別取0，1，2，3，4，5，6，7號100mL容量瓶中的白藜蘆醇溶液分別依次向0，1，2，3，4，5，6，7號具塞試管中順序加入1mL, 并依次向各試管中分別加入1mL pH=3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液14, 之后將8個試管置于37 恒溫水浴槽中反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，取出試管后立

14、即分別向8個試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4% 的對氨基苯磺酸溶液各1mL,搖勻靜置3至5分鐘后，再向各試管加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%鹽酸萘乙二胺溶液各1mL , 搖勻放置15 min 后, 用分光光度計在 538 nm 處分別測出0，1，2，3，4，5，7號試管反應(yīng)液吸光度值（A）,其中以加入除白藜蘆醇溶液和亞硝酸鈉溶液外其他所有等量的其他試劑的溶液作為參比溶液，每個濃度配制3個樣品測量吸光度求平均值。根據(jù)下列公式求得白藜蘆醇對亞硝酸根離子的清除率：清除率= ( A 0 - A x ) / A0×100%A 0沒有加入白藜蘆醇溶液的試管中NaNO2 的吸光度值，即0號試管的吸光度值； A

15、x加入不同濃度白藜蘆醇溶液反應(yīng)后試管中NaNO2的吸光度值。3.4 不同濃度的白藜蘆醇溶液在pH=3時對亞硝胺合成的阻斷率測定11取8個10mL具塞試管，分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，5，6，7號試管。分別取0，1，2，3，4，5，6，7號100mL容量瓶中的白藜蘆醇溶液分別依次向0，1，2，3，4，5，6，7號具塞試管中順序加入0.5mL, 然后再依次向各試管中分別加入1mL pH= 3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液,然后依次向各試管加入1mmol/mL的NaNO2的溶液1mL,再向各試管加入1mmol/mL的二甲胺溶液1mL。用蒸餾水將各試管定容刻度為8mL，將各試管置于37恒溫水浴槽中反應(yīng)

16、1 小時。反應(yīng)結(jié)束后，置于紫外分析儀上照15 min , 取出后加1%的對氨基苯磺酸溶液1mL,再加0.1%的1-萘胺1mL,然后搖勻放置15min后, 用分光光度計在525nm 處測吸光度值(A) ,其中以加入除白藜蘆醇溶液和亞硝酸鈉溶液外其他所有試劑的溶液為參比溶液，每個濃度配制3個樣品測量吸光度求平均值。根據(jù)下列公式求得白藜蘆醇對亞硝胺合成的阻斷率：阻斷率= ( A 0 - A x ) / A 0×100%A 0 沒有加白藜蘆醇溶液試管中NaNO2 的吸光度值，即0號試管的吸光度值；A x 加入不同濃度的白藜蘆醇溶液后試管中NaNO2 的吸光度值。4 結(jié)果及分析4.1 NaNO

17、2溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液在538 nm下測定其吸光度的值如表1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可NaNO2知在濃度0.1-1 ug/mL存在很好的線性關(guān)系，隨著亞硝酸根離子濃度的增大吸光度增大。表1 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度Table 1 The absorbance of standard solution of NaNO2序號1234567濃度(ug/mL)0.10.20.30.40.50.751吸光度 A0.0040.0070.0110.0140.0170.0250.034圖1 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of NaNO2

18、4.2 不同濃度的白藜蘆醇在pH=3時對亞硝酸鈉的清除率及對亞硝胺的阻斷率從表2和圖2可知，白藜蘆醇濃度在0.01-0.32mg/mL時，對亞硝酸根離子的清除率隨著濃度的增大而增大，對亞硝酸根離子的清除率最大達(dá)到63.48%。隨后對亞硝酸根離子的清除率并不再繼續(xù)隨著濃度的增大顯著增加。表2 pH=3時不同濃度白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除率Table 2 The rate of resveratrol at different concentrations clearing sodium nitrate under PH=3序號01234567白藜蘆醇濃度（mg/mL）00.010.020.040.

19、080.160.320.64清除率（%）0.0018.4428.7234.7539.0143.4363.4863.49圖2 pH=3時不同濃度白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除率Figure 2 The clearing rate of NaNO2 on resveratrol with different concentrations at PH=3從表3和圖3可知，白藜蘆醇濃度在0.01-0.32mg/mL時，對亞硝胺的阻斷率隨著濃度的增大而增大，對亞硝胺的阻斷率最大達(dá)到40.94%。隨后對亞硝胺的阻斷率并不再繼續(xù)隨著濃度的增大顯著增加。表3 pH=3時不同濃度白藜蘆醇對亞硝胺的阻斷率Table 3

20、 The blocking of nitrosamine on resveratrol with different concentrations at PH=3序號01234567白藜蘆醇濃度（mg/mL）00.010.020.040.080.160.320.64阻斷率（%）0.008.3912.7517.1124.1631.2140.9440.96圖3 pH=3不同濃度白藜蘆醇對亞硝胺的阻斷率Figure 3 The rate of resveratrol at different concentrations blocking nitrosamines under PH=35 討論及結(jié)論

21、當(dāng)溶液環(huán)境為酸性條件時相當(dāng)于胃液環(huán)境條件下，隨著白藜蘆醇濃度的增大，白藜蘆醇對亞硝酸鹽的清除能力不斷增強，當(dāng)白藜蘆醇濃度大約在0.32mg/mL時有著63.48%的最大清除率；但是當(dāng)白藜蘆醇濃度增大到一定程度后，白藜蘆醇對亞硝酸鈉的清除能力不再隨著白藜蘆醇濃度的增大而顯著增加，而是達(dá)到一個穩(wěn)定的清除率水平。不同濃度的白藜蘆醇溶液對亞硝胺的生成有一定的阻斷作用，白藜蘆醇濃度約在0.32mg/mL時有著40.94%的最大阻斷率；但是當(dāng)白藜蘆醇濃度增大到一定程度后，白藜蘆醇對亞硝胺的阻斷能力也不再隨著白藜蘆醇濃度的增大而顯著增加，而是達(dá)到一個穩(wěn)定的阻斷率水平。結(jié)果表明，白藜蘆醇對人體中的亞硝酸鹽有著

22、良好的清除及阻斷作用。人們應(yīng)充分認(rèn)識到白藜蘆醇在日常生活中的重要作用，進(jìn)而為有關(guān)白藜蘆醇的藥品、保健食品的開發(fā)和推廣提供保障。致謝.參考文獻(xiàn)1 王廣健.亞硝酸根偶聯(lián)反應(yīng)及其應(yīng)用于光度法測定亞硝酸根離子J.分析化學(xué).1998.26(4:):495-497.2 李冬梅.降低肉制品中的亞硝酸鹽含量J.肉類加工.1997,(3):16-19.3 譚燕,莊松娟.肉制品中亞硝酸鹽國標(biāo)測定方法的探討.2005,(7):26-28.4 曹會蘭.亞硝酸鹽對人體的危害和預(yù)防J.微量元素與健康研究,2003,(2):78-80.5 徐國平.蔬菜、水果對N-亞硝基化合物致癌的預(yù)防作用J.國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊,1989

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25、#160;nitrosamineYufeng Liu,Xiaolin ZhangSchool of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, Anhui, ChinaAbstract:Objective:It is the indicator to study the different concentrations of resveratrol in the 

26、acidic environment and alkaline environment , clearing nitrite and blocking nitrosamine,which  includes the clearing rate of nitrite and the blocking rate of nitrosamine. Methods:Preparing concentrations of resveratol solutio