銀杏葉提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響

1、銀杏葉提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響         【摘要】  目的 通過藥理實驗證明，銀杏葉提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響，從而說明銀杏葉提取物能提高機(jī)體的免疫功能。方法 通過對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能、NK細(xì)胞活性、TNF活性、IL-2誘生水平等免疫指標(biāo)的測定，從而得出銀杏葉提取物對機(jī)體免疫功能的影響。結(jié)果 證明銀杏葉提取物具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能的作用。結(jié)論 銀杏葉提取物可顯著提高荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能；低劑量可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性；可顯著增強(qiáng)TNF活性，且具有劑量依賴性；可顯著增強(qiáng)IL-

2、2的誘生水平，且具有劑量依賴性 【關(guān)鍵詞】  銀杏葉提取物 S180細(xì)胞 血清藥理學(xué) 殺傷細(xì)胞 天然 腫瘤壞死因子 白介素2   銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏（Ginkgko biloba L）的葉子。秋季采集，曬干。氣微，味微苦。歸心、肺經(jīng)。傳統(tǒng)上用于治療冠心病、心絞痛、高血脂等癥。主要化學(xué)成分為黃酮類、內(nèi)酯類化合物。近幾年研究報道銀杏葉提取物不但具有擴(kuò)張血管的作用，還有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、降血脂、抗腫瘤作用，許多醫(yī)藥學(xué)古籍記載了銀杏葉具有治療膀胱腫瘤和消化道腫瘤的作用。民間就有食用銀杏葉治療癌癥的做法。本組用荷瘤小鼠做實驗，探討銀杏葉提取物對機(jī)體免疫功能的影響

3、及其作用機(jī)制。   1  儀器與材料光學(xué)顯微鏡：日本Olympus；高速離心機(jī)：日本SAKURA；電磁攪拌機(jī)：日本SAKURA；電子天平：沈陽龍騰稱量儀器有限公司；CO2孵箱：美國Back tel型號WJ-301T；RPMI-1640培養(yǎng)基：美國GIBCO公司；S180細(xì)胞：延邊大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室；昆明種小白鼠（體重1822 g，雌雄各半，普通級）：延邊大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心；新生小牛血清：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；刀豆蛋白A（ConA）：Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：Genview公司；胰蛋白酶：Genvie

4、w公司。   2  方法   21  銀杏葉提取物的制備  取秋季新采集已曬干的銀杏葉2 kg，切碎，以95%乙醇10000 ml浸泡過夜，再加熱至60 ，溫浸5 h，倒出提取液，再加入95%乙醇10000 ml重復(fù)提取一次，然后再用70%乙醇10000 ml煮沸一次，保持沸騰約2 h，將三次提取所得浸出液合并后減壓濃縮，得棕綠色黏稠液狀的總浸膏?？偨嗉舆m量水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。每溶劑萃取4次，每次1000 ml。分別得石油醚萃取物0.242 kg，氯仿萃取物0.324 kg，乙酸乙酯萃取物0.331

5、kg。取乙酸乙酯萃取物溶解后上硅膠柱，以氯仿-甲醇（41）洗脫，分別收集綠色、黃綠色、紅色、棕色和褐色五條色帶的流份做初步的細(xì)胞毒性實驗，結(jié)果以紅色流份的抑制細(xì)胞增殖效果最為明顯，因此將紅色流份作為本實驗的有效成分，將其收集于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中蒸干，過濾除菌，備用。   22  小鼠胸腺指數(shù)的測定1  將小鼠處死，取胸腺稱重，計算胸腺指數(shù)。   23  小鼠脾細(xì)胞懸液的制備2  將小鼠處死，取脾臟，研磨，沙網(wǎng)過濾（200目），加入紅細(xì)胞裂解液，裂解3 min，1500 r/min離心8 min，取出淋巴細(xì)胞，生理鹽水沖洗

