熒光光譜分析

1、第十七章 熒光光譜分析當(dāng)紫外線照射到某些物質(zhì)的時候，這些物質(zhì)會發(fā)射出各種顏色和不同強度的可見光，而當(dāng)紫外線停止照射時，所發(fā)射的光線也隨之很快地消失，這種光線被稱為熒光。 西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes于1575年第一次記錄了熒光現(xiàn)象。17世紀(jì)，Boyle和Newton等著名科學(xué)家再次觀察到熒光現(xiàn)象。17世紀(jì)和18世紀(jì)，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其它一些發(fā)熒光的材料和溶液，但是在熒光現(xiàn)象的解釋方面卻沒有什么進(jìn)展。1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍長，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射所引起的，從

2、而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。同時，他由發(fā)熒光的礦物“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語。1867年，Coppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁-桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。1880年，Liebeman提出了最早的關(guān)于熒光與化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的經(jīng)驗法則。到19世紀(jì)末，人們已經(jīng)知道了600種以上的熒光化合物。20世紀(jì)以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多了。例如，1905年Wood發(fā)現(xiàn)了共振熒光；1914年Frank和Hertz利用電子沖擊發(fā)光進(jìn)行定量研究；1922年Frank和Cario發(fā)現(xiàn)了增感應(yīng)光；1924年Wawillow進(jìn)行了熒光產(chǎn)率的絕對測定；1926年Gaviola進(jìn)行了熒光壽命

3、的直接測定等。熒光分析方法的發(fā)展離不開儀器應(yīng)用的發(fā)展。19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一臺光電熒光計。早期的光電熒光計的靈敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方面，是一個非常重要的階段。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校正步驟，1948年由Studer推出了第一臺自動光譜校正裝置，到1952年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器。熒光光譜分析法除了可以用作組分的定性檢測和定量測定的手段之外，還被廣泛地作為一種表征技術(shù)應(yīng)用于表征所研究體系的

4、物理、化學(xué)性質(zhì)及其變化情況。例如，在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中，人們經(jīng)?？梢岳脽晒鈾z測的手段，通過檢測某種熒光特定參數(shù)（如熒光的波長、強度、偏振和壽命）的變化情況來表征生物大分子在性質(zhì)和構(gòu)象上的變化。很多化合物由于本身具有大的共軛體系和剛性的平面結(jié)構(gòu)，因而具有能發(fā)射熒光的內(nèi)在本質(zhì)，我們稱這些化合物為熒光化合物。在某些所要研究的體系中，由于體系自身含有這種熒光團(tuán)而具有內(nèi)源熒光，人們就可以利用其內(nèi)源熒光，通過檢測某種熒光特性參數(shù)的變化，對該體系的某些性質(zhì)加以研究。但是，如果所要研究的體系本身不含有熒光團(tuán)而不具有內(nèi)源熒光，或者其內(nèi)源性質(zhì)很弱，這時候就必須在體系中外加一種熒光化合物即所謂熒光探針，再通過測

5、量熒光探針的熒光特性的變化來對該體系加以研究。例如，如果我們要檢測體系的極性，便可以將對極性敏感的熒光探針加入到體系中，然后通過對熒光探針的熒光特性的檢測，求得體系的極性，或通過探針的熒光特性的變化來表征體系的極性的變化情況。 熒光分析法之所以發(fā)展如此迅速，應(yīng)用日益廣泛，其原因之一是熒光分析法具有很高的靈敏度。在微量分析的各種方法中，應(yīng)用較為廣泛的有比色法和分光光度法。但在方法的靈敏度方面，熒光分析法的靈敏度一般要比這兩種方法高23各數(shù)量級。隨著現(xiàn)代電子技術(shù)的迅速發(fā)展，對于微弱光信號檢測的靈敏度已大大提高，熒光分析的靈敏度?？蛇_(dá)億分之幾，在與毛細(xì)管電泳分離技術(shù)結(jié)合、采用激光誘導(dǎo)熒光檢測法時，已

6、能接近或達(dá)到單分子檢測的水平1熒光分析法的另一個優(yōu)點是選擇性高。這主要是對有機化合物的分析而言。吸光物質(zhì)由于內(nèi)在本質(zhì)的差別，不一定都會發(fā)熒光，況且，發(fā)熒光的物質(zhì)彼此之間在激發(fā)波長和發(fā)射波長方面可能有所差異，因而通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長和熒光測定波長，便可能達(dá)到選擇性測定的目的。另外，由于熒光的特性參數(shù)較多，除量子產(chǎn)率、激發(fā)與發(fā)射波長之外，還有熒光壽命、熒光偏振等。因此，還可以通過采用同步掃描、導(dǎo)數(shù)光譜、三維光譜、時間分辨和相分辨等一些熒光測定新技術(shù)進(jìn)一步提高測定的選擇性。除靈敏度高和選擇性好之外，動態(tài)線性范圍寬，方法簡便，重現(xiàn)性好，取樣量少，儀器設(shè)備不復(fù)雜等等，也是熒光分析法的優(yōu)點。近年來，在其

