第五章酶與細胞固定化技術(shù)

1、第五章酶與細胞的固定化技術(shù)教學目的：使學生了解并掌握固左化酶（細胞、原生質(zhì)體）的概念及意義，掌握酶的常用固 定化技術(shù)，了解固定化爾的性質(zhì)。教學重點、難點：固肚化酶（細胞、原生質(zhì)體）的疇，種固泄化技術(shù)。固左化酶（細胞、 原生質(zhì)體）的疇，半透膜包埋法。教學方法：講授教學手段：多媒體第一節(jié)概述一、游離酶使用中的局限性：1. 提取純化繁瑣，價格昂貴2難以重復使用3. 穩(wěn)定性差二、固建化酶研究克服游離酶缺點的方法之一50年代開始60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展1969年，千田一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應用固左化氨基?；笍腄L-AA連續(xù)生產(chǎn)L-AA實現(xiàn) 酶應用史上的一大變革三、基本概念1、固左化酶（1971

2、第一次國際酶工程學術(shù)會議）（Immobilized Enzyme）指在一泄空間圉呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進行反應，反應后的酶可以回收重復 利用。包括酶與不溶性載體結(jié)合的“固相酶"“水不溶性酶“及包埋在凝膠或超濾裝苣中 的酶。2、固定化細胞（原生質(zhì)體）指被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等因素約束或限制在一左空間用，但 細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續(xù)使用的活力。四、固定化酶優(yōu)點增加了酶的穩(wěn)左性能降低酶的總體費用酶的分離和回收變得容易，并可重復使用使反應過程的連續(xù)操作成為可能反應產(chǎn)物也易于提取純化有利于過程設計和優(yōu)化拓廣了酶的應用用（多酶系統(tǒng)的酶反應，非水相酶反應，生物

3、傳感器探頭等）第二節(jié)、酶的固定化方法一、酶的固泄化方法1、酶的固泄化方法（四大類方法）1）吸附法2）包埋法3）交聯(lián)法4）化學共價法英它（酶的逆膠朿包囊法）一、酶的固定化方法2、選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)載體的來源、價格、機械性能、載體的功能基團和交聯(lián)度等制備方法簡便易行3-衡量依據(jù):（D測泄固泄化酶的活力，以確泄固泄化過程的活力回收率： 研究它的最適反應條件（底物濃度、pH值、溫度、離子強度等）；穩(wěn)宦性和不穩(wěn)定原因的探究：對酶進行人工修飾，使其與載體的結(jié)合達到較為理想的構(gòu)型和相容性。（-）吸附法1、原理：主要是利用細胞與載體之間的吸引力（徳華力、離子鍵和氫鍵），使細胞固定在 載體上，常用的吸

4、附劑有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纖維等。此外還可利用專一的親和力來固泄細胞，例如伴刀豆球蛋白A與a 甘露聚糖具有親和 力，而釀酒酵母細胞壁上含有a甘露聚糖，故可將伴刀豆球蛋白A先連接到載體上，然后 把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或結(jié)合在菌體（死細胞）及細胞碎片上的酶或酶系。3、優(yōu)缺點：操作簡便，條件溫和，不會引起爾的變性失活，載體廉價易得，且可反復利用；缺點是蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合相當弱，而且很多情況下,酶的非特異性吸附常常會引 起部分或全部失活，高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附因此當要求酶 的固定絕對牢靠時,采用吸附法是很不可靠的.4、常用吸附劑各種礦物

5、質(zhì)以及無機載體（氧化鋁，氧化鐵，氧化鈦，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，疑 基磷灰石等），及天然高分子載體淀粉、白蛋白等，最常用的吸附劑是離子交換劑竣甲 基纖維素，DEAE-纖維素、DEAE-匍萄糖，合成的陰離子和陽離子交換劑離子交 換劑主要靠靜電吸引，缺點是當離子強度增加或介質(zhì)的pH、溫度變化時，這種結(jié)合發(fā) 生分解。5、舉例：將伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B 50ml （在 10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,lmM CaCl2和mM MnCh）與酶液（lOmg/ml） 5ml4°C,攪勻過夜，便成瓊脂糖復合物，ffllOmMNaAc pH4.5 （lmMCaC12和lm

