金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究

1、金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究                 任少華1， 胡定國2， 馬鳳森2 【摘要】 目的 觀察金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的作用。方法 對含有SEC的思復(fù)勝注射液進(jìn)行動物體內(nèi)提升白細(xì)胞、體外增殖淋巴細(xì)胞實驗以及對少量腫瘤患者的臨床應(yīng)用研究。結(jié)果 采用含4ng/ml以上SEC思復(fù)勝注射液，均可刺激小鼠體內(nèi)白細(xì)胞的顯著升高（P0.01）。5ng/ml劑量，可促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞及

2、人外周血淋巴細(xì)胞的高度增殖。其效果較ConA（陽性對照）更好。人體應(yīng)用試驗證明：含SEC 12ng/ml的思復(fù)勝注射液每日注射2ml，30天內(nèi)可避免使放、化療腫瘤患者外周血白細(xì)胞降低，且有一定程度的升高，與放化療前相比，統(tǒng)計學(xué)上差異無顯著性，而與未注射思復(fù)勝注射液的放、化療對照組相比，其外周血白細(xì)胞減少差異有顯著性（P0.05）。含SEC的思復(fù)勝注射液可提升零星在家正在進(jìn)行放、化療腫瘤患者外周血白細(xì)胞數(shù)量，與已在放、化療時白細(xì)胞數(shù)相比，其升高有顯著（P0.05）或非常顯著（P0.01）的差異。結(jié)論 含SEC的思復(fù)勝注射液對癌癥放、化療患者白細(xì)胞降低具有顯著的保護作用?！娟P(guān)鍵詞】 含SEC的思復(fù)

3、勝注射液；提升白細(xì)胞；增殖淋巴細(xì)胞；腫瘤放、化療Studies of experimential and application for Staphylococcus aureus cultures filtrate products（Si Fu Sheng）in promoting提金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究 leukocytesREN Shao-hua，HU Ding-guo，MA Feng-sen.Lishui Central Hospital，Lishui 323000，China【Abstract】 Objective The test for pro

4、moting of leucocytes on mouse in vivo and proliferating of lymphocytes on human and mouse in vitro and clinic applied on some cancer disease for si fu sheng products of contain SEC.Methods There are some evidences that they can stimulate mouse in vivo leucocytes increasing remarkably.（P<0.01）by u

5、sed si fu sheng at a dose of 4ng/ml（SEC） or more injection，while it deeply stimulating mouse spleen cells or human peripheral blood lymphocytes proliferation and differentiation by used a close of >5ng/ml（SEC） injection.Results The effects are better than ConA（positive control）.Clinic trials show

6、s that they can hold back decrease of peripheral blood leucocytes of 31cases patients suffered from cancer after radiotherapy or chemotherapy，further more there are some increasing instead by injected si fu sheng 2ml/day with a dose of 12ng/ml （SEC）. There are no statistical differences （P>0.05）

7、compared with patients before radiotherapy or chemotherapy，but there are remarkable differences（P<0.05） between using and no using si fu sheng （31 cases patients） on peripheral blood leucocytes decrease.Peripheral blood leucocytes number will step up to a remarkable（P<0.05）or highly remarkable

8、 （P<0.01）difference，for 12 cases piecemeal cancer patients with radiotherapy or chemotherapy takes si fu sheng 2ml/day injection compared with no using before.Conclusion These studies manifest si fu sheng injection can pull leucopenia of a cancer patients with radiotherapy or chemotherapy up obvi

9、ously.【Key words】 si fu sheng injection contain SEC; promoting leucocytes;proliferating lymphocytes; radiotherapy and chemotherapy of cancer.金黃色葡萄球菌濾液制劑是一種含有葡萄球菌腸毒素（SEC）的生物制品，而SEC又是一種外源性超級抗原（SAg）14僅需微量（納克劑量ng）即可高效地刺激T細(xì)胞增殖。并促使機體釋放多種細(xì)胞因子和產(chǎn)生細(xì)胞毒的作用58。體外細(xì)胞水平和動物體內(nèi)水平的研究結(jié)果表明，作為SAg的SEC能夠生產(chǎn)強大的殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞效應(yīng)911，故