7、他學(xué)科迅速發(fā)展的影響下，激光、微處理機、電子學(xué)、光導(dǎo)纖維和納米材料等方面的一些新技術(shù)的引入，很大程度上推動了熒光分析法在理論和應(yīng)用方面的進(jìn)展，促進(jìn)了諸如同步熒光測定、倒數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定、熒光偏振測定、熒光免疫測定、低溫?zé)晒鉁y定、固體表面熒光測定、近紅外熒光分析法、熒光反應(yīng)速率法、三維熒光光譜技術(shù)、熒光顯微與成像技術(shù)、空間分辨熒光技術(shù)、熒光探針技術(shù)、單分子熒光檢測技術(shù)和熒光光纖化學(xué)傳感器等熒光分析方面的某些新方法、新技術(shù)的發(fā)展，并且相應(yīng)地加速了各式各樣新型的熒光分析儀器的問世，使熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀、實時、原位和自動化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和選

8、擇性日益提高，方法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展，遍及工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、食品科學(xué)和公安情報等諸多領(lǐng)域。如今，熒光分析法已經(jīng)發(fā)展成為一種十分重要且有效地光譜化學(xué)分析手段。17.1 基本原理 熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，那么，由于分子對光的選擇性吸收，不同波長的入射光便具有不同的激發(fā)頻率。如果固定熒光的發(fā)射波長（即測定波長）而不斷改變激發(fā)光（即入射光）的波長，并記錄相應(yīng)的熒光強度，所得到的熒光強度對激發(fā)波長的譜圖稱為熒光的激發(fā)光譜（簡稱激發(fā)光譜）。如果使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而不斷改變熒光的測定波長（即發(fā)射波長）并記錄相應(yīng)的熒光強度，所得到的熒光強度對發(fā)射波長的譜圖則稱為熒光的發(fā)射光

9、譜（簡稱發(fā)射光譜）。激發(fā)光譜反映了在某一固定的發(fā)射波長下所測量的熒光強度對激發(fā)波長的依賴關(guān)系；發(fā)射光譜反映了在某一固定的激發(fā)波長下所測量的熒光的波長分布。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可用以鑒別熒光物質(zhì)，并可作為進(jìn)行熒光測定時選擇合適的激發(fā)波長和測定波長的依據(jù)。 熒光測量儀器有各自的特性，如光源的能量分布、單色器的透射率和檢測器的敏感度都隨波長而改變，因而一般情況下測得的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，皆為表觀的光譜。同一份熒光化合物的溶液在不同的熒光測量儀上所測得的表觀光譜彼此間往往有所差異。只有對上述儀器特性的波長因素加以校正之后，所獲得的校正光譜（或稱真是光譜）才可能是彼此一致的。某種化合物的熒光激發(fā)光譜的形狀

10、，理論上應(yīng)與其吸收光譜的形狀相同，但是由于上述儀器特性的波長因素，表光激發(fā)光譜的形狀與吸收光譜的形狀大都有所差異，只有校正的激發(fā)光譜才與吸收光譜非常接近。在化合物的濃度足夠小，對不同波長激發(fā)光的吸收正比于其吸光系數(shù)，且熒光的量子產(chǎn)率與激發(fā)波長無關(guān)的條件下，校正的激發(fā)光譜在形狀上與吸收光譜相同。 分子的吸收光譜可能含有幾個吸收帶，但其發(fā)射光譜卻通常只含有一個發(fā)射帶。絕大多數(shù)情況下即使分子被激發(fā)到S2電子態(tài)以上的不用振動能級，但是由于內(nèi)轉(zhuǎn)化和振動松弛的速率是那樣的快，以致很快地喪失多余的能量而衰變到S1態(tài)的最低振動能級，然后發(fā)射熒光，因而其發(fā)射光譜通常只含一個發(fā)射帶，且發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

11、，只與基態(tài)中振動能級的分布情況以及各振動帶的躍遷概率有關(guān)。但是也有例外，例如有些熒光體具有兩個電離態(tài)，而每個電離態(tài)顯示不同的吸收和發(fā)射光譜，等等。 物質(zhì)在吸收入射光的過程中，光子的能量傳遞給了物質(zhì)分子。分子被激發(fā)后，發(fā)生了電子從較低的能級到較高能級的躍遷。該躍遷過程經(jīng)歷的時間約10-15s。躍遷所涉及的兩個能級間的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可見光區(qū)的光子能量較高，足以引起分子中的電子發(fā)生電子能級間的躍遷。處于該激發(fā)態(tài)的分子稱為電子激發(fā)態(tài)分子。 電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)用2S+1表示，S是電子自旋角動量量子數(shù)的代數(shù)和，其數(shù)值為0或1。分子中同一軌道里同一軌道里所占據(jù)的兩個電子必須具有相反的自

12、旋方向，即自選配對。如果分子中的全部電子都是自旋配對的，即S=0，該分子便處于單重態(tài)（或稱單線態(tài)），用符號S表示。大多數(shù)有機物分子的基態(tài)是處于單重態(tài)的。如果分子吸收能量后電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時分子處于激發(fā)的單重態(tài)；倘若電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，這時分子便具有兩個自旋不配對的電子，即S=1，分子處于激發(fā)的三重態(tài)（或稱三線態(tài)），用符號T表示。符號S0、S1和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)單重態(tài)，T1和T2則分別表示第一和第二電子激發(fā)三重態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷的衰變過程而返回基態(tài)。另外，激發(fā)態(tài)分子也可能由于分子間的作用