6、MnCb）充分洗滌，直至測不出活性為度，最后再懸浮于10ml NaAc PBS 中備用。（二）包埋法1、概念：指將酶或含酶菌體包埋在各種多空載體中，使酶固左的方法。可分為凝膠包埋法（網(wǎng)格型）和半透膜包埋法（微囊型）兩種。2、優(yōu)缺點：一般不需酶的AA殘基進行結(jié)合反應，很少改變酶的髙級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高：缺點是包埋時發(fā)生化學聚合反應，酶易失活，須巧妙設計反應條件。另外網(wǎng)格結(jié)構(gòu)影 響底物和產(chǎn)物的擴散，有時，這種擴散會導致酶動力學行為的改變，所以此法只適合 于小分子底物和產(chǎn)物的酶。3、海藻酸鹽包埋法海藻酸鈉與Ca2Mg2+,AP+多價離子間的轉(zhuǎn)移凝膠作用形成固泄化細胞顆粒缺點：在髙濃度電介質(zhì)（K+.N

7、a+）溶液中，固定化顆粒變得不穩(wěn)泄.02+等多價離子在磷酸緩沖溶液中易形成沉淀個定化顆粒溶解優(yōu)點：海藻酸鹽價格便宜包埋條件溫和4、角叉菜糖包埋法K-角叉菜是一種含有許多硫酸根基團的多糖化合物在K+離子存在下，它能立即 生成凝膠.缺點：對高濃度的Na+離子敏感固泄化溫度高，需要在37°C55°C5、聚丙烯酰胺凝膠在含酶（或細胞）的水溶液中，加入一泄比例的單體丙烯酰胺和膠聯(lián)劑N,Ni甲撐 雙丙烯酰胺然后在催化劑（二甲氨基丙臘）和引發(fā)劑（過硫酸鉀）的作用下低溫（冰浴）聚 合，形成凝膠缺點：丙烯酰胺對酶具有變性作用6、聚乙烯醇（PVA）包埋法磷酸鹽硬化法，循環(huán)冷凍法，硼酸硬化法硼酸

8、硬化法：將聚乙烯醇在7（rc8（rc進行水浴加熱至完全溶解，然后冷卻至35°C,與酶溶液 （細胞懸浮液）混勻，滴加到飽和硼酸溶液中優(yōu)點:原材料價格便宜條件溫和無毒害作用循環(huán)冷凍法硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1界而沉淀法利用某些髙聚物在水相和有機相的界而上溶解度極低而形成被膜將酶包埋。操作：酶液在油溶性表而活性劑存在下在水不互溶的有機相中乳化形成油包水的微滴，再將 溶于有機溶劑的高聚物加入乳化液中，然后加入一種不溶解髙聚物的有機溶劑，使高 聚物在油-水界而上沉淀析出，形成膜將酶包埋，最后在乳化劑幫助下由有機相移入水 相。7、半透膜包埋法7.2界而聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面

9、發(fā)生聚合的原理包埋酶。例：將含10%血紅蛋白的酶液與1, 6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盤-85的氯仿-環(huán)己 烷中分散乳化，再加入溶于有機相的葵二酰氯后，便在油-水界而上發(fā)生聚合反應，形 成尼龍膜，將酶包埋。（三）交聯(lián)法基本原理：酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，以戊二醛使用最 廣泛OHC （CH2） sCHO,使載體的氨基和酶蛋白中的氨基交聯(lián)形成席夫堿（基）Shiff堿將 酶固左化。含氨基的載體，可用氯乙基纖維素（纖維素-OCH2CH2NH2）,二乙氨乙基纖維 素（DEAE-纖維素）。雙功能試劑除了戊二醛外，還有乙撐二異鼠酸酯OCN （CH2）6NCO。 交聯(lián)劑的

