第章高效液相色譜法分析化學(xué)

1、概述概述 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)(HPLC)是以是以溶劑液體為流動(dòng)相溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。的色譜方法。 早期液相色譜，包括早期液相色譜，包括TswettTswett的工作，都是在直徑的工作，都是在直徑15cm15cm, , 長長50500cm50500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在固定相顆粒直徑多在150200150200 m m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低很低(1mL/min)(BC正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系1 1分離機(jī)

2、制分離機(jī)制 離子對模型離子對模型非極性或弱極性3 3用途用途 適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子型和非離子型子交換色譜法無法分離的離子型和非離子型化合物的混合物的分離?；衔锏幕旌衔锏姆蛛x?？梢员苊庥闷胀ǖ目梢员苊庥闷胀ǖ腍PLCHPLC儀器長期進(jìn)行儀器長期進(jìn)行IECIEC時(shí)，時(shí)，流動(dòng)相（酸、堿）對泵與流路的腐蝕。流動(dòng)相（酸、堿）對泵與流路的腐蝕。此法在藥物分析中應(yīng)用很廣此法在藥物分析中應(yīng)用很廣 （四）離子抑制色譜法（四）離子抑制色譜法 在反相色譜法中，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的在反相色譜法中，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pHpH值，值，抑制樣品組分的

3、解離，增加它在固定相中的抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，稱為離子抑制色譜法（稱為離子抑制色譜法（ISCISC）。）。 （一）離子色譜法（一）離子色譜法 離子色譜離子色譜( (ICIC) )是是7070年代發(fā)展的新方法。其分年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測器檢測。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)種離子用電導(dǎo)檢測器檢測。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2 2個(gè)數(shù)量級，這個(gè)數(shù)量級，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)

4、會(huì)完全掩蓋待測離子信號。種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測離子信號。 為解決此問題，為解決此問題，19751975年年SmallSmall提出，在離子交提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。測器檢測各種離子的含量。該法可以分析無機(jī)與有機(jī)陰、陽離子和氨基該法可以分析無機(jī)與有

5、機(jī)陰、陽離子和氨基酸，以及糖類和酸，以及糖類和DNADNA、RNARNA的水解產(chǎn)物等。的水解產(chǎn)物等。該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。因譜峰在經(jīng)過抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液( (如苯甲如苯甲酸鹽稀溶液酸鹽稀溶液) )作流動(dòng)相。作流動(dòng)相。 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸

6、附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。時(shí)間，時(shí)間，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅膠硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好?？梢姡悍聪噫I合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。2211-4nkkR 3 3 傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗 由三個(gè)系數(shù)組成： C Cs CmCsm Cs固定相傳質(zhì)阻抗 Cm流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 Csm靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 sfssD

7、dC2（1）固定相傳質(zhì)阻抗mpmmDdC2m m是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子mpsmsmDdC2 smsm與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。數(shù)及容量因子有關(guān)。采用ODS柱為固定相，甲醇-水為流動(dòng)相，用HPLC來分離兩種弱堿性藥物（pKa=89）,但分離效果不理想：主要表現(xiàn)為柱效能低，保留時(shí)間過短。試設(shè)計(jì)通過改變流動(dòng)相來提高分離效能的方案。(10分)流程流程進(jìn)樣器餾分收集器記錄儀檢測器分離和進(jìn)樣系統(tǒng)分離和進(jìn)樣系統(tǒng) （一）進(jìn)樣系統(tǒng)（一）進(jìn)樣系統(tǒng) 與與GCGC相比，相比，HPLCHPLC柱要短得多，因此由于柱柱要短得多，

8、因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。即，本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。即，HPLCHPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器的死素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。 1. 1. 隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。差。2. 2. 高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，于進(jìn)樣量可由樣品管控制

9、，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。重復(fù)性好，如圖。（二）（二） 色譜柱色譜柱由柱管與固定相組成，柱管多用不銹鋼制成，由柱管與固定相組成，柱管多用不銹鋼制成，管內(nèi)壁要求具有很高的光潔度。固定相采用勻管內(nèi)壁要求具有很高的光潔度。固定相采用勻漿法高壓（漿法高壓（80 80 100MPa100MPa）裝柱。）裝柱。色譜柱按規(guī)格不同分為分析型與制備型兩類色譜柱按規(guī)格不同分為分析型與制備型兩類分析型柱分析型柱 常量柱：內(nèi)徑常量柱：內(nèi)徑2 24.6mm4.6mm，柱長，柱長1010 25cm25cm。半微量柱：內(nèi)徑半微量柱：內(nèi)徑1 1 1.5mm1.5mm，柱長，柱長1010 20cm20cm實(shí)驗(yàn)室制備型柱：