13、過程而失活。 輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生熒光活磷光；非輻射躍遷的衰變過程，包括振動松弛（VR）、內(nèi)轉(zhuǎn)化（ic）、和系間竄越（isc），這些衰變過程導(dǎo)致激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能傳遞給介質(zhì)。振動松弛是指分子將多余的振動能量傳遞給介質(zhì)而衰變到同一電子態(tài)的最低振動能級的過程。內(nèi)轉(zhuǎn)化指相同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍遷過程（例如S1S0，T2T1）；系間竄越則指不同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍遷過程（例如S1T1，T1S0）。圖5.6.1為分子內(nèi)所發(fā)生的激發(fā)過程以及輻射躍遷和非輻射躍遷過程的示意圖。 圖5.6.1 分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程A1.A2.吸收；F.熒光；P.磷光；ic.內(nèi)轉(zhuǎn)化；is

14、c.系間竄越；VR.振動松弛. 如果分子被激發(fā)到S2以上的某個電子激發(fā)單重態(tài)的不同振動能級上，處于這種激發(fā)態(tài)的分子很快（約10-1210-14s）發(fā)生振動松弛而衰變到該電子態(tài)的最低振動能級，然后又經(jīng)由內(nèi)轉(zhuǎn)化及振動松弛而衰變到S1態(tài)的最低振動能級。接著，有如下幾種衰變到基態(tài)的途徑：S1S0的輻射躍遷而發(fā)射熒光；S1S0內(nèi)轉(zhuǎn)化；S1T1系間竄越。而處于T1態(tài)的最低振動能級的分子，則可能發(fā)生T1S0的輻射躍遷而發(fā)射磷光，也可能同時發(fā)生T1S0系間竄越。 從比較熒光與激發(fā)光的波長這一角度出發(fā)，熒光又可分為斯托克斯（Stokes）熒光、反斯托克斯熒光以及共振熒光。斯托克斯熒光的波長比激發(fā)光源的長，反斯托

15、克斯熒光的波長則比激發(fā)光源的短，而共振熒光具有與激發(fā)光相同的波長。在溶液中觀察到的通常是斯托克斯熒光。由熒光在電磁輻射中所處的波段范圍，又有X射線熒光、紫外熒光、可見熒光和紅外熒光之分。17.2基本構(gòu)成及其工作原理 熒光光譜儀由光源、單色器（濾光片或光柵）、狹縫、樣品室、信號檢測放大系統(tǒng)和信號讀出、記錄系統(tǒng)組成。光源用來激發(fā)樣品，單色器用來分離出所需要的單色光，信號檢測放大系統(tǒng)用來把熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，聯(lián)結(jié)于放大裝置上的讀出裝置用來顯示或記錄熒光信號。 下面介紹現(xiàn)用儀器（即法國Horiba Jobin Yvon生產(chǎn)的FluorLog-3熒光光譜儀）的各組件。1、 激發(fā)光源理想化的激發(fā)光源：由

16、于熒光體的熒光強度與激發(fā)光的強度成正比，因此，作為一種理想的激發(fā)光源應(yīng)具備：足夠的強度；在所需光譜范圍內(nèi)有連續(xù)的光譜；其強度與波長無關(guān)，即光源的輸出應(yīng)是連續(xù)平滑等強度的輻射；光強要穩(wěn)定。符合這些要求的光源實際上并不存在?？勺鳛榧ぐl(fā)光源的主要有氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、激光器以及閃光燈。高壓氙弧燈是熒光光譜儀中應(yīng)用最廣泛的一種光源。本儀器所用的激發(fā)光源即為450W氙燈。這種光源是一種短弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，室溫時其壓力為5atm，工作時壓力約為20atm。250800nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，450nm附近有幾條銳線。其工作時，在相距約8mm的鎢電極間形成一強的電子流（電?。?，氙原子與電

17、子流相撞而離解為氙正離子，氙正離子與電子復(fù)合而發(fā)光。氙原子的離解發(fā)射連續(xù)光譜，而激發(fā)態(tài)的氙則發(fā)射分布于450nm附近的線狀光譜。氙弧燈的光譜輸出，短于280nm區(qū)的強度迅速下降。有的氙弧燈為無臭氧燈，即工作時氙燈周圍不產(chǎn)生臭氧，這種燈所用的石英外套不投射波長短于250nm的光，但這種燈的輸出信號強度隨波長縮短而迅速下降。工作時，氙燈燈光很強，其射線會損傷肉眼視網(wǎng)膜，紫外線會損傷肉眼角膜，因此，工作者應(yīng)避免直視光源。2、 單色器和濾光片光柵單色器 光柵單色器有兩個主要性能指標(biāo)，即色散能力和雜散光水平，色散能力通常以nm/mm表示，其中mm為單色器的狹縫寬度。通常人們總是選用低雜散光的單色器，以減