10、特點：帶有二個以上的功能基團。反應比較劇烈條件比較嚴格。操作方 便，活力回收不高。固泄化分兩步進行，第一步形成可溶性分子間交聯(lián)絡合物，第二步是快速反應導致固化。 交聯(lián)法有5種形式： 酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適疑多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液 pH和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。此法操作簡單，一種多功能試劑可制備許多 酶衍生物，但缺乏選擇性，難于避免分子交聯(lián)，活力回收往往不高。 酶輔助蛋白交聯(lián)：為避免分子交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學修飾而引起失活，可使用第二個 “載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與 惰性蛋

11、白質(zhì)共交聯(lián)。實用中，當酶蛋白、無酶活性蛋白與戊二醛混合（戊二醛最終濃度0.7%） 后，混合液粘度開始提高時，立即鋪膜，或者在酶蛋白戊二醛與輔助蛋白混合后，經(jīng)-30°C 低溫處理，再預熱至4°C而得泡沫狀蛋白質(zhì)共聚物。這種固泄化酶為多孔性，活力回收比酶 直接交聯(lián)髙，機械性能也有改進。 吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂上、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或英他大孔型離子交換樹 脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固左化酶。此法用 于胞外酶的固宦化較好，尤其是從發(fā)酵液和粗酶制劑中直接固定化時，載體的選擇性吸附有 一泄純化作用，而酶分子之間的共價交聯(lián)又保證酶分子緊緊

12、地結(jié)合于載體上，而且酶分子僅 存在于載體表而，使固定化酶與底物接觸良好。由于載體本身有較好機械性能，所以產(chǎn)生的 固泄化酶裝柱流動性能好，缺點是必須保證酶吸附在載體上。 載體交聯(lián)法：用多功能試劑的一部分功能基團化學修飾髙聚物載體，而其中另一部分功能基團偶連酶蛋 白。也可利用多功能試劑的一部分功能基團與一種聚合物的單體反應，反應后再與酶一起共 聚。 交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細的集合體，然后用髙分子或多糖一類物質(zhì)進 行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固泄化酶穩(wěn)泄性好戊二醛交聯(lián)法缺點：雙功能基團試劑與酶蛋白的交聯(lián)作用，常引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變，使酶失活。 為

13、了避免或減少酶在交聯(lián)過程中失活，可在被交聯(lián)的酶蛋白溶液中添加一左量的輔助 蛋白。（四）化學共價法1、概念所謂共價法就是使酶蛋白的非必需基團（-NH2,-OH.-COOH.-SH.酚基，咪呼基，呵唏基）通 過共價鍵和不溶性載體形成不可逆的聯(lián)接。要使載體與酶形成共價鍵，必需首先使載體活化, 接上一活潑基團，再與酶反應2、用于共價法固定的酶蛋白上的功能基團：1）氨基-賴氨酸上的。氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的a-氨基；2）竣基-雙竣基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離拔基，以及多肽鏈末端的a-竣基；3）酪氨酸上的苯酚環(huán)；4）半胱氨酸上的既基；5）疑基-絲氨酸，氨酸以及酪氨酸上的疑基6）組氨酸上的咪哇

14、基；7）色氨酸上的眄I唏基其中以氨基和竣基為最常用3、一般認為共價法的特點如下： 酶和載體的結(jié)合比較牢固，酶不易脫落。故使用的半衰期較長。 制備條件復雜，反應劇烈，易引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 制備得到的固泄化酶，活力回收一般在50%左右。 載體不會引起蛋白質(zhì)的變性，經(jīng)得起一左的pH,濃度的改變。4、常用載體（1）天然高分子。如纖維素，葡聚糖凝膠（Sephadex）,瓊脂糖（AgaroseSepharose）,卡 那膠，淀粉以及它們的衍生物。（利用-OH）人工合成的髙聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NHz）無機載體，如多孔玻璃，硅膠等。（要加上一個基團）5、技

