肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化模型的建立

1、肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化模型的建立 08-10-13 10:02:00 編輯：studa20 作者：趙清，李南，張雪梅，胥文春，朱興華，張群，尹一兵【摘要】 目的： 建立一種更加穩(wěn)定、高效的肺炎鏈球菌實驗室轉(zhuǎn)化模型，以便于對該菌的各種目的基因進行重組改造. 方法： 分別用改進方法和既往方法制備肺炎鏈球菌感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化外源DNA，獲取發(fā)生了轉(zhuǎn)化的菌株，通過抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR鑒定是否發(fā)生轉(zhuǎn)化；并計數(shù)抗生素篩選平板上的轉(zhuǎn)化菌落，比較兩者的轉(zhuǎn)化率，以確定更佳的轉(zhuǎn)化模型. 結(jié)果： 肺炎鏈球菌334菌株、31203菌株用改進方法的轉(zhuǎn)化率分別為（0.890.20），（0.710.10），高于既往方法的轉(zhuǎn)化率分

2、別為(6.21.4)10-3，(5.71.1)10-3 ，構(gòu)建了肺炎鏈球菌感受態(tài)缺陷菌株，建立了改進的肺炎鏈球菌實驗室轉(zhuǎn)化模型. 結(jié)論： 改進的轉(zhuǎn)化模型實現(xiàn)了穩(wěn)定的肺炎鏈球菌實驗室轉(zhuǎn)化，能方便研究者對該菌進行各種遺傳操作，為深入研究其致病的分子機制提供了一個技術(shù)平臺. 【關(guān)鍵詞】 肺炎鏈球菌；轉(zhuǎn)化，細菌；感受態(tài)【Abstract】 AIM: To establish a transformation model of Streptococcus pneumoniae(S.pn) in laboratory to promote the transformation efficiency and

3、 reconstruct its chromosome gene by improving the previous transformation method. METHODS: The competence cells of S.pn were prepared using both the previous and improved methods. After the exotic DNA was transformed under certain cell density, the transformed colonies on antibiotic plate, which was

4、 identified by growing in antibiotics culture and PCR, were counted to compare their transformation rate. RESULTS: The improved transformation model of S.pn in laboratory was established. The transformation rate of S.pn 334 was （0.890.20） and S.pn 31203 was （0.710.10） under the improved transformati

5、on model, which was relatively higher. Using this model, we constructed 4 S.pn competencedefective strains. CONCLUSION: In laboratory, the improved transformation model can raise the transformation rate of S.pn, which induces different S.pn into competence, and provides a research technology for fur

6、ther investigation on pneumococcal pathogenesis.【Keywords】 occus pneumoniae; transformation, bacterial; competence0 引言 轉(zhuǎn)化是指細菌在自然生長狀態(tài)下可自發(fā)形成感受態(tài)（特指細菌能夠攝取外來游離DNA的一種狀態(tài)），攝取外源性DNA，通過同源重組導致基因發(fā)生改變的過程. 通過轉(zhuǎn)化可以改造細菌基因，進行功能基因組研究，它是研究肺炎鏈球菌（S.pn）生物學功能的重要手段. 本課題組既往的S.pn實驗室轉(zhuǎn)化模型1有兩大弊端：一是轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定；二是感受態(tài)開放時間較短，不能滿足大規(guī)模轉(zhuǎn)化的需

7、要. 有研究2認為冷刺激可能會延長感受態(tài)開放時間，我們據(jù)此對既往轉(zhuǎn)化模型進行改良，即冷凍處理細胞后再做轉(zhuǎn)化，以期克服其弊端.1 材料和方法1.1 材料 S.pn血清4型標準菌株TIGR4(ATCCBAA334)，干粉（美國ATCC微生物菌種保存中心）；S.pn血清3型標準菌株CMCC(B)31203，干粉（中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保存中心）；S型S.pn(1和2號菌株)由中國醫(yī)科院提供；主要遺傳特征經(jīng)鑒定合格. C+Y培養(yǎng)基：含5 g/L Yeast提取物（Lacks and Hotchkiss, 1960）；TSA 血平板：含50 mL/L兔脫纖維全血. 感受態(tài)刺激因子（CSP2