18、少雜散光的干擾，同時選用高效率的單色器來提高檢測弱信號的能力。單色器一般都有進(jìn)、出光兩個狹縫，出射光的強度約與單色器狹縫寬度的平方成正比，增大狹縫寬度有利于提高信號強度，縮小狹縫寬度有利于提高光譜分辨力，但卻犧牲了信號強度。對于光敏性的熒光體測量，有必要適當(dāng)減少入射光的強度。 光柵單色器的透射率為波長的函數(shù)，機刻光柵的輸出最強光的波長被稱為閃耀波長。光柵的閃耀波長由光柵的閃耀角而定，而閃耀角則由光柵的線槽角而定。為了彌補激發(fā)光源（氙燈）紫外區(qū)能量弱的缺點，熒光光譜儀多選用閃耀波長落于紫外區(qū)（例如300nm）的單色器為激發(fā)單色器。由于熒光體的熒光波長多落于400600nm，因而發(fā)射單色器常采用閃

19、耀波長為500nm左右的光柵。光柵單色器的另一重要特性在于它的透射率與偏振光有關(guān)。對于熒光測量來說，單色器的雜散光指標(biāo)是一個極關(guān)鍵的參數(shù)。雜散光被定義為除去所需要波長的光線以外，通過單色器的所有其他光線的強度。首先考慮激發(fā)單色器，通常紫外線被用來激發(fā)熒光體，而氙燈中的紫外線強度僅約為可見光的1%。熒光體的熒光一般都很弱，通過激發(fā)單色器的長波長的雜散光，容易被當(dāng)做熒光來檢測。許多生物樣品都有較大的濁度，結(jié)果入射的雜散光被樣品散射而干擾熒光強度的測量。因此，某些熒光光譜儀采用雙光柵單色器，這樣，雖然雜散光可降至峰強度的10-810-12，可是其靈敏度也將降低。 濾光片 熒光測量的主要誤差來自雜散光

20、和散射光。消除這些誤差源除用單色器外還可用濾光片。濾光片具有便宜、簡單等優(yōu)點，因此它在熒光光譜儀中有廣泛的應(yīng)用。濾光片可分為玻璃濾光片、膠膜濾光片和干涉濾光片三種。本儀器所用的是玻璃濾光片。玻璃濾光片含有各種不同的金屬氧化物，因而呈現(xiàn)不同的顏色。它們透過的光線帶寬較寬，且因受金屬氧化物種類的限制，品種不多。但它具有穩(wěn)定、經(jīng)得起長期光照和便宜等優(yōu)點。3、 檢測器檢測器主要包括光電倍增管（PMT）、光導(dǎo)攝像管（Vidicon）、電子微分器和電荷耦合器件陣列檢測器（charge-coupled device,CCD）。目前，幾乎所有普通熒光光譜儀都采用光電倍增管（PMT）作為檢測器。PMT是一種很好

21、的電流源，在一定的條件下，其電流量與入射光強度成正比。雖然PMT對各個光子均起響應(yīng)，但是平時都是測量眾多光子脈沖響應(yīng)的平均值。光導(dǎo)攝像管被用來作為光學(xué)多道分析器（簡稱OMA）的檢測器，它具有檢測效率高、動態(tài)范圍寬、線性響應(yīng)好、堅固耐用和壽命長等優(yōu)點。與PMT相比，其檢測靈敏度雖不如PMT，但卻能同時接受熒光體的整個發(fā)射光譜，這有利于光敏性熒光體和復(fù)雜樣品的分析，且檢測系統(tǒng)容易實現(xiàn)自動化2。獲得導(dǎo)數(shù)（亦稱微分）光譜的方式有兩類，一為光譜信號輸出的微分，它包括電子微分、數(shù)字微分、機械轉(zhuǎn)速微分；另一類為改變光路結(jié)構(gòu)，例如波長調(diào)制等。熒光光譜儀采用電子微分或微處理機微分3-4。電荷耦合器件陣列檢測器（

22、charge-coupled device,CCD）是一類新型的光學(xué)多通道檢測器，它具有光譜范圍寬、量子效率高、暗電流小、噪聲低、靈敏度高、線性范圍寬，同時可獲取彩色、三維圖像等特點。CCD是一種靈敏的固體成像裝置，一般來說CCD的有效成像面積為18cm2?，F(xiàn)在商品型號的CCD有576*384像素、5126*512像素、1024*1024像素、400萬像素、800萬像素等系列產(chǎn)品5-6。 本中心配備的熒光光譜儀的檢測器是R928P PMT（photomultiplier-tube,光電倍增管）。PMT由一個光陰極和多級的二次發(fā)射電極所組成。光照射于光陰極時會引起一次電子發(fā)射，這些光電子在PMT

23、中被電場加速飛射到第一個二次發(fā)射極（打拿極）上時，每個光電子將引起520個二次電子發(fā)射，這些電子又被加速到下一個電極上去，如此多次重復(fù)，最后電子被集中到陽極上去。所產(chǎn)生的電流被放大到可檢測的水平。PMT的光電子產(chǎn)生率與施加于光陰極的高壓值有關(guān)，一般PMT常用-500-1000V的電壓，有些型號的PMT則用-1000-2000V。電壓越高，每個二次電極發(fā)射的電子越多，因而PMT本身的放大作用就越大。PMT的靈敏度受暗電流的限制，而暗電流主要由陰極和二次發(fā)射極的熱電子發(fā)射和電極間的漏電流所形成。電極間電壓低時，暗電流主要來自漏電流；電極電壓高時，則主要來自熱電子發(fā)射。4、讀出裝置 以前，熒光儀器的