10、是一種很有潛能的新型腫瘤免疫治療劑，并展示了良好的應(yīng)用前景。曾已發(fā)現(xiàn)SAg的適當(dāng)濃度還能對小鼠脾臟細(xì)胞及人外周血白細(xì)胞的激活使之增殖的作用12，13。近年，因各種因素或腫瘤患者在進(jìn)行放、化療過程中，外周血白細(xì)胞大量被殺傷，致使體內(nèi)白細(xì)胞高度減少，并可出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，而含SEC的思復(fù)勝注射液卻可增高各種原因引起的外周白細(xì)胞減少及緩解腫瘤患者因放、化療引起的不良反應(yīng)。筆者對此進(jìn)行了實驗研究，并對少數(shù)量的放、化療腫瘤患者進(jìn)行了臨床試驗治療觀察，獲得了很有意義的結(jié)果，現(xiàn)將研究觀察結(jié)果總結(jié)報告如下。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌濾液制劑思復(fù)勝生產(chǎn)用菌株STMX91096，

11、系凍干保存菌種。1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基采用優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)瓊脂平板和血平板，復(fù)壯培養(yǎng)基采用含人血 白蛋白、黏液素肉湯。種子和生產(chǎn)培養(yǎng)基采用豬心浸汁蛋白胨氯化鈉培養(yǎng)基14。1.1.3 SEC的檢測試劑 反向被動血凝試劑及SEC標(biāo)準(zhǔn)品購自北京中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病微生物研究所，批號020211。1.1.4 實驗動物 昆明種小白鼠，購自浙江省醫(yī)科院動物中心。1.2 方法1.2.1 金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）原液制備 按金黃色葡萄球菌濾液制劑全套方法制備14。所得過濾除菌液即為原液。1.2.2 思復(fù)勝原液中SEC含量測定 采用RPHA微量法測定原液中SEC滴度，同時與已標(biāo)化的SEC標(biāo)

12、準(zhǔn)品檢測比較，以同批血凝試劑檢測標(biāo)準(zhǔn)品（SEC）的敏感度（即ng/ml）乘于被檢品的血凝滴度。即為被檢原液中SEC實際含量（ng/ml）。例如用RPHA檢測標(biāo)準(zhǔn)品敏感度為3.125ng/ml，而被檢原液的血凝滴度為1:32，則原液中SEC含量為32×3.125=100ng/ml。1.2.3 試驗用制劑的劑型制備 注射用針劑思復(fù)勝的配制：取注射用水配成氯化鈉溶液，按所需SEC含量配制成不同SEC濃度的試驗用稀釋藥液，灌封于50ml滅菌瓶中供試驗用。人體試驗用思復(fù)勝注射液，用注射用水配成pH6.7的氯化鈉溶液，將原液按12ng/ml SEC稀釋成半成品，再經(jīng)過濾，按每安瓿2ml灌封，即為

13、成品，再取樣進(jìn)行質(zhì)量檢查，合格者供人體試驗用。1.2.4 動物體內(nèi)升白實驗方法（1）實驗動物：系采昆明種小鼠，體重20g左右，雌雄各半，隨機分組，每組10只。（2）實驗方法：每次實驗設(shè)正常對照組（NS）、環(huán)磷酰胺模型組（CTX）及給藥組（不同濃度藥液）。正常對照組連續(xù)5天腹腔注射NS。每天1次，每次每只0.2ml；CTX模型組，連續(xù)5天腹腔注射NS，每天1次，每次每只0.2ml；給藥組連續(xù)5天腹腔注射被試藥液，每天1次，每次每只0.2ml。至第3、4、5天，除正常對照組外。CTX模型組和給藥組均加注CTX（1mg/ml），每天1次，每次每只0.2ml，末次注射后1h，取小鼠眼眶血20l，用白細(xì)