8、）由挪威生命科學大學Havarstein LS教授惠贈；S.pn CP1250的染色體DNA（含有鏈霉素抗性基因str）由美國Morrison教授惠贈；S.pn 1d菌株的基因組DNA(含紅霉素抗性基因erm 的comE斷裂基因)由本課題組構(gòu)建3；DNA提取試劑盒（上海華舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）. 722分光光度儀（上海儀器分析三廠）；-80低溫冰箱（日本SANYO Medical freezer MDF330型）.1.2 方法1.2.1 S.pn的生長曲線繪制 挑取S.pn單個菌落接種于C+Y培養(yǎng)基，37培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接于20

9、 mL C+Y培養(yǎng)基中，于37水浴孵育，從1 h后開始在分光光度儀上測菌液A620 nm值，之后每隔1 h取樣1次. 以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細菌的生長曲線.1.2.2 改進的S.pn實驗室轉(zhuǎn)化模型的建立1.2.2.1 改進的S.pn實驗室轉(zhuǎn)化模型 取凍存于-80冰箱的S.pn菌株，培養(yǎng)于CTM培養(yǎng)基（含C+Y培養(yǎng)基，1 mmol/L CaCl2，0.1 g/L BSA）中，37水浴至A550 nm0.1左右時，將甘油加入上述菌液中，至其終濃度為100 mL/L，分裝后凍于-80，此即為S.pn感受態(tài)細胞；24 h后取出凍存菌液，在冰上融化，9000 g離心1 min，棄去上清液，加

10、入100 L C+Y培養(yǎng)基（pH8.0），使沉淀徹底懸浮，加入CSP20 g/L，同時加入S.pn CP1250的染色體DNA 100 g/L，于37孵育90 min，鋪于含200 mg/L鏈霉素的TSA血平板上，于37孵箱培養(yǎng)2448 h，即得到轉(zhuǎn)化菌落. 1.2.2.2 方法學比較 取凍存于-80冰箱的S.pn菌株，分別用上述改進方法和既往方法1制備S.pn感受態(tài)細胞，然后加入CSP2 20 g/L，并加入S.pn CP1250的染色體DNA100 g/L，于37孵育90 min，鋪于含200 mg/L鏈霉素的TSA血平板上，于37孵箱培養(yǎng)2448 h，計數(shù)抗生素血平板上的轉(zhuǎn)化菌落. 轉(zhuǎn)化

11、率=平板菌落數(shù)/細菌總數(shù)100%. 其中，細菌總數(shù)按A620 nm=0.6時， 細菌數(shù)為5 1011 cfuL計算.1.2.3 S.pn感受態(tài)缺陷菌株的制備及鑒定1.2.3.1 感受態(tài)缺陷菌株的制備 用上述改進的轉(zhuǎn)化方法制備S.pn感受態(tài)細胞，然后加入CSP2 20 g/L，及含comE斷裂基因的染色體DNA（即S.pn 1d菌株DNA）100 g/L，于37孵育90 min，鋪于含0.25 mg/L紅霉素的TSA血平板上，于37孵箱培養(yǎng)2448 h，挑取平板上的轉(zhuǎn)化菌落，接種于含0.25 mg/L紅霉素的C+Y培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)增菌，當菌密度為A620 nm=0.2左右時，凍于80冰箱保存，即得到缺陷菌.1.2.3.2 感受態(tài)缺陷菌株的鑒定 鑒定1：將野生菌和缺陷菌同時做轉(zhuǎn)化，選用CP1250的DNA為外源基因. 鑒定2：提取野生菌和缺陷菌的染色體DNA，用comE（5TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3，5ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3）和erm（5CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3， 5AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3）的引物4做PCR.