24、讀出裝置有數(shù)字電壓表、記錄儀（xy型或xt型）和陰極示波器等幾種。數(shù)字電壓表用于例行定量分析，既準(zhǔn)確、方便又便宜。記錄儀多用于掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，它可分為xy記錄儀和xt記錄儀兩種。xy記錄儀的x軸表示熒光強度，它由光電檢測器的輸出來驅(qū)動其記錄筆于相應(yīng)的熒光強度位置，y軸表示波長，它與單色器掃描速度同步。xy記錄儀可來回反復(fù)掃描，其價格約為xt記錄儀的一倍。xt記錄儀的x軸顯示熒光強度，t軸表示與時間有關(guān)的波長，它只能進(jìn)行單向掃描。記錄儀記錄筆的響應(yīng)時間一般為0.10.5s。陰極示波器顯示的速度比記錄儀快得多，可是質(zhì)量好的陰極示波器其價格比記錄儀高得多。目前，計算機軟硬件技術(shù)的發(fā)展使得人們

25、可以根據(jù)不同的需要選擇不同的直觀的視頻讀出方式。17.3實驗技術(shù)17.3.1實驗方法的選擇 在熒光分析中，可以采用不同的實驗方法以進(jìn)行分析物質(zhì)濃度的測量。其中最簡單的是直接測定的方法。只要分析物質(zhì)本身法熒光，便可以通過測量其熒光強度以測定其濃度。許多有機芳族化合物和生物物質(zhì)有內(nèi)在的熒光性質(zhì)，通?？梢灾苯舆M(jìn)行熒光測定。若有其他干擾物質(zhì)存在時，則應(yīng)預(yù)先采用掩蔽或分離的辦法加以消除。 對于有些物質(zhì)，它們或者本身不發(fā)熒光，或者因熒光量子產(chǎn)率很低而無法進(jìn)行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。間接測定的辦法有多種，可按分析物質(zhì)的具體情況加以適當(dāng)?shù)倪x擇。 第一種方法是熒光衍生化的辦法，即通過某種手段使本身不

26、發(fā)光的待分析物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N發(fā)熒光的化合物，再通過測定該化合物的熒光強度，可間接測定待分析物質(zhì)。例如許多無機金屬離子的熒光測定方法，就是通過使它們與某些金屬螯合劑反應(yīng)生成具有熒光的螯合物之后加以測定的7-8。某些不發(fā)光的有機化合物，可以通過降解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)、縮合反應(yīng)、酶催化反應(yīng)或光化學(xué)反應(yīng)等辦法，使它們轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)。例如維生素B1本身不發(fā)熒光，但可在堿性溶液中用鐵青化鉀等一些氧化劑將它氧化為發(fā)熒光的硫胺熒9。 如果分析物質(zhì)本身不發(fā)熒光，但卻具有能使某種熒光化合物熒光猝滅的能力，由于熒光猝滅的程度與分析物質(zhì)的濃度有著定量的關(guān)系，那么，通過測量熒光化合物熒光強度的下降程度，便可間

27、接地測定該分析物質(zhì)。例如大多數(shù)過渡金屬離子與具有熒光性質(zhì)的芳族配位體配合后，往往使配位體的熒光猝滅，從而可間接測定這些金屬離子10-11。 倘若待分析物質(zhì)不發(fā)熒光，但可以通過選擇合適的熒光試劑作為能量受體，在待分析物質(zhì)受激發(fā)后，通過能量轉(zhuǎn)移的辦法，經(jīng)由單重態(tài)-單重態(tài)（或三重態(tài)-單重態(tài)）的能量轉(zhuǎn)移過程，將激發(fā)能傳遞給能量受體，使能量受體分子被激發(fā)，再通過測定能量受體所發(fā)射的發(fā)光強度，也可以對分析物進(jìn)行間接測定。例如在濾紙上用萘作敏化劑以測定低濃度的蒽時，可使蒽的檢測限提高達(dá)3個數(shù)量級。以此類推，低濃度的菲也可由萘敏化而產(chǎn)生較強的熒光12。 在熒光分析中，由于每種熒光化合物具有本身的熒光激發(fā)光譜和

28、發(fā)射光譜，因而在測定時相應(yīng)的有激發(fā)波長和發(fā)射波長兩種參數(shù)可供選擇，這在混合物的測定方面比分光光度法具有更有利的條件，有時可簡單地通過選擇合適的激發(fā)波長或發(fā)射波長，達(dá)到選擇性測定混合物中某種組分的目的。在選擇激光波長和發(fā)射波長之后仍無法達(dá)到混合物中各組分的分別測定時，還可仿照分光光度法中聯(lián)合測定并解聯(lián)立方程式的辦法；對于混合物的熒光聯(lián)合測定，也有不采用聯(lián)立方程式而采用校正圖的辦法；對于發(fā)射光譜相互重疊的雙組份或三組分熒光混合物的同時測定，在合適的條件下可應(yīng)用類似于雙波長分光度的原理，采用多波長熒光法進(jìn)行測定。上述這些辦法提出時在當(dāng)時的儀器條件下是有效的、可以解決問題的，對拓寬熒光分析的應(yīng)用范圍是