10、內(nèi)徑實(shí)驗(yàn)室制備型柱：內(nèi)徑2020 40mm40mm，柱長，柱長101030cm30cm 常用色譜柱柱效評價(jià)條件如下：常用色譜柱柱效評價(jià)條件如下：硅膠柱硅膠柱 樣品：苯、萘、聯(lián)苯及菲（用己烷配制）；樣品：苯、萘、聯(lián)苯及菲（用己烷配制）；流動(dòng)相：無水己烷。流動(dòng)相：無水己烷。反相色譜柱反相色譜柱（ODSODS柱等）樣品：尿嘧啶（測死時(shí)間用）、硝柱等）樣品：尿嘧啶（測死時(shí)間用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅膠柱樣品）；基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅膠柱樣品）；流動(dòng)相：甲醇流動(dòng)相：甲醇水（水（8585：1515） 乙腈乙腈水（水（6060：4O4O）。）。正相色譜柱（氰基與氨基柱等）正相色譜柱（氰基與氨

11、基柱等）樣品： 四氯乙烯（測死時(shí)間用）、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯為樣品；流動(dòng)相：正庚烷 按上述條件，測得各組分的W1/2。及tR，求出理論塔板數(shù)n及相鄰組分的分離度R（l5）。 色譜柱柱效指標(biāo)色譜柱柱效指標(biāo) 填料粒徑為填料粒徑為3m3m、4m4m、5m 5m 、7m7m或或10m10m時(shí)，柱效應(yīng)分別大于時(shí)，柱效應(yīng)分別大于8 8萬、萬、6 6萬、萬、5 5萬、萬、4 4萬及萬及 2 25 5萬理論塔板數(shù)米（或用萬理論塔板數(shù)米（或用 m m1 1表示表示）。）。 色譜柱的再生色譜柱的再生 反相色譜柱反相色譜柱 以甲醇一水（以甲醇一水（9595：

12、5 5）、純）、純甲醇及一氯甲烷等為流動(dòng)相，依次沖洗，順甲醇及一氯甲烷等為流動(dòng)相，依次沖洗，順序不得顛倒。每種流動(dòng)相的沖洗體積應(yīng)序不得顛倒。每種流動(dòng)相的沖洗體積應(yīng)2020倍倍于柱體積。然后，再以相反順序依次沖洗。于柱體積。然后，再以相反順序依次沖洗。 正相色譜柱（含硅膠柱）正相色譜柱（含硅膠柱）以嚴(yán)格脫水的以嚴(yán)格脫水的正己烷、異丙醇、一氯甲烷及甲醇為流動(dòng)相正己烷、異丙醇、一氯甲烷及甲醇為流動(dòng)相，依次沖洗，順序不得顛倒。其它步驟同上，依次沖洗，順序不得顛倒。其它步驟同上。 三、檢測系統(tǒng)三、檢測系統(tǒng) 要求：靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、要求：靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、重復(fù)性好、適用性廣等。重復(fù)

13、性好、適用性廣等。 應(yīng)用最多的是紫外檢測器（應(yīng)用最多的是紫外檢測器（UVDUVD）。其）。其次是熒光檢測器（次是熒光檢測器（FDFD）與電化學(xué)檢測器（）與電化學(xué)檢測器（ECDECD）。示差折光檢測器（）。示差折光檢測器（RIDRID）雖是泛用型）雖是泛用型檢測器，因受溫度影響較大，靈敏度不夠高檢測器，因受溫度影響較大，靈敏度不夠高，除還用于糖類的檢測外，已少用。，除還用于糖類的檢測外，已少用。 新型蒸發(fā)光散射檢測器及發(fā)光檢測器是新型蒸發(fā)光散射檢測器及發(fā)光檢測器是有發(fā)展前途的檢測器。有發(fā)展前途的檢測器。（一）紫外檢測器（一）紫外檢測器（UVDUVD或或UVUV）HPLCHPLC分析中因此該類檢測

14、器應(yīng)用很廣。分析中因此該類檢測器應(yīng)用很廣。原理原理 樣品組分通過流通池時(shí)對特定波長紫樣品組分通過流通池時(shí)對特定波長紫外線的吸收與濃度成正比。外線的吸收與濃度成正比。檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 由光源、流通池、檢測元件、由光源、流通池、檢測元件、微機(jī)及記錄器等組成。微機(jī)及記錄器等組成。 常用純?nèi)軇┑慕刂共ㄩL：水常用純?nèi)軇┑慕刂共ㄩL：水190190、乙腈、乙腈190190、甲醇、甲醇205205、正己烷、正己烷210210、乙醚、乙醚220220、四氫、四氫呋喃呋喃225225、二氯甲烷、二氯甲烷245245、氯仿、氯仿245nm245nm。 在選擇測量波長時(shí)注意在選擇測量波長時(shí)注意：溶劑必須能讓所：溶劑必

