高通量懸浮芯片技術(shù)檢測多農(nóng)獸藥殘留

1、高通量懸浮芯片技術(shù)檢測多農(nóng)獸藥殘留    It is right to put everything in its proper use.  Wine and judgement mature with age.              作者：劉楠  蘇璞  朱茂祥  楊陟華  潘秀頡  王紅勇  

2、;晁福寰  高志賢Take a pain for a pleasure all wise men can.  【摘要】  建立了一種同時(shí)可檢測多農(nóng)獸藥殘留的高通量懸浮芯片技術(shù)。以常用的7種農(nóng)獸藥為待測靶標(biāo)物，通過優(yōu)化條件，使抗原抗體基本完全反應(yīng)，操作簡便快捷，最多可同時(shí)檢出7種農(nóng)獸藥殘留靶標(biāo)物;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高通量懸浮芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程和相應(yīng)的決定系數(shù)R2表現(xiàn)良好;在對(duì)含有多種農(nóng)獸藥殘留的不同盲樣的檢測中，檢測濃度值與實(shí)際濃度的相對(duì)偏差較小。高通量懸浮芯片技術(shù)為多農(nóng)獸藥殘留的快速檢測提供了新方法，此系統(tǒng)可用于多農(nóng)獸藥殘留實(shí)際樣品的初步檢測

3、，整個(gè)檢測過程僅耗時(shí)12 h，基本上滿足了多農(nóng)獸藥殘留檢測的靈敏、特異、快速和高效的需求，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。 First try, and then trust.  【關(guān)鍵詞】  懸浮芯片; 高通量; 微球; 殘留; 中位熒光強(qiáng)度值1 引 言食品安全已成為社會(huì)共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題1()。其中，環(huán)境和食品中農(nóng)獸藥殘留已引起廣泛關(guān)注，農(nóng)獸藥殘留量已成為重要的檢測指標(biāo)。因此，研究食品中微痕量農(nóng)獸藥殘留的快速分析及殘留監(jiān)控的方法具有重要意義。阿特拉津(Atrazine, A

4、r)、克倫特羅(Clenbuterol, CL)和氯霉素(Chloramphenicol, CAP)等農(nóng)獸藥殘留多采用色譜法2,3、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法4,5和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 6,7測定。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和色譜法雖然靈敏度高，但實(shí)驗(yàn)室條件要求高，檢測方法復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高;ELISA法每次只能檢測一種靶標(biāo)物，不能滿足對(duì)多農(nóng)獸藥殘留的高通量多元分析要求。因此，建立一種靈敏、快速、高通量的檢測技術(shù)勢在必行。懸浮芯片技術(shù)是美國Luminex公司開發(fā)的一種多功能的液相芯片分析平臺(tái)，具有操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn);與固相芯片相比，液相芯片具有靈活性更好，可

5、以根據(jù)需要調(diào)節(jié)每次檢測所需要的微球的數(shù)量和調(diào)整檢測體系的設(shè)計(jì)8。目前，對(duì)該技術(shù)的研究集中于檢測大分子蛋白質(zhì)和核酸 9,10，本研究組曾采用懸浮芯片結(jié)合酶免疫法檢測了3種獸藥殘留11(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。本研究以常用的4種獸藥(氯霉素、克倫特羅、雌二醇和泰樂菌素)和3種農(nóng)藥(阿特拉津、吡蟲啉和甲萘威)共為靶標(biāo)物，基于間接競爭法的免疫學(xué)檢測原理，改進(jìn)了常規(guī)懸浮芯片技術(shù)在微球上固定抗體的方法，根據(jù)待測靶標(biāo)物靈活自由組合，可同時(shí)檢出7種農(nóng)獸藥殘留靶標(biāo)物;本方法簡便、快捷，降低了實(shí)驗(yàn)成本，結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。Every man has his hobby-horse.&

6、#160; 2 實(shí)驗(yàn)部分It is a small flock that has not a black.  2.1 儀器與試劑BioPlexTM懸浮系統(tǒng) (美國BioRad公司); 6930型冷凍離心機(jī) (日本KUBOTA公司); MS3Digital型旋渦混勻器 (德國IKA公司); Costar96孔酶標(biāo)板 (美國Corning公司)。實(shí)驗(yàn)室偶聯(lián)有7種農(nóng)獸藥蛋白結(jié)合物的不同編碼的羧基熒光檢測微球11;蛋白氨基偶聯(lián)試劑盒(美國BioRad公司)，內(nèi)含激活緩沖液(Activation 