15、術(shù)要點（1）將所選用的載體上的有關基團活化，然后和酶蛋白上有關基團發(fā)生偶聯(lián)反應。（直接 活化或另接一反應基團）在選用的載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶蛋白和雙功能試劑偶聯(lián)。（接手臂）6、分類：重氮法；（2）疊氮法：縮合法；烷化反應法；硅烷化反應法：浪化鼠法。（1）重氮法目前在我們國用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠 和瓊脂等，用這些載體制備了不少固定化酶。方法原理如下： 用雙功能試劑卩-硫酸酯乙颯基苯胺（SESA）,連接于被活化（-0H）的纖維素等載體 上制備成ABSE-纖維素，瓊脂糖等。 在鹽酸和.亞硝酸鈉處理下把ABSE-纖維素變成重氮鹽。 把酶偶聯(lián)于

16、ABSE-纖維素上疊氮法是在酚分子與載體間形成肽鍵的固定化方法。主要是含竣基載體，轉(zhuǎn)變成?；B氮氯化物，異氛酸鹽等活化形態(tài)的衍生物，然后與酶的游 離氨基反應，從而形成肽鍵。例：用竣甲基纖維素疊氮衍生物制備固立化胰蛋白酶，步驟如下：酯化：CM-纖維素依 次用水、乙醇、乙礎洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴入HC1氣體，進行酯化反應: 最后用甲醇、乙陋洗滌，空氣干燥。腓解:把酯化后的CW纖維素懸于甲醇中，再加入80% 水合腓回流反應1小時，過濾，甲醇洗滌干燥。疊氮化:耕解后的CM-纖維素（lg）加入 150ml 2% HC1在冰浴中混合，攪拌滴加9ml 3% NaNO2反應20min,過濾用冷蒸

17、憾水洗滌， 同時加酶，防止戊二醛的另一醛再與載體上另一個-NH反應。（4）偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載 體加入0.05N pH 8.0磷酸緩沖液（含250-500mg酶）,5°C攪拌2-3小時,過濾用0.001NHCL 水洗滌，即為固左化胰蛋白酶（凍干保存）縮合法（對含-NH.COOH載體的另一種方法）主要利用具有竣基或氨基的載體，加入 到酶液中，在縮合劑破化二亞胺（雙環(huán)己基碳酰胺）作用下，使載體的撥基或氨基和酶蛋白 上的NH2或COOH形成肽鏈而被固建。含竣基的載體有竣甲基纖維素，竣甲基交聯(lián)葡聚糖等。含氨基的載體有氨乙基纖維素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。烷基化反應法。將含有鹵素官能團試劑與非

18、水溶性的纖維素載體進行烷化反應，然后和 酶進行偶聯(lián)制得固立化酶。一般常用三氯三嗪基試劑活化纖維素，然后偶聯(lián)酶（交聯(lián)匍聚糖, 瓊脂糖，多孔玻璃等）。硅烷化法：多孔玻璃特點：機械強度好，表而積大。耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔瓷。這些多孔玻璃的孔徑在250-1000埃之間，含SiO2 96%,由于粒度很細，每1克所擁有的表 而積達100平方米（氧化鈉，氧化硼，氧化硅經(jīng)熱處理原子重組而成，是優(yōu)良載體，但必須 加以改造）。本法進行酶的固定化可分三個步驟：將本體接上一個結(jié)合劑（也即硅烷化）；接上功 能基團；把酶共價結(jié)合于載體。浪化氛法-異服鍵合法本方法主要