29、發(fā)揮一定作用的，但畢竟方法比較繁瑣、費時。在目前的情況下，由于熒光分析在法學(xué)和儀器方面都有了很大的發(fā)展，就不必采用上述幾種方法，而可以采用更為先進(jìn)的方法，諸如本書后面將要介紹的同步熒光測定、導(dǎo)數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定等方法，以及化學(xué)計量學(xué)的方法，來達(dá)到分別測定或同時測定的目的。 與常規(guī)熒光分析法相比，同步熒光分析法具有簡化譜圖、提高選擇性、減少光散射干擾等特點，尤其適合多組分混合物的分析。同步熒光掃描技術(shù)由Lloyd13首先提出，它與常用的熒光測定方法最大的區(qū)別是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應(yīng)的激發(fā)波長（或發(fā)射波長）構(gòu)成光譜圖，稱為同步熒光光譜

30、14。 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射兩種波長在同時掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步熒光分析法可分為如下四種類型：第一種類型在同時掃描過程中使激發(fā)波長（常數(shù)），這種方法稱為恒（固定）波長同步熒光分析法（constant-wavelength synchronous fluorescence spectrometry, CWSFS）,即習(xí)慣上所說的同步熒光法，是最早提出的一種同步掃描技術(shù)13-17；第二種類型則以能量關(guān)系代替波長關(guān)系，在兩個單色器同時掃描過程中使激發(fā)波長與發(fā)射波長之間保持固定的能量差，這種方法稱為恒能量同步熒光分析法(constant-energy synchronous fluorescen

31、ce spectrometry,CESFS) 18-20；第三種類型稱為可變角（或可變波長）同步熒光法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry,MISFS），其掃描路徑表現(xiàn)為基體（將干擾物視為基體）的等熒光強度線。 同步熒光掃描測定具有如下優(yōu)點：1簡化光譜；2窄化譜帶；3減小光譜的重疊現(xiàn)象；4減小散射光的影響。 三維熒光光譜是近幾十年中發(fā)展起來的一種新的熒光分析技術(shù)。這種技術(shù)區(qū)別于普通的熒光分析的主要特點在于它能獲得激發(fā)波長與發(fā)射波長同時變化時的熒光強度信息。普通熒光分析所測得的光譜是二維譜圖，包括固定激發(fā)波長而掃描發(fā)射（即熒光

32、測定）波長所獲得的發(fā)射光譜，和固定發(fā)射波長而掃描激發(fā)波長所獲得的激發(fā)光譜。但是，實際上熒光強度應(yīng)是激發(fā)和發(fā)射這兩個波長變量的函數(shù)。描述熒光強度同時隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系圖譜，即為三維熒光光譜21-27。 另外，熒光分析法還有時間分辨和相分辨熒光分析法、熒光偏振測定、低溫?zé)晒夥治龇?、固體表面熒光分析法、動力學(xué)熒光分析法空間分辨熒光分析技術(shù)、單分子熒光檢測、熒光免疫分析法和導(dǎo)數(shù)熒光分析法。 固體表面熒光測有兩種方法：一種是直接測定固體物質(zhì)表面的熒光；另一種是將待測組分吸附在固體物質(zhì)表面，然后進(jìn)行熒光測定。才用的固體物質(zhì)品種眾多，有硅膠、氧化鋁、濾紙、硅酮橡膠、乙酸鈉、溴化鉀、蔗糖、纖維素等

33、。固體表面熒光測定有兩種不同形式，一為反射式，一為透射式。采用反射式時，激發(fā)光源和熒光檢測器同在樣品的一邊，一般互成45°角。紫外激發(fā)光聚集于固體表面樣品斑點上，樣品發(fā)生的熒光經(jīng)單色器散射后由檢測器檢測。采用透射式時，一般將樣品吸附在透明的薄層色譜板上，激發(fā)光源和檢測器分處在樣品的兩邊。紫外激發(fā)光經(jīng)濾光片除去可見光，聚集在樣品斑點上而發(fā)可見光熒光，熒光透過薄層板再經(jīng)單色器散射后由檢測器檢測。在固體表面熒光測定中，待測物質(zhì)吸附在固體物質(zhì)的小顆粒上。入射光進(jìn)入固體物質(zhì)而在顆粒的邊界上發(fā)生多重反射，成為漫反射發(fā)生的熒光也在顆粒之間發(fā)生反射，形成了激發(fā)光和熒光兩者的散射。在這樣復(fù)雜的情況下，

34、固體表面發(fā)生的熒光強度除與照射面積和熒光物質(zhì)的數(shù)量有關(guān)外，還受眾多因素的影響，如散射光強度、吸附層厚度、固體顆粒的大小、固體表面對激發(fā)光的吸收、測定的方式、觀測發(fā)光信號的角度等。17.3.2 實驗條件的選擇極選擇依據(jù) 樣品的熒光強度和光譜分布可能與樣品的吸光度和幾何排列有關(guān)。樣品池的最常見排列法為入射光與樣品池成直角，樣品中心發(fā)光。其他的幾何排列法有前表面型和偏離中心型，這些方法通常用于大吸光度和大濁度的樣品。前表面型常被排列為入射光與樣品成45°角。這種排列法的缺點是：反射入發(fā)射單色器的雜散光量大，干擾測量。有人建議采用入射光與樣品成30°角的前表面法，理由是：可減少進(jìn)入