7、;Buffer);Ar、CAP、CL、吡蟲啉(Imidacloprid, Im)、甲萘威(Carbaryl, Cbl)、雌二醇(17estradiol, E2)和泰樂菌素(Tylosin, Tyl) 均購于美國Sigma公司;鏈霉親和素藻紅蛋白(Strepavidinphycoerythrin, SAPE，美國Invitrogen公司);牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, 德國Roche公司);CAP單抗(CAPmAb)和E2單抗(E2mAb)購自美國Biodes

8、ign公司;CL單抗(CLmAb，英國Abcam公司);Ar單抗(ArmAb)和Im單抗(ImmAb)購自北京萬華普曼生物工程有限公司;Tyl單抗(北京望爾生物工程有限公司);Cbl多隆抗體(CblpAb, 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)許艇惠贈(zèng))。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 懸浮芯片反應(yīng)抗體加入量的優(yōu)化和篩選 7種抗體各分別分為5個(gè)梯度加入，分別取出7種偶聯(lián)過獸藥結(jié)合物的微球2000個(gè)，每個(gè)梯度做3個(gè)平行樣，根據(jù)檢測所獲得的中位熒光強(qiáng)度值 (Median fluorescent intensity, MFI

9、)來確定最佳抗體加入量。以進(jìn)入平臺(tái)期拐點(diǎn)的抗體加入量為最適特異性生物素化抗體加入量。Everybody's business is nobody's business.  2.2.2 農(nóng)獸藥殘留多元分析的懸浮芯片標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 在96孔酶標(biāo)反應(yīng)板的各孔中分別加入優(yōu)化后的7種農(nóng)獸藥靶標(biāo)物對(duì)應(yīng)的生物素化單抗，分別將這7種農(nóng)獸藥標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋加入。將微球等比例混合，每孔加入14000個(gè)(2000/種beads，共7種)，每孔用PBS緩沖液補(bǔ)足至50 L，同時(shí)準(zhǔn)備一個(gè)不加任何標(biāo)準(zhǔn)品的陽性對(duì)照孔。37 中速漩渦振蕩1 h，使微球上

10、的靶標(biāo)農(nóng)獸藥蛋白結(jié)合物與溶液中相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品共同競爭生物素化單抗，然后每孔加適量SAPE，37 中速振蕩30 min。懸浮芯片系統(tǒng)進(jìn)行檢測，獲得MFI。以各種靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以檢測得到的MFI為縱坐標(biāo)，得7種農(nóng)獸藥的懸浮芯片高通量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 結(jié)果與討論3.1 農(nóng)獸藥最適生物素化抗體加入量的優(yōu)化 圖1 7種生物素化農(nóng)獸藥抗體加入量和MFI的關(guān)系A(chǔ) man cannot whistle and drink at he same time.  Fig.1 Relationship between&

11、#160;volumes of the seven biotinylated antibodies and median fluorescence intensity(MFI)7種農(nóng)獸藥生物素化抗體在不同加入量時(shí)所獲得的MFI如圖1所示。實(shí)驗(yàn)表明，MFI值起初隨抗體加入量增加而增大，到某一個(gè)拐點(diǎn)處進(jìn)入緩慢增大或平臺(tái)期; 繼續(xù)增大抗體加入量并未明顯地使MFI增大。該7個(gè)拐點(diǎn)的抗體加入量可被認(rèn)為是最適加入量(每2000個(gè)反應(yīng)微球)。曲線到拐點(diǎn)處變化趨緩，這是由于微球上的抗原逐漸與溶液中的特異性抗體反

12、應(yīng)直至達(dá)到飽和。Politeness costs nothing and gains everything.  由于Cbl所用的抗體為多克隆抗體，抗體加入量較多，直到加入200 ng才達(dá)到較為理想的結(jié)果。為節(jié)省抗體，本實(shí)驗(yàn)抗體加入量選定為200 ng。表1 各種農(nóng)獸藥分析物優(yōu)化后的懸浮芯片反應(yīng)條件 論文教育信息網(wǎng)  1 h for AgAb reaction and 0.5 h for SAPE reaction * 

13、;SAPE稀釋度(Dilution ratio): 1100; 激活緩沖液(Activation buffer): 0.1 mol/L PBS, pH 7.4。 抗體最適加入量和其它反應(yīng)條件(SAPE稀釋度、激活緩沖液、溫度和懸浮芯片抗原抗體反應(yīng)時(shí)間)如表1所示。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，克服了常規(guī)懸浮芯片技術(shù)步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長的不足，基本達(dá)到抗原抗體的完全反應(yīng)。操作簡便快捷，無需常規(guī)Luminex實(shí)驗(yàn)所必需的昂貴的濾膜板和抽濾泵，采用普通96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或酶標(biāo)板即可，也無需進(jìn)行反復(fù)多次的抽濾步驟13