6、2次，   作者單位： 1 134300 吉林白山，白山市食品藥品檢驗所   2 134300 吉林白山，白山市中心醫(yī)院   800 r/min離心10 min，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，37 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，備用。   24  淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的測定2  將制備的小鼠脾細(xì)胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入于96孔培養(yǎng)板，100 l細(xì)胞懸液/孔。加入濃度為2.5 l/ml的ConA，10

7、0 l/孔，于37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，棄上清，每孔加入MTT（5mg/ml）試液10 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 l，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測在570 nm處測吸收度。   25  NK細(xì)胞活性的測定3  采用MTT方法測定，將制備的脾細(xì)胞懸液調(diào)濃度為3.1×106/ml。取傳代兩次且生長良好的靶細(xì)胞Yac-1，用培養(yǎng)液調(diào)濃度為1.4×105/ml，使得效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例為251。將兩種細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每只小鼠脾細(xì)胞懸液均設(shè)3孔，其中2孔加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，各100

8、l，另1孔為效應(yīng)細(xì)胞對照，加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640（含10%小牛血清）各100 l。整批實驗還設(shè)3孔靶細(xì)胞對照，加入靶細(xì)胞和RPMI-1640各100 l。上述各孔于37 5%CO2條件殺傷4 h后，棄上清，每孔加入MTT（5 mg/ml）試液10 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 l，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測吸收度。   26  TNF活性測定4   261  TNF的誘生  將制備的小鼠脾細(xì)胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×

9、;106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500 l，每孔再加終濃度為5 g/ml的ConA，500 l/孔，37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，12000 r/min離心15 min，取上清液，備用。   262  TNF活性測定  將生長良好的L929細(xì)胞用0.25%胰酶消化液消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成4×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板100 l/孔，同時將待測樣品也加入培養(yǎng)板100 l/孔，37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，輕輕吸去上清液100 l，加入MTT（1mg/ml）試液 100 l，37

10、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，2000 r/min離心5 min，吸棄上清液，每孔加DMSO 100 l，作用30 min，用酶標(biāo)測定儀測570 nm處的吸收度。   27  IL-2誘生水平的測定5   271  小鼠脾細(xì)胞懸液IL-2的誘生  將制備的小鼠脾細(xì)胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500 l，每孔再加終濃度為5 g/ml的ConA，500 l/孔，37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，12000 rpm離心

11、15 min，取上清，備用。   272  誘生水平的測定  取傳代培養(yǎng)48 h的CTLL-2細(xì)胞，用培養(yǎng)液離心洗滌2次，每次1000 r/min離心5 min，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板100 l/孔，同時將待測樣品也加入培養(yǎng)板100 l/孔，37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 min后，輕輕吸去上清液100 l，加入MTT（1mg/ml）試液 100 l，37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，2000 r/min離心5 min，吸棄上清液，每孔加DMSO 100 l，作用3

12、0 min，用酶標(biāo)測定儀測在570 nm波長處測吸收度。            3  結(jié)果   31  銀杏葉提取物對荷瘤小鼠胸腺重量的影響  結(jié)果見表1。 表1  銀杏葉提取物對荷瘤小鼠胸腺重量的影響注：與腫瘤模型組比較，P005；與正常組比較，P005   腫瘤模型組小鼠胸腺指數(shù)明顯低于正常組，而三個劑量的提取物能明顯提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)，使其恢復(fù)到正常水平，但各個提取物并未表現(xiàn)出劑量依賴性。 

13、60; 32  銀杏葉提取物對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響  結(jié)果見表2。 表2  銀杏葉提取物對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響注：與正常組比較，P005；與腫瘤模型組比較，P005；與正常組比較P0.05   腫瘤模型組小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能明顯低于正常組，用CTX治療的小鼠使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能進(jìn)一步降低。而提取物可明顯提高荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，具有劑量依賴性，其中高、中劑量組與正常組比較無明顯差異。   33  銀杏葉提取物對NK細(xì)胞活性的影響   結(jié)果見表3。 表3  銀杏葉提取物對NK細(xì)

