生物色譜法及其在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

1、生物色譜法及其在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用生物色譜法（Biochromatography）是20世紀(jì)80年代中后期由生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)交叉形成的一種新興色譜技術(shù)。生物色譜技術(shù)是將各種具有生物活性的材料（如細(xì)胞膜、細(xì)胞、蛋白等）固定于高效液相色譜（HPLC）的載體上，應(yīng)用HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù)的一種方法，為研究小分子配體和生物大分子之間的相互作用提供了快速、簡(jiǎn)單、精確的手段。藥物的色譜保留由小分子配體和生物大分子之間相互作用所決定，可以為研究小分子配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合程度、結(jié)合部位等提供信息。藥物生物色譜技術(shù)的建立，可以模擬生理或病理狀態(tài)下藥物在體內(nèi)進(jìn)行生物活性表達(dá)的一些關(guān)鍵步驟。生物色譜法使效應(yīng)

2、成分的分離與篩選結(jié)合在一起，克服了以往先從藥物中分離有效部位或單體，再分析其藥效，從而使成分分離與藥效篩選脫節(jié)的弊端；對(duì)已知結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行效應(yīng)成分及作用靶點(diǎn)分析，是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理的一項(xiàng)基礎(chǔ)研究。由于生物色譜法能較快地提供藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并通過(guò)制備型HPLC制備相當(dāng)數(shù)量的純品，就有可能針對(duì)性地設(shè)計(jì)提取工藝，以盡可能多地富集藥效成分；認(rèn)識(shí)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，就有可能針對(duì)效應(yīng)物質(zhì)制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也就有可能針對(duì)藥效物質(zhì)的理化特征，研究其制劑的劑型，以保證藥品的安全性、有效性、可控性、穩(wěn)定性和均勻性，確保實(shí)現(xiàn)藥物研究的現(xiàn)代化。目前，伴隨組合化學(xué)的發(fā)展，成千上萬(wàn)種具有潛在活性的藥物被合成。從藥物的發(fā)現(xiàn)到投

3、放市場(chǎng)需要對(duì)藥物的有效成分進(jìn)行篩選及一系列臨床前的藥代學(xué)和藥效學(xué)的研究。藥物篩選的初級(jí)階段傳統(tǒng)上在動(dòng)物模型上完成，在藥代動(dòng)力學(xué)研究中主要應(yīng)用HPLC1-3，但成本昂貴、耗費(fèi)時(shí)間。出于倫理和經(jīng)濟(jì)原因，為了減少甚至避免使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)獲得藥物開(kāi)發(fā)中新化合物的主要信息。目前，人們已經(jīng)投入大量精力進(jìn)行藥物在生物體外的實(shí)驗(yàn)研究，生物色譜法即是其中之一。生物色譜法可用于藥動(dòng)學(xué)，藥效學(xué)、藥物毒理學(xué)以及合理開(kāi)發(fā)新藥的研究，它一般是通過(guò)藥物與靶點(diǎn)即生物大分子包括受體、通道、酶等結(jié)合的原理使藥物產(chǎn)生效應(yīng)（或毒性），并應(yīng)用于藥物活性成分的篩選和藥物作用機(jī)理的研究4, 5。生物色譜法使效應(yīng)成分的分離與篩選結(jié)合在一起

4、，尤其適用于中藥等復(fù)雜基質(zhì)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。1 生物色譜法的基本原理和特點(diǎn)現(xiàn)代生命科學(xué)已闡明了細(xì)胞、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、組成，并逐步了解了酶、受體、抗體、傳輸?shù)鞍?、DNA、肝微粒體等在生命活動(dòng)中所起的重要生理作用。若將這些活性生物大分子、活性細(xì)胞膜、甚至活細(xì)胞固著于色譜載體上，作為一種生物活性填料，用于液相色譜法，形成一種能夠模仿藥物與生物大分子、靶體或細(xì)胞相互作用的色譜系統(tǒng)，這樣藥物與生物大分子、靶體間的疏水性、氫鍵、范德華、靜電及立體等相互作用就能用色譜中的各種技術(shù)參數(shù)定量表征，可以方便地研究藥物與生物大分子、靶體或細(xì)胞間的特異性、立體選擇性等相互作用，篩選活性成分，揭示藥物的吸收、分布、活