19、用浪化鼠（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、匍聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊 脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用浪化鼠法活化瓊脂糖制備得到的固泄化酶 目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。上述這些載體在髙pH條件下（pHll左右），渙化魚和多糖一類物質(zhì)形成一種環(huán)化的活潑 的亞氨碳酸鹽，該化合物對蛋白質(zhì)上的NHi反應十分敏感，生成N-取代異服，N-取代.亞氨 碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要產(chǎn)物為N-取代異腮，反應式如右： 例：胰蛋白酶的固定-均在VC時進行。（1）活化：稱取瓊脂糖凝膠100mg （Sepharose 4B）,用0.5M NaCl和HQ洗滌，除去保護 劑和防腐劑，然

20、后按lml沉淀凝膠加入50300mgCNBr。立即用2N NaOH調(diào)pH值1011, 維持pH值11, pH值不再下降，直到反應終止。反應在25°C通風櫥進行，反應僅需10分鐘, 這樣CNBr將載體全部活化，生成活潑的亞氨碳酸鹽。反應完畢后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCCh洗滌（注意：切忌用帶有-NH?基的緩沖液來洗滌，因為亞氨碳酸鹽對NH一敏感， 在酶偶聯(lián)時，活性部位被NH?占領，酶偶聯(lián)不上），去除多余CNBr和雜蛋白。偶聯(lián)：用偶聯(lián)緩沖液（O.O25MpH 10.2硼酸緩沖液-0.02MCaC12或NaHCO3平衡洗滌， 抽V，加入5ml緩沖液（含16mg酶）溫度降至4&

21、#176;C,攪拌反應4小時，最后分別用0.1MpH8.5 硼酸緩沖液-lMNaCl洗滌即成醋酸緩沖液去除各種雜質(zhì)第三節(jié)細胞的固定化方法一、吸附法同酶的方法，（1）酵母細胞帶負電荷，在pH3-5的條件下能吸附在多孔瓷或多孔塑料 等載體表而，制成固泄化細胞（2）霊菌的菌絲可吸附在多孔塑料、金屬絲網(wǎng)等載體上來固 立化（3）植物細胞可吸附在中空纖維外壁上固立化（4）動物細胞大多具有附壁生長特性, 須依附在固體表而才能生長，可吸附在容器壁，微載體（顆粒細小的載體，直徑100-200um） 和中空纖維外壁等載體上來固定（培養(yǎng)液在中空纖維流動）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸鈣-聚賴氨酸(ALG-PLL)

22、包埋技術(shù)動物細胞先用海藻酸鈣凝膠包埋-聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜-檸 椽酸鈉溶液處理，使海藻酸鈣凝膠溶解-聚賴氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化 動物細胞。三、原生質(zhì)體固左化可解決胞酶的生產(chǎn)利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收一般采用凝膠包埋法包括原生質(zhì)體的制備和固左兩個步驟1原生質(zhì)體的制備要求：保持膜的完整性，不能使細胞部的結(jié)構(gòu)遭到破壞制備：對數(shù)期細胞的收集高滲溶液中加酶破壁分離除去細胞碎片、完整的細胞及酶(密 度梯度離心)-原生質(zhì)體2原生質(zhì)體的固定原生質(zhì)體T等滲緩沖液中配成一左濃度的原生質(zhì)體懸浮液j凝膠包埋角叉菜膠固定化含滲透壓穩(wěn)左劑的緩沖液與角叉菜加熱溶解配成3%-8%的凝膠-

23、火菌T冷卻到50°C左 右與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻-滴入到一泄?jié)舛鹊念A冷的氯化鉀溶液中T 球狀的固定化原生質(zhì)體2原生質(zhì)體的固定光交聯(lián)樹脂固定化法用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液配制30%-60%濃度的光交聯(lián)樹脂預聚體，加熱溶解后，在 50C左右，加入1%光敏劑，與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻，攤成薄層，經(jīng)紫外光照 射2-3mm,聚合后切成一定形狀的小塊，制成片狀的固是化原生質(zhì)體。第四節(jié)固定化酶的評價一、相對酶活力具有相同酶蛋白疑的固左化酶與游離酶活力的比值稱為相對酶活力,它與載體的體結(jié)構(gòu)、顆 粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關。相對酶活力低于75%的固泄化酶，一般沒有 實際