14、胞活性的影響 注：與正常組比較，P005；與正常組比較，P0.05   腫瘤模型組與正常組比較有顯著性差異，低劑量的提取物能提高荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性，達(dá)到正常小鼠的水平，而中、高劑量的提取物降低NK細(xì)胞活性。   34  銀杏葉提取物對小鼠TNF活性的影響  結(jié)果見表4。 表4  銀杏葉提取物對小鼠TNF活性的影響注：與腫瘤模型組比較，P005；與正常組比較，P0.05   銀杏葉提取物低劑量組能提高荷瘤小鼠TNF活性，但不能達(dá)到正常組水平，中、高劑量組能提高到正常組水平，具有劑量依賴性。 &

15、#160; 35  銀杏葉提取物對小鼠脾細(xì)胞IL-2（誘生）水平的影響  結(jié)果見表5。表5  銀杏葉提取物對荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2  誘生水平的影響注：與腫瘤模型組比較，P005；與正常組比較，P0.05   銀杏葉提取物能顯著提高荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2誘生水平，其中高劑量組能提高到正常組的水平。   4  討論NK細(xì)胞不需預(yù)先致敏即能分泌細(xì)胞毒性因子殺傷腫瘤細(xì)胞，抗瘤譜廣，無腫瘤特異性和MHC限制性，也能釋放IFN-、IL-1、IL-2等細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，所以是機(jī)體抗腫瘤生長、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的天然

16、防御系統(tǒng)6，7。有研究表明8，隨著NK細(xì)胞活性的降低，腫瘤發(fā)生率有所增加，因此，測定機(jī)體的NK細(xì)胞活性及提高NK細(xì)胞活性，對于腫瘤的預(yù)防治療和預(yù)測都有重要價值。本實驗結(jié)果表明，低劑量組的NK細(xì)胞活性與腫瘤模型組比較具有很大的提高，與正常組比較無差異。TNF是由單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌的一種細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性。如能夠激活T細(xì)胞、刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、刺激單核細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子、促進(jìn)白細(xì)胞殺死微生物及殺滅腫瘤細(xì)胞等功能。其最大特點是能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而不影響正常細(xì)胞的生長、分化和代謝功能9。本實驗結(jié)果表明，腫瘤模型組的TNF活性較正常組明顯下降，而三個劑量組TNF活性與

17、腫瘤模型組比較具有很大的提高，與正常組比較無差異，然而，也有報道S180細(xì)胞的小鼠TNF活性非但沒有正常小鼠下降，而且有上升。至于二者矛盾之處，有待于進(jìn)一步研究。IL-2是由活化的輔助性T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞增殖因子，具有多種生物學(xué)活性。如能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖及維持T細(xì)胞體外長期生長、促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化和刺激NK細(xì)胞生長，在機(jī)體的免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)中起重要作用10。另有學(xué)者表明11，IL-2能促進(jìn)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF，從而增強(qiáng)抗腫瘤的作用。由于IL-2的含量與機(jī)體的免疫功能相關(guān)，尤其是與細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，因此可將IL-2的產(chǎn)生作為細(xì)胞免疫效應(yīng)的主要指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明，腫瘤模型組脾細(xì)胞的IL-

18、2誘生水平明顯低于正常組，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果相一致，而三個劑量組的IL-2誘生水平與腫瘤模型組比較可以明顯提高，且隨劑量增加而增加，直至達(dá)到正常組的水平。   5  小結(jié)以上結(jié)果表明，銀杏葉提取物可顯著提高荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能；低劑量可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性；可顯著增強(qiáng)TNF活性，且具有劑量依賴性；可顯著增強(qiáng)IL-2的誘生水平，且具有劑量依賴性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 王玲，李俊，李欣，等.枸杞多糖2對輻射損傷小鼠免疫功能恢復(fù)的影響.上海免疫學(xué)雜志，1995，15（4）:209-211.2 柳忠輝，呂昌龍.免疫學(xué)常用實驗技術(shù).北京：科學(xué)出版社，2002，109-113.3 曾波航，王光明，曾亞侖.純頂螺旋藻多糖對急性白血病