14、胞計數(shù)稀釋液定量稀釋后在計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)各小鼠白細(xì)胞數(shù)，用t檢驗分析每組小鼠白細(xì)胞數(shù)，并與CTX模型組比較計算P值。1.2.5 動物脾臟淋巴細(xì)胞及人外周血淋巴細(xì)胞增殖實驗參照15，16MTT比色法進(jìn)行。1.2.6 思復(fù)勝注射液對腫瘤放、化療患者的臨床試驗觀察方法 系由麗水市中心醫(yī)院呼吸科及普外科進(jìn)行。所有病例均為術(shù)后或已喪失手術(shù)機會即將進(jìn)行放、化療的惡性腫瘤患者，無放、化療禁忌證，共62例。男35例，女27例，年齡1977歲。隨機分試驗組 ( 金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究(3) 和對照組，每組31例。（1）試驗組（放、化療聯(lián)合思復(fù)勝組）：在接受放、化療同時，應(yīng)

15、用思復(fù)勝肌肉注射，每天1次2ml，連續(xù)30天為1個療程。（2）對照組（單純放、化療組）：按常規(guī)應(yīng)用放、化療，不用任何藥物作輔助治療。療程與試驗組同。（3）所有患者放、化療前檢查外周血白細(xì)      胞數(shù)及其他指標(biāo)，放、化療過程中每周復(fù)查白細(xì)胞，至第4周再檢查1次，并對所有的白細(xì)胞數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)處理。2 結(jié)果2.1 含不同量SEC的思復(fù)勝注射液在小鼠體內(nèi)升白的比較實驗使用不同含量SEC（2、4、8、10、15、20ng/ml）思復(fù)勝注射液分2次6組進(jìn)行了小鼠體內(nèi)增白實驗，每組各10只小鼠。每次同時作正常對照組（NS）和CTX模型組對比實驗。結(jié)果見表1、表2。

16、從表1、表2可見，當(dāng)藥液中SEC含量大于4ng/ml時（包括4ng/ml），對小鼠均有顯著或非常顯著的提升白細(xì)胞的效果。而4ng/ml，如3ng/ml則未能顯現(xiàn)升白作用。2.2 思復(fù)勝注射液對小鼠脾臟細(xì)胞的增殖實驗 以拉頸處死昆明種小鼠，剖腹用無菌操作取出小鼠脾臟，鑷碎、研磨和洗滌后，用RPMI1640培養(yǎng)基將其調(diào)正至1×106/ml脾臟細(xì)胞懸液。在96孔滅菌細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行實驗，每孔均加脾臟細(xì)胞懸液100l；陽性對照6孔每孔加ConA 100l（濃度為10g/ml）。試驗分3組，每組6孔加不同濃度含SEC藥液（5、10、20 ng/ml）100l，混勻后封板置37，5%CO2培養(yǎng)箱

17、內(nèi)培養(yǎng)70h，再對所有孔加50l MTT溶液，續(xù)培養(yǎng)4h，用比色機測每組每孔OD570mn值，并計算6孔均值。試驗結(jié)果見表3?？梢娝紡?fù)勝注射液中SEC 5ng/ml或以上濃度，即能促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞增殖，其增殖效果與ConA（陽性對照）相當(dāng)或更高。2.3 思復(fù)勝注射液對人外周血淋巴細(xì)胞的增殖實驗 取肝素抗凝正常人外周血，以Ficoll分層溶液和密度梯度離心法制備人外周血淋巴細(xì)胞懸液，并調(diào)正至1×106/ml，按上述同樣方法進(jìn)行人外周血淋巴細(xì)胞增殖實驗，結(jié)果見表4。從表4結(jié)果可見，思復(fù)勝注射液中SEC 5ng/ml以上對人外周血淋巴細(xì)胞同樣具有促進(jìn)其顯著增殖的效果。2.4 思復(fù)勝注射液對

18、腫瘤放、化金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究(4) 歡迎您訪問范.文,之.家療患者的臨床試驗觀察2.4.1 含SEC思復(fù)勝注射針劑的臨床試驗觀察 使用含SEC的思復(fù)勝針劑（12ng/ml）對31例試驗組（放、化療聯(lián)合應(yīng)用思復(fù)勝針劑注射）和31例對照組（單純放、化療）患者進(jìn)行試驗，放、化療前及放、化療后14周，每周取末梢血作白細(xì)胞計數(shù)。觀察兩組患者外周血白細(xì)胞的變化情況，并作統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果見表5。              