35、發(fā)射單色器的反射光；樣品的光照面積大，可減少樣品位置的敏感性。其缺點是因照射面積大可能降低測量的靈敏度。許金鉤等認(rèn)為，當(dāng)樣品的濃度和厚度不太大時，采用后表面發(fā)光型會更好些。這種方法幾乎可以完全排除發(fā)射光進(jìn)入發(fā)射單色器的可能性。如果樣品的吸光度較大，則樣品的發(fā)射光譜和熒光強度都可能失真；高濃度熒光體的前表面發(fā)光測量亦有失真現(xiàn)象。但是，前表面型的發(fā)光強度與濃度無關(guān)，在這種情況下，所有入射光被液池的近表面吸收。前表面發(fā)光法亦被用來研究懸浮物和血紅蛋白的吸光度，其強度正比于樣品中熒光體的吸光度。17.3.3 實驗影響因素及其排除辦法 在測量溶液的熒光強度時，通常應(yīng)注意溶劑的散射光（瑞利散射和拉曼散射）

36、、膠粒的散射光（丁鐸爾效應(yīng)）以及容器表面的散射光的影響問題。上述幾種散射光除拉曼散射外均具有與激發(fā)光相同的波長。拉曼散射光的波長與激發(fā)波長不同，通常要比激發(fā)波長稍長一些，且隨激發(fā)波長的改變而改變，但與激發(fā)波長維持一定的頻率差。散射光的干擾常是提高熒光靈敏度的主要限制因素，因而實際工作中要注意加以克服。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長和測定波長，可以大大降低或排除散射光的影響。在測量微弱的熒光強度時，常要加大狹縫寬度以獲得足夠的熒光強度測量值，但狹縫加大后散射光的影響也將加大，因而實際測定時應(yīng)選擇合適的狹縫寬度。通過空白測定，亦可對散射光的影響進(jìn)行校正。 下面分別介紹各種環(huán)境因素對熒光光譜和熒光強度的影響及其

37、相應(yīng)的解決辦法。 雖然物質(zhì)產(chǎn)生熒光的能力主要取決于其分子結(jié)構(gòu)，然而環(huán)境因素尤其是介質(zhì)對分子熒光可能產(chǎn)生強烈的影響。了解和利用環(huán)境因素的影響，有助于尋求提高熒光分析法的靈敏度和選擇性的途徑。 溶劑性質(zhì)的影響28-31 同一熒光體在不同的溶劑中，其熒光光譜的位置和強度可能發(fā)生顯著地變化。由于溶液中溶質(zhì)與溶劑分子之間存在著靜電相互作用，而溶質(zhì)分子的基態(tài)與激發(fā)態(tài)又具有不同的電子分布，從而具有不同的偶極矩和極化率，導(dǎo)致基態(tài)和激發(fā)態(tài)兩者與溶劑分子之間的相互作用程度不同，這對熒光的光譜位置和強度有很大影響。很多熒光體，尤其是那些在芳環(huán)上含有極性取代基的熒光體，它們的熒光光譜易受溶劑的影響。溶劑的影響可分為一

38、般的溶劑效應(yīng)和特殊的溶劑效應(yīng)，前者指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響，后者指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用，如形成氫鍵和配合作用。一般的溶劑效應(yīng)是普遍存在的，而特殊的溶劑效應(yīng)則決定于溶劑和熒光體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。特殊的溶劑效應(yīng)所引起的熒光光譜的移動值往往大于一般的溶劑效應(yīng)所引起的。除了一般的和特殊的溶劑效應(yīng)外，某些熒光體由于自身所具有的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可能因為溶劑極性的改變而形成分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)和扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。因此，在做熒光測試時我們應(yīng)選擇合適的溶劑。 介質(zhì)酸堿性的影響29-32 如果熒光物質(zhì)是一種有機酸或弱堿，該弱酸和弱堿的分子及其相應(yīng)的離子，可視為兩種不同的型體，各具有不同的熒光特性（

39、如不同的熒光光譜、熒光量子產(chǎn)率或熒光壽命），溶液的酸堿性變化將使熒光物質(zhì)的兩種不同型體的比例發(fā)生變化，從而對熒光光譜的形狀和強度產(chǎn)生很大的影響?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)溶液的PH值以產(chǎn)生某種所要求的型體，該型體的熒光光譜移動后可與干擾組分的熒光光譜分離開來，達(dá)到提高選擇性的目的。 溫度的影響 溫度對于溶液的熒光強度有著顯著的影響。通常，隨著溫度的降低，溶液的熒光量子產(chǎn)率和熒光強度將增大。在進(jìn)行熒光測定時，由于熒光計光源的溫度相當(dāng)高，容易引起測定溶液的溫度上升，加上分析過程中室溫可能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致熒光強度的變化，因而樣品室四周的溫度在測定過程中應(yīng)盡可能保持恒定。 重原子效應(yīng) 有一類溶劑效應(yīng)，可能影響到溶質(zhì)