15、須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長（最低使用波長（截止波長截止波長）。特點(diǎn)特點(diǎn) 靈敏度高靈敏度高, ,噪音低，最小檢出量可達(dá)噪音低，最小檢出量可達(dá)1010-12-12g g 不破壞樣品，能與其它檢測器串聯(lián)。不破壞樣品，能與其它檢測器串聯(lián)。 對溫度及流速波動(dòng)不敏感，可用于梯度淋對溫度及流速波動(dòng)不敏感，可用于梯度淋洗。洗。 屬濃度型檢測器。屬濃度型檢測器。弱點(diǎn)弱點(diǎn) 只能檢測有紫外吸收的樣品；只能檢測有紫外吸收的樣品； 流動(dòng)相的選擇有一定限制。流動(dòng)相的選擇有一定限制。紫外吸收檢測器的類型紫外吸收檢測器的類型 分為：固定波長型、可變波長型及

16、二分為：固定波長型、可變波長型及二極管陣列檢測器三種。極管陣列檢測器三種。1.1.固定波長檢測器固定波長檢測器 是光源波長固定的光度計(jì)，一般波是光源波長固定的光度計(jì)，一般波長為長為254nm254nm，相當(dāng)于定波長紫外光度計(jì)。，相當(dāng)于定波長紫外光度計(jì)。因波長不能調(diào)節(jié)，不能選擇在最佳吸收波因波長不能調(diào)節(jié)，不能選擇在最佳吸收波長下檢測，長下檢測，已基本淘汰已基本淘汰。 2 2可變波長型檢測器可變波長型檢測器 是一臺(tái)紫外是一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)或紫外分可見分光光度計(jì)或紫外分光光度計(jì)，波長可按需要選擇。是光光度計(jì)，波長可按需要選擇。是HPLCHPLC配置最配置最多的檢測器。其光學(xué)結(jié)構(gòu)與一般紫外分光光度

17、多的檢測器。其光學(xué)結(jié)構(gòu)與一般紫外分光光度計(jì)一致，主要區(qū)別是用流通池替代了比色池。計(jì)一致，主要區(qū)別是用流通池替代了比色池。通常其光程為通常其光程為2 210mm, 10mm, 體積約為體積約為1 110 10 L L。 3.3.光電二極管陣列檢測器（光電二極管陣列檢測器（PDADPDAD） 是是8080年代出現(xiàn)的新型紫外檢測器。人們想年代出現(xiàn)的新型紫外檢測器。人們想測定通過流通池時(shí)各組分的光譜獲得定性信息。測定通過流通池時(shí)各組分的光譜獲得定性信息。但因組分停留時(shí)間太短但因組分停留時(shí)間太短( (1 1秒秒) )，普通紫外分，普通紫外分光光度計(jì)的掃描速度跟不上，若停留掃描則破光光度計(jì)的掃描速度跟不上

18、，若停留掃描則破壞了分離狀態(tài)。而二極管陣列檢測器用壞了分離狀態(tài)。而二極管陣列檢測器用二極管二極管陣列代替光電管陣列代替光電管，一般一個(gè)二極管對應(yīng)接受光，一般一個(gè)二極管對應(yīng)接受光譜上一個(gè)納米（譜上一個(gè)納米（nmnm）譜帶寬度的單色光。可在）譜帶寬度的單色光?？稍谌ㄩL范圍進(jìn)行快速掃描，全波長范圍進(jìn)行快速掃描，獲得三維光譜一色獲得三維光譜一色譜圖，同時(shí)得到定性、定量信息。譜圖，同時(shí)得到定性、定量信息。（二）熒光檢測器（二）熒光檢測器（FDFD） 早期的熒光檢測器是具有濾光片的熒光早期的熒光檢測器是具有濾光片的熒光光度計(jì)，已基本淘汰。光度計(jì)，已基本淘汰。 目前使用的熒光檢測器多是具有流通池目前使用的

19、熒光檢測器多是具有流通池的熒光分光光度計(jì)（直角光路）。的熒光分光光度計(jì)（直角光路）。 檢測限可達(dá)檢測限可達(dá)1 1 10 10-10-10g gmlml，比紫外檢，比紫外檢測器靈敏，但只適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生測器靈敏，但只適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)。物能發(fā)熒光的物質(zhì)。 （三）蒸發(fā)光散射、化學(xué)發(fā)光及安培檢測器（三）蒸發(fā)光散射、化學(xué)發(fā)光及安培檢測器 1 1蒸發(fā)光散射檢測器（蒸發(fā)光散射檢測器（ELSDELSD） 是90年代出現(xiàn)的最新型的泛用檢測器?？捎糜趽]發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分的檢測，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸及甾體類等。還可用于凝膠色譜及超臨界流體色譜的檢測。 原理