19、0;               從表6可見，正在進(jìn)行放化療患者白細(xì)胞高度降低，當(dāng)用思復(fù)勝輔助治療后，12例患者外周白細(xì)胞都有顯著升高，且差異均有顯著性或非常顯著性。3 討論因某些環(huán)境因素的影響或腫瘤患者手術(shù)后在進(jìn)行放、化療過程中，可使機體內(nèi)白細(xì)胞被殺傷，從而導(dǎo)致血液中白細(xì)胞高度減少，并可呈現(xiàn)各種疾病或出現(xiàn)不良反應(yīng)。一般均用升白藥物進(jìn)行治療，可使外周血白細(xì)胞有一定程度升高。但目前所用升白藥物其升白作用并不持久，一般于24h后逐漸降低。而作為SAg的SEC可通過特異性

20、抗原的模擬性識別而產(chǎn)生強大的T細(xì)胞刺激作用。由于抗原識別功能的相似性及T細(xì)胞的多克隆化17。因此，作為SAg的共同特點具有超常的效應(yīng)作用，其最大效應(yīng)出現(xiàn)在注射后的24h，并能持續(xù)48或72h，才逐漸下降，這就顯示出含SEC的思復(fù)勝注射液刺激增白作用要比目前一些沿用制劑更有其優(yōu)越性18。業(yè)已證明，SAg刺激T細(xì)胞增殖，其劑量在110ng/ml時，即可誘導(dǎo)出最大應(yīng)答。而10pg/ml就可誘導(dǎo)測出的增殖反應(yīng)。因此，SEC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力要比ConA要好。 腫瘤患者由于自身疾病的影響以及手術(shù)后的創(chuàng)傷，本身免疫力就很低下，特別在進(jìn)行放、化療時，可導(dǎo)致白細(xì)胞高度減少，這是由于疾病的損害、治療的創(chuàng)傷、治

21、療后副作用，更使免疫功能降低，抑制骨髓功能，嚴(yán)重影響了患者的生存率和生存質(zhì)量。而SEC作為一種免疫激活劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑及腫瘤生物治療劑，它不僅能提高機體的總體免疫水平，還能殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，修復(fù)損傷組織和細(xì)胞。因此，從我們的試驗中已經(jīng)證明：含4ng/ml以上SEC制劑，可促進(jìn)小鼠體內(nèi)白細(xì)胞的顯著升高；而5ng/ml以上可使小鼠脾臟細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞增殖。再從臨床患者在放、化療過程中，使用含SEC的思復(fù)勝制劑，不論是住院治療患者或零星在家治療的癌癥患者，均已顯示出可使被應(yīng)用者外周血白細(xì)胞顯著升高，免疫功能增強，這就可以防止放、化療過程中對機體免疫功能的損傷而出現(xiàn)的一系列反應(yīng)。此對腫瘤患者

22、在進(jìn)行放、化療過程中免遭白細(xì)胞減少而出現(xiàn)多種反應(yīng)的防治是有現(xiàn)實意義的。在對升高白細(xì)胞分類試驗中筆者還發(fā)現(xiàn)，用思復(fù)勝制劑導(dǎo)致白細(xì)胞升高，不僅僅是淋巴細(xì)胞，而對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞也有同比例上升現(xiàn)象。因此，筆者認(rèn)為思復(fù)勝制劑不僅僅能使用于因腫瘤患者放、化療期間對機體免疫系統(tǒng)的保護，也可用于那些因環(huán)境因素作用或其他免疫功能低下人群所引起白細(xì)胞減少提金黃色葡萄球菌濾液制劑（思復(fù)勝）提升白細(xì)胞的實驗與應(yīng)用研究(5) 的一系列疾病的防治。1 Whit J，Herman A，Pullen AM，et al. V-specific superantigen staphylococcal enterotoxin

23、 B:stimulation of mature T-cell and clonal deletion in neonatal mice. Cell，1989，56:27-35.2 Kappler JW，Kotzin B，Herron L，et al. V-specific stimulation of human T-cell by staphylococcal toxins . Science，1989，244:811-813.3 Marrack P，Kappler J. The staphylococcal enterotoxin and relatives . Science，1990

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