40、的熒光強度和磷光強度，但對躍遷的頻率沒有可覺察的影響。這一類溶劑效應(yīng)，既不是由于溶劑的極性，也不是由于溶劑的氫鍵性質(zhì)所引起的，而是由于溶劑分子中含有高原子序的原子所造成的。這種效應(yīng)就是通常所說的“外重原子效應(yīng)”。芳族化合物分子中的重原子取代基團(tuán)，同樣會引起熒光強度減弱、磷光強度增強的現(xiàn)象，這類重原子效應(yīng)通常稱為“內(nèi)重原子效應(yīng)”。 有序介質(zhì)的影響 表面活性劑或環(huán)糊精溶液這樣的有序介質(zhì)，對發(fā)光分子的發(fā)光特性有著顯著的影響，在發(fā)光分析中得到了廣泛的應(yīng)用。表面活性劑一般是非光活性物質(zhì)，毒性小，價格便宜，使用方便，其膠束溶液光學(xué)上透明、穩(wěn)定，對發(fā)光物質(zhì)具有增溶、增敏和增穩(wěn)得作用，實踐證明是提高發(fā)光分析法

41、靈敏度和選擇性的有效途徑之一。環(huán)糊精類化合物的特點是分子結(jié)構(gòu)中存在一個親水的外緣和一個疏水的空腔，其疏水的空腔能與許多有機物結(jié)合形成主客體包和物，這一結(jié)構(gòu)特點是它們獲得廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。某些熒光物質(zhì)分子，它們對于環(huán)糊精的疏水空腔有更大的親和力，如果分子的尺寸大小合適，便能夠與環(huán)糊精分子結(jié)合形成包和物而進(jìn)入環(huán)糊精的腔體。這樣的包和物是穩(wěn)定的，而且能夠增強熒光強度。 其他溶質(zhì)的影響 有機分子的熒光，不僅受到溶劑效應(yīng)的影響，也會因為與其他溶質(zhì)的相互作用而受到影響。例如芳族配位體與金屬離子發(fā)生配位作用之后對配位體的熒光光譜和強度的影響，另外，熒光體還可能與其他溶質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、電荷轉(zhuǎn)移或碰撞作

42、用等過程而導(dǎo)致熒光體的熒光猝滅現(xiàn)象。 17.3.4 對被測樣品的一般要求 很多化合物由于本身具有大的共軛體系和剛性的平面結(jié)構(gòu)，因而具有能發(fā)射熒光的內(nèi)在本質(zhì)，即為熒光化合物。由于其體系自身含有這種熒光團(tuán)而具有內(nèi)源熒光，人們就可以利用其內(nèi)源熒光，通過檢測某種熒光特性參數(shù)的變化，對該體系的某些性質(zhì)加以研究。而如果所要研究的體系本身不含有熒光團(tuán)而不具有內(nèi)源熒光，或者其內(nèi)源性質(zhì)很弱，這時候就必須在體系中外加一種熒光化合物即所謂熒光探針，再通過測量熒光探針的熒光特性的變化來對該體系加以研究。17.3.5 樣品制備方法的一般要求 固體樣品：將樣品充分干燥并研磨成粉末，用稱量紙移至樣品槽內(nèi)，用鑰匙壓平，使槽內(nèi)

43、充滿粉末即可。 溶液：首先配好對應(yīng)比例的溶液，然后將溶液小心轉(zhuǎn)移到比色皿內(nèi)，將比色皿放在支架上，然后一起放入樣品槽內(nèi)，即可準(zhǔn)備測試。17.4 實驗結(jié)果解析 熒光光譜分析法除了可以用作組分的定性檢測和定量測定的手段之外，還被廣泛地作為一種表征技術(shù)應(yīng)用于表征所研究體系的物理、化學(xué)性質(zhì)及其變化情況。例如，在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中，人們經(jīng)常可以利用熒光檢測的手段，通過檢測某種熒光特性參數(shù)（如熒光的波長、強度、偏振和壽命）的變化情況來表征生物大分子在性質(zhì)和構(gòu)象上的變化。17.5 應(yīng)用 直接測定法應(yīng)用于測定許多有機芳族化合物和生物物質(zhì)具有內(nèi)在的熒光性質(zhì)。間接測定法用于測定本身不發(fā)熒光或者因熒光量子產(chǎn)率很低而

44、無法進(jìn)行直接測定的物質(zhì)的熒光性質(zhì)。同步熒光分析法是提高分析選擇性，解決多組分熒光物質(zhì)同時測定的良好手段之一17,33。最早發(fā)展起來的恒波長同步熒光法在一般的熒光光譜儀上均可方便實現(xiàn)，已在環(huán)境、醫(yī)藥、衛(wèi)生和生物等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用，而新近發(fā)展的各種新型同步熒光方法正顯示出獨特的作用，越來越受到人們的重視。由于三維熒光光譜反映了發(fā)光強度同時隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的情況，因而能提供比常規(guī)熒光光譜更完整的光譜信息，可作為一種很有價值的光譜指紋技術(shù)。這種技術(shù)，在環(huán)境監(jiān)測和法庭判證方面，常用于不同油種和來源地鑒別。34-38在臨床化學(xué)方面，已用于某些癌細(xì)胞的熒