24、應用價值。二、酶的活力固左化的單位泄義為：轉(zhuǎn)化底物的量/固宦化酶的單位重量(單位而積)/單位時間，單位 是：j.iniol/mg(cm2)/mina將酶進行固左化時，總有一部分酶沒有與載體結(jié)合在一起，測左酶的活力回收率可以確左 固定化的效果。活力回收=固立化酶總活力/被固過化游離酚總活力xlOO%,或稱偶聯(lián)效率、活力保留 百分數(shù)。一般情況下，活力回收率應小于1,若大于1.可能由于固泄化活細胞增殖或某些抑制因素 排除的結(jié)果。三、固定化酶的半衰期即固立化酶的活力下降為初始活力一半所經(jīng)歷的時間。它是衡量固左化酶操作穩(wěn)泄性的 關鍵，英測定方法與化工催化劑半衰期的測左方法相似，也可以通過長期實際操作，也

25、可以通 過較短時間的操作來推算。第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)一、斷活力的變化固左化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，專一性也可能發(fā)生變化，其原因可能 是：酶的構(gòu)象的改變導致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變：載體的存在 給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，影響酶與底物或其他效應物的作用：底物 和酶的作用受其擴散速率的限制。在個別情況下，固左化酶由于抗抑能力的提髙使得它反而 比游離酶活力高。二、酶穩(wěn)定性提髙酶穩(wěn)左性包括熱穩(wěn)左性、對各種有機試劑的穩(wěn)泄性、對pH的穩(wěn)左性、對蛋白水解酶的 抗性及儲存穩(wěn)定性等。三、最適pH值的變化酶固立化后，催化底物的最適pH值和pH活性曲線常發(fā)生變化，引起變

26、化的因素主要有 兩個1、載體帶電性質(zhì)：載體帶負電荷時，會吸引反應液中的H+,致使酶附近反映區(qū)域pH比周圍 反應液低，須提高反應液pH：反之，降低反應液pH。第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)2、產(chǎn)物性質(zhì)：由于載體的擴散障礙，產(chǎn)物為酸性時，產(chǎn)物枳累在固泄化酶所處的催化區(qū)域, 使此區(qū)域的pH降低，須提高須提髙周圍反應液pH：反之，降低周用反應液pH。四、最適溫度的變化一般情況下，固泄化后的酶的最適作用溫度與游離酶差別不大，但有時由于固定化方 法和載體的影響，固左化酶的最適作用溫度可能降低，也可能升髙，須加以注意，最 適溫度提髙是有利的，可以降低酶的失活速率。五、動力學常數(shù)的變化（隨載體性質(zhì)變化）： 由于分配效應

27、：p珂Si微環(huán)境/S宏觀環(huán)境對簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動力學性質(zhì)一般服從米氏方程：（1）載體與底物帶相同電荷，SiVS，則pvlKid>Km固定化酶降低了酶的親和力。載體與底物電荷相反，靜電作用，Si>【S, p>l,Kin'<Kni六、底物特異性：對于作用于小分子底物的酶，變化不明顯：但對于可作用于小分子底物又 可作用于大分子底物的酶來說，由于載體空間位阻作用，大分子底物難以接近酶分子而使催 化速度大大降低，如固左在竣甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽作用保持不變，對酪 蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。第六節(jié)固定化輔酶一、輔酶固定化的意義輔酶類物質(zhì)是一些“全酶“的組成成分，參與催化反應。同時當其與某些高分子物質(zhì)結(jié)合 時，可以大大提髙催化效率。因此，將其固泄化，