常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用

1、.實驗一常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用一實驗?zāi)康囊? 掌握培養(yǎng)基的概念和分類。2掌握常用培養(yǎng)基制備的一般程序。3熟悉常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)和用途。二實驗原理培養(yǎng)基（ culture medium ）是根據(jù)微生物生長繁殖所需要的一定比例的營養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源等）、氫離子濃度（ pH 值）以及滲透壓等條件，用人工方法制成的無菌營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微生物分離培養(yǎng)、生化鑒定和保存菌種等。培養(yǎng)基按物理性狀不同可分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按性質(zhì)和用途不同又可細(xì)分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀和用途等不同常將培養(yǎng)基分裝于試管或平皿等容器中。常用培養(yǎng)基制備的一般程序

2、是：調(diào)配成分溶解較正 pH 值過濾分裝滅菌質(zhì)量檢驗保存。配制培養(yǎng)基時可以按照培養(yǎng)基配方調(diào)配各種基本成分，也可購買半成品的商品培養(yǎng)基干粉制劑直接配制。三器材與試劑試劑普通營養(yǎng)瓊脂干粉、脫纖維羊血、半固體培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基干粉、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基干粉、1 mol/L NaOH溶液、麥康凱培養(yǎng)基成分（蛋白胨、氯化鈉、膽鹽、乳糖、5 g/L 中性紅水溶液、瓊脂粉）、蒸餾水。器材小型藥物天平、藥匙、稱量紙、三角燒瓶、量筒、吸管、精密pH 值試紙試管、硅膠塞、牛皮紙（或報紙）、棉線、玻璃棒、玻璃紙、無菌平皿、高壓蒸汽滅菌鍋、微波爐等。四步驟與方法常用培養(yǎng)基制備的一般程序及方法）調(diào)配成分 根據(jù)培養(yǎng)基配方或用

3、法， 準(zhǔn)確計算、 稱量所需培養(yǎng)基各基本成分或干粉制劑，裝于三角燒瓶中，加入定量蒸餾水充分混合。）溶解 將盛有混合物的三角燒瓶置于沸水浴或流動蒸汽滅菌器中加熱溶解， 呈半透明狀。）校正pH 值即將培養(yǎng)基pH 值校正到適合細(xì)菌生長的最適pH 值，一般病原菌的最適 pH 值為 7.2 7.6。校正培養(yǎng)基pH 值的常用試劑有1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/LNaCO 3溶液和 1 mol/LHCl 溶液（注意：培養(yǎng)基高壓滅菌后，用 NaOH 和 HCl 校正的 pH 值會下降 0.1 0.2，而用 NaCO3 溶液校正的pH 值會上升 0.1 0.2）；校正培養(yǎng)基pH 值的方法常用精密 p

4、H 值試紙法、比色法和電子pH 計法等。）過濾培養(yǎng)基中若存在雜質(zhì)或沉淀物時則需要過濾澄清。液體培養(yǎng)基用濾紙趁熱過.濾，固體培養(yǎng)基用雙層紗布夾脫脂棉趁熱過濾。）分裝（）液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/41/3 處，加塞， 510 支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后直立放置。（）固體斜面培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/3 1/2 處，加塞， 5 10 支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后趁熱擺成斜面， 斜面長度為試管長度的2/3，并保持斜面下端距離管底有1 cm 以上柱高， 同時斜面上端距離試管

5、塞1 cm 以上。（）瓊脂高層培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下2/3 處，加塞， 510 支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后直立放置。（）固體平板培養(yǎng)基將培養(yǎng)基分裝于三角燒瓶（培養(yǎng)基的量要小于三角燒瓶最大容量），先用玻璃紙或棉塞封口，再用牛皮紙蓋帽、棉線扎口。滅菌后將培養(yǎng)基冷卻至50 左右，以無菌操作，傾注于平皿內(nèi)（內(nèi)徑為9 cm 的平皿傾注15 20 mL 培養(yǎng)基），馬上水平旋轉(zhuǎn) 1 2 周，使培養(yǎng)基均勻平鋪于皿底。待培養(yǎng)基凝固后，在皿底面上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期，底上蓋下倒置保存。）滅菌根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)耐熱性的不同分別采取相應(yīng)的物理滅菌法（）培

6、養(yǎng)基成分均耐高熱時常用高壓蒸汽滅菌法，這也是最常用、 最可靠的培養(yǎng)基滅菌方法。常用滅菌條件為103.43 kPa（ 121.3 ）15 20 min ；含糖培養(yǎng)基用68.95 kPa（115.6 ） 10 15 min ，以免破壞糖類物質(zhì)。（）培養(yǎng)基中含有不耐高熱營養(yǎng)物質(zhì)（如糖類、明膠和牛乳等）時，常用流通蒸汽滅菌法，方法是80 100 加溫 30 min，每天 1 次，連續(xù)3 d。（） 培養(yǎng)基中富含蛋白質(zhì)（如血清或雞蛋清）時需用血清凝固器滅菌，方法是將需滅菌的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)（一般做成斜面），第一天75 加熱 30 min ，第二天80 加熱 30 min ，第三天85 加熱 30