5、性、毒副作用、構(gòu)效關(guān)系、生物轉(zhuǎn)化、代謝等機(jī)理，為探討藥物間的競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同、拮抗等相互作用提供有效手段。基于上述原理，生物色譜法具有以下三個(gè)突出特點(diǎn)：（1）可以模擬生理或病理狀態(tài)下藥物在體內(nèi)進(jìn)行生物活性表達(dá)的一些關(guān)鍵步驟；（2）藥物在生物色譜柱上的保留行為直接與其活性或與生物大分子、靶體或細(xì)胞間的結(jié)合相關(guān)，具有一定的藥理學(xué)或生理學(xué)意義；（3）生物色譜法的固定相能夠特異性、選擇性地與活性成分結(jié)合。由于中藥成分復(fù)雜，應(yīng)用經(jīng)典的天然藥物分離提取方法篩選其中特定的有效成分周期長(zhǎng)，命中率相對(duì)較低，而生物色譜法可不經(jīng)提取分離步驟，在特定藥效活性篩選模型上直接確定中藥中的某種活性成分。篩選方法快速、簡(jiǎn)單、命中率

6、高，是研究中藥等復(fù)雜對(duì)象中藥效成分的有效手段。1.1 生物色譜法的種類及其應(yīng)用1.1.1 生物膜色譜法（Biomembrane Chromatography）生物膜色譜法是以人或動(dòng)物的活性細(xì)胞膜固定在特定載體表面，制備成細(xì)胞膜固定相，并保持細(xì)胞膜的整體性、膜受體的立體結(jié)構(gòu)、周圍環(huán)境的穩(wěn)定性及酶活性。用HPLC法研究藥物或化合物與固定相上的細(xì)胞膜、膜受體和酶相互作用的理想技術(shù)，生物膜色譜還可以預(yù)測(cè)藥物在人體內(nèi)的吸收。生物膜色譜法可以直接用于研究藥物與膜受體的特異性、立體選擇性相互作用，所得到的色譜參數(shù)如容量因子k、分離因子及分辨率R等對(duì)藥物作用機(jī)理的研究和新藥的篩選都具有重要的參考價(jià)值。賀浪沖等

7、采用血管細(xì)胞膜色譜法篩選當(dāng)歸、紅毛七中對(duì)主動(dòng)脈血管有舒張作用的有效成分6, 7。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸的乙醚提取物是當(dāng)歸中對(duì)血管有舒張作用的有效部位，而DG-21則是其主要有效成分。紅毛七正丁醇部位是紅毛七中對(duì)血管有舒張作用的有效部位，而由紅毛七正丁醇部位中分離得到的成分HMQ-44則是其有效成分。1.1.2 分子生物色譜法（Molecular Biochromatography） 分子生物色譜法是指以生物大分子為固定相的HPLC技術(shù)，并且溶質(zhì)在該固定相上的保留行為及立體選擇性能夠反映生物大分子非固定時(shí)與溶質(zhì)相互作用的特性。這一色譜技術(shù)其實(shí)是親和色譜的擴(kuò)展，但它側(cè)重于研究生物分子間的相互作用8。李萍等采

8、用分子生物色譜法研究了金銀花中與牛血清白蛋白有結(jié)合作用的潛在活性物質(zhì)9?？琢恋纫匀搜灏椎鞍缀?酸性糖蛋白這兩種載體蛋白為固定相，對(duì)常用中藥當(dāng)歸、川芎、茵陳、黃芪、赤芍、銀杏葉、丹參等進(jìn)行了分析,得到了這些中藥的分子生物色譜指紋圖譜10-12。利用這些圖譜,可以鑒別中藥材的種類、產(chǎn)地和真?zhèn)?。在中藥活性成分篩選方面,這些分子生物色譜指紋圖譜的主要作用，在于它能給出這些中藥中血漿結(jié)合率高的主要成分的色譜峰，這些色譜峰所代表的成分應(yīng)該具有藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)方面的意義。1.1.3 細(xì)胞生物色譜法（Cell Biochromatography）細(xì)胞生物色譜法以人或動(dòng)物的活細(xì)胞為固定相，是研究藥物與活細(xì)胞相互

9、作用的理想技術(shù)。鄒漢法等采用細(xì)胞生物色譜法篩選中藥土槿皮和防己中有潛在抗腫瘤活性的成分13。將土槿皮和防己提取液與乳腺癌細(xì)胞（MCF-7和多藥耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞）培養(yǎng)液混合，用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）分析，與空白組（不加細(xì)胞培養(yǎng)液）相比，峰面積減少的物質(zhì)即為與細(xì)胞有結(jié)合作用的潛在活性物質(zhì)。Zeng等14將人紅細(xì)胞固著在凝膠顆粒中,作為生物色譜的固定相。由于固著在凝膠顆粒中的紅細(xì)胞膜上的葡萄糖傳輸?shù)鞍譍lut 1具有區(qū)分立體異構(gòu)體的色譜分辨能力，用此固定相能成功地將兩種不同的葡萄糖立體異構(gòu)體拆分。2 生物色譜法面臨的問(wèn)題及對(duì)策(1) 在生物體內(nèi)的靶組織上起效應(yīng)作用的中藥活性

10、成分不一定是其原形，也可能是經(jīng)體內(nèi)代謝后的代謝產(chǎn)物，所以用生物色譜法篩選中藥活性成分時(shí)，不僅要考慮使用中藥原材料，還要考慮使用其體內(nèi)代謝物。(2) 在生物色譜法的分離中，生物色譜柱的固定相載體也可能對(duì)中藥成分的分離起一定作用。生物色譜法中通常采用硅膠作固定相載體，通過(guò)硅膠的吸附作用，將生物活性材料固定在其表面。如果生物活性材料對(duì)硅膠包裹不全，則生物色譜柱可能還有吸附性，從而干擾對(duì)中藥活性成分的分離。生物色譜法中也可采用凝膠顆粒作固定相載體14。例如，用衍生化的丙烯酰胺單體合成為帶正電荷配位體的凝膠，用作固定相載體,可使紅細(xì)胞固著在凝膠顆粒中。采用凝膠作載體固著紅細(xì)胞，有以下好處：由于凝膠表面積

11、大，涂布的紅細(xì)胞多，凝膠可依靠其電荷、孔狀結(jié)構(gòu)等性質(zhì)結(jié)合紅細(xì)胞；凝膠色譜可用等滲磷酸鹽緩沖液作流動(dòng)相，并加入三磷酸腺苷等，以利紅細(xì)胞存活。在采用凝膠作生物色譜固定相載體時(shí)，要注意根據(jù)所分離的中藥活性成分分子量，選用有適當(dāng)孔隙大小的凝膠品種，這樣，可以利用凝膠色譜的分離特點(diǎn)，除去一些大分子的雜質(zhì)成分；此外，柱子應(yīng)粗而短，流速應(yīng)低，以避免柱內(nèi)高壓影響紅細(xì)胞存活。(3) 考慮到色譜分離的條件與生物色譜固定相為保持其生物活性而必需的條件不易兼顧的矛盾，可以采用在色譜柱外使細(xì)胞上的藥物作用靶點(diǎn)與中藥的活性成分結(jié)合的方法。(4) 由于生物色譜法所分離的中藥活性成分的量很少，對(duì)其進(jìn)一步作分子結(jié)構(gòu)鑒定是比較困

12、難的。因?yàn)橐占阶銐蜃鞣肿咏Y(jié)構(gòu)鑒定的活性成分的量，往往要采用比較困難的制備色譜。隨著儀器的進(jìn)步，這種狀況會(huì)有所改善。給高效液相色譜儀配備二極管陣列檢測(cè)器，可以方便地隨時(shí)查看每個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的中藥成分的紫外光譜圖；如果給高效液相色譜儀聯(lián)接高分辨率的質(zhì)譜儀，有可能同步完成中藥有效成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，從而極大地提高用生物色譜法篩選中藥活性成分的效率。參考文獻(xiàn)1.Feng, Y.; Zhang, L.; Shen, Z.; Pan, F.; Zhang, Z., Analysis of amlodipine in human plasma by liquid chromatography-mass

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