14、，14。3.2 懸浮芯片法同時(shí)檢測7種農(nóng)獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定The peacock has fair feathers, but foul.  7種農(nóng)獸藥標(biāo)準(zhǔn)品依優(yōu)化好的濃度梯度，按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。由圖2可見，7種農(nóng)獸藥的微球探針都可被懸浮芯片儀準(zhǔn)確識(shí)別。Money is a bottomless sea, in which honour, conscience, and truth may be drowned.  圖2 7種農(nóng)獸藥的懸浮芯片檢測的微球分布圖Fig.2 Beads map of su

15、spension array detection for seven pesticides and veterinary drugs通過間接競爭法，獲得多元分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖3)和檢測區(qū)間如表2所示。在檢測范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到良好的響應(yīng)， R2>0.99。 圖3 懸浮芯片系統(tǒng)檢測7種農(nóng)獸藥的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線Fig.3 Standard regression equations for the detection

16、60;of seven pesticides and veterinary drugs目前無檢測E2的國標(biāo)，但在實(shí)際應(yīng)用中該檢測范圍和檢出限可滿足日常農(nóng)獸藥殘留檢測需要，亦可用于對(duì)E2的臨床檢測，但需對(duì)血清進(jìn)行必要的前處理15。文獻(xiàn)11,15已證實(shí)，懸浮芯片對(duì)多農(nóng)獸藥殘留檢測的特異度良好。The peacock has fair feathers, but foul.  3.3 實(shí)際樣品的檢測在23種獸藥盲樣檢測的基礎(chǔ)上11，1517，進(jìn)行了6種農(nóng)獸藥盲樣的檢測實(shí)驗(yàn)(表3)。實(shí)現(xiàn)了6種農(nóng)獸藥的懸浮芯片高通量多元分析，整個(gè)檢測

17、過程僅需12 h，在多種農(nóng)獸藥殘留的混合檢測中，獲得了有效的MFI，除了Cbl的檢測結(jié)果與實(shí)際濃度偏差較大(25.12%)外，其它各種農(nóng)獸藥檢測的偏差在0.75%17.38%之間，與3種獸藥盲樣的高通量懸浮芯片檢測的相對(duì)誤差相當(dāng)17。由于Cbl使用的表2 7種農(nóng)獸藥高通量懸浮芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程R2=0.99202.0400是多抗，雖然純化過，但抗體的非特異性吸附和微球間交聯(lián)較其他農(nóng)獸藥單抗嚴(yán)重，使得檢測所得結(jié)果較其他各種靶標(biāo)物偏差較大，如果用Cbl的單克隆抗體可有效解決此問題。表3 混合盲樣中6種農(nóng)獸藥殘留的檢測結(jié)果表4 7種農(nóng)獸藥低殘留混合盲樣的

18、檢測結(jié)果 農(nóng)獸藥多殘留7通道的盲樣檢測結(jié)果見表4。檢出濃度與實(shí)際濃度的偏差在2.3%27.8%之間，只有Cbl和Tyl的略大?？傮w而言，7通道懸浮芯片法檢測的準(zhǔn)確性和對(duì)不同濃度小分子物質(zhì)的抗干擾能力較強(qiáng)，偏差相對(duì)較小。目前，7通道農(nóng)獸藥殘留的檢測已是現(xiàn)有技術(shù)的極限，可初步證明該技術(shù)可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測?？梢?，懸浮芯片法在對(duì)多種農(nóng)獸藥殘留的高通量檢測分析中有明顯優(yōu)勢，檢測僅需12 h。You never know what you can do till you.  對(duì)多種農(nóng)獸藥同時(shí)檢測的高通量懸浮芯片實(shí)驗(yàn)證實(shí)了根據(jù)檢測靶標(biāo)物自由搭配、靈活多變的組合方式的可行性。在

19、這7種靶標(biāo)物的檢測范圍內(nèi)，根據(jù)所要檢或可疑的多種待測物，任意組合和搭配，形成不同的檢測試劑盒。這種優(yōu)勢也為今后檢測試劑盒的產(chǎn)業(yè)化和商品化提供了可能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 WU YongNing (吳永寧), CHEN JunShi (陳君石). Chinese J. Preventive Medicine(中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志), 2007, 41(6): 4354372 Ding S Y, Shen 

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