7、min ，在 3 次滅菌間隙將培養(yǎng)基取出，置35 恒溫箱中過夜。（）對液態(tài)高營養(yǎng)的不耐熱培養(yǎng)基，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等，可采用濾過除菌。）質(zhì)量檢驗制備好的培養(yǎng)基須經(jīng)性狀檢查、無菌檢驗和效果檢驗均合格才可使用。（）性狀檢查液體培養(yǎng)基應(yīng)外觀清澈透明；半固體培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，呈半固態(tài)；固體斜面培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，凝固后斜面穩(wěn)定， 不下滑；平板培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，表面光滑、平整，薄厚適宜。（）無菌檢驗將制備好的培養(yǎng)基置于35 培養(yǎng) 24 h，以無任何細(xì)菌生長為合格。（）效果檢驗將已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于待檢培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后檢查標(biāo)準(zhǔn)菌的生長繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果符合。.）保存 制備好且標(biāo)記清楚的培養(yǎng)

8、基置于4 冰箱保存?zhèn)溆茫?嚴(yán)格滅菌后的培養(yǎng)基一般可保存 1 周以上，但不宜過久。注意平板培養(yǎng)基應(yīng)底上蓋下倒置保存，以防止蓋內(nèi)水蒸汽落在培養(yǎng)基表面， 使得培養(yǎng)基表面粘滯易污染且不易接種；液體、半固體等培養(yǎng)基應(yīng)直立保存。常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸餾水，先倒入三角燒瓶一部分，隨后按照營養(yǎng)肉湯成分配方 （蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL 見附錄一）或干粉制劑說明書用法準(zhǔn)確計算、稱量所需粉劑，置于已經(jīng)盛有部分蒸餾水的三角燒瓶中，最后將量筒內(nèi)剩余蒸餾水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、加熱溶解后，用1 mol/L NaOH 校正 pH 值到 7.

9、5 7.6（高壓后可降到培養(yǎng)基要求的7.4），分裝于試管中，加塞扎捆標(biāo)記后高壓蒸汽 121 滅菌 20 min。取出后直立放置，待冷卻后置于4 保存?zhèn)溆??？捎糜谝话慵?xì)菌的增菌培養(yǎng)。）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸餾水，先倒入三角燒瓶一部分，之后按照營養(yǎng)瓊脂成分配方（蛋白胨10 g，牛肉膏 3g，氯化鈉 5g，瓊脂粉 20g，蒸餾水 1000 mL見附錄一） 或干粉制劑說明書用法準(zhǔn)確計算、稱量所需粉劑， 置于已經(jīng)盛有部分蒸餾水的三角燒瓶中， 最后將量筒內(nèi)剩余蒸餾水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、 加熱煮沸溶解后呈半透明狀，校正 pH 值到 7.2 7.4。若制作固體斜面則先分裝于試管中，加塞扎捆

10、標(biāo)記后高壓蒸汽 121 滅菌 20 min ，高壓后趁熱擺成斜面，凝固后置于4 保存，可用于一般細(xì)菌菌種的傳代保存；若制作固體平板，則直接封裝在三角燒瓶中，高壓蒸汽121 滅菌 20 min ，滅菌后以無菌操作傾注平板，待凝固后標(biāo)記、 倒置于 4 保存， 可用于對營養(yǎng)要求不高細(xì)菌的分離培養(yǎng)和純化。）半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：配方見附錄一是蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂粉 5 g，蒸餾水 1000 mL ， pH 為 7.4，具體做法同肉湯培養(yǎng)基?？捎糜谟^察細(xì)菌的動力和保存菌種。）血瓊脂平板將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到50 左右，以無菌操作加入10%的無菌脫纖維羊血 （或兔血） ，立

11、即混勻， 避免產(chǎn)生氣泡， 然后以無菌操作分裝于無菌試管或平皿，制成血瓊脂斜面或血瓊脂平板。血瓊脂斜面可用于保存營養(yǎng)要求高的細(xì)菌；血瓊脂平板可用分離培養(yǎng)細(xì)菌和檢測其溶血性。）巧克力瓊脂平板是基于血瓊脂平板制備基礎(chǔ)之上，特點在于滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到 70 80 時加入無菌脫纖維血液，且在80 水浴中搖勻15 20 min ，使血液的色澤由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)榍煽肆ι?，然后冷?0 左右， 以無菌操作傾注平板即制成巧克力瓊脂平板?？捎糜诜蛛x培養(yǎng)奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌屬等對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌。）麥康凱瓊脂平板按照配方基本成分（蛋白胨20 g ， NaCl 5 g ，膽鹽 5 g ，乳糖10 g，5 g/L 中

12、性紅水溶液5 mL ，瓊脂 20 g，蒸餾水1000 mL 見附錄一）自行配制時，先將.除乳糖、中性紅之外的成分混合加熱溶解，調(diào)pH7.2 之后，再加入乳糖、中性紅，混勻后高壓滅菌 115 15min ，取出冷卻至50 左右，以無菌操作傾注平板，凝固后標(biāo)記、倒置于 4 保存，可用于腸桿菌科細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定。五注意事項要防止加熱溶解時培養(yǎng)基粘瓶底燒結(jié)，可先在三角燒瓶底部加入部分量好的蒸餾水，再加入稱量好的固體成分，最后將量筒內(nèi)剩余的蒸餾水全部倒入三角燒瓶。制備培養(yǎng)基最好用玻璃器皿（燒瓶、燒杯）。若制備大量培養(yǎng)基時可用鋁鍋或搪瓷桶，但不能用鐵、銅器皿，因為鐵離子進入培養(yǎng)基，達(dá)到一定濃度會抑制細(xì)菌生長，而銅離子會抑制細(xì)菌毒素產(chǎn)生。在按照配方自行配制培養(yǎng)基時，