20、：原理： 將流出色譜柱的流動(dòng)相及組分先引入通載氣（高純N2）的蒸發(fā)室，加熱，使流動(dòng)相蒸發(fā)除去。組分則形成氣溶膠，被載氣帶入檢測室，用激光或強(qiáng)光照射氣溶膠而產(chǎn)生散射光（丁鋒爾光效應(yīng)），測定散射光強(qiáng)而獲得組分的濃度信號。散射光強(qiáng)I與進(jìn)入檢測器的氣溶膠中組分質(zhì)點(diǎn)的“質(zhì)量和”m的關(guān)系為： Ikmb k、b是二個(gè)與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)2 2化學(xué)發(fā)光檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器 是近年發(fā)展起來的高選擇性、高靈敏度是近年發(fā)展起來的高選擇性、高靈敏度的新型檢測器。設(shè)備簡單，自身發(fā)光不需光的新型檢測器。設(shè)備簡單，自身發(fā)光不需光源，價(jià)格便宜，可自制，很有發(fā)展前途?；?，價(jià)格便宜，可自制，很有發(fā)展前途?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)常用酶為催

21、化劑，將酶標(biāo)記在待學(xué)發(fā)光反應(yīng)常用酶為催化劑，將酶標(biāo)記在待測物、抗原或抗體上，可進(jìn)行藥物代謝分析測物、抗原或抗體上，可進(jìn)行藥物代謝分析及免疫發(fā)光分析。及免疫發(fā)光分析。 檢測原理檢測原理 某些物質(zhì)在常溫下與發(fā)光試劑反應(yīng)，生成某些物質(zhì)在常溫下與發(fā)光試劑反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物，當(dāng)它們由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)處于激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物，當(dāng)它們由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射光子。因其能量來源于化學(xué)反應(yīng)，故稱時(shí)發(fā)射光子。因其能量來源于化學(xué)反應(yīng)，故稱為化學(xué)發(fā)光。光強(qiáng)與組分濃度成正比。最小檢為化學(xué)發(fā)光。光強(qiáng)與組分濃度成正比。最小檢測量可達(dá)測量可達(dá)pgpg級（級（10101212g g）。）。3 3安培檢測器（安培檢測器（ADAD）

22、電化學(xué)檢測器包括電化學(xué)檢測器包括電導(dǎo)檢測器、安培檢電導(dǎo)檢測器、安培檢測器及極譜檢測器等。電導(dǎo)檢測器主要用于測器及極譜檢測器等。電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜，安培檢測器與極譜檢測器可用于離子色譜，安培檢測器與極譜檢測器可用于可氧化、還原的物質(zhì)的檢測?？裳趸⑦€原的物質(zhì)的檢測。 其它其它 尚有紅外檢測器、介電常數(shù)檢測器及尚有紅外檢測器、介電常數(shù)檢測器及放射性檢測器等。放射性檢測器等。 接參比電極接參比電極和對電極和對電極接色譜柱接色譜柱Teflon塑料塊塑料塊1 cm工作電極工作電極(Pt, Au, 碳糊碳糊)第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜分析方法高效液相色譜分析方法一、定性分析方法一、定性分析方法 H

23、PLCHPLC的定性方法與的定性方法與GCGC相似，可分為色譜相似，可分為色譜鑒定法及非色譜鑒定法兩類。鑒定法及非色譜鑒定法兩類。 1 1色譜鑒定法色譜鑒定法 保留時(shí)間或相對保留時(shí)保留時(shí)間或相對保留時(shí)間對照。間對照。 2 2化學(xué)鑒定法化學(xué)鑒定法 分離后收集組分定性。分離后收集組分定性。 3 3兩譜聯(lián)用鑒定法兩譜聯(lián)用鑒定法 （1 1）兩譜聯(lián)用法：）兩譜聯(lián)用法：用用 HPLCHPLC制備純組分，制備純組分，用光譜儀器鑒定。用光譜儀器鑒定。 （2 2）兩譜聯(lián)用儀：）兩譜聯(lián)用儀：能同時(shí)獲得定性、定能同時(shí)獲得定性、定量信息。如量信息。如HPLCHPLCUVUV、HPLCHPLCFTIRFTIR及及 HPLCHPLCMSMS等。等。 二、定量分析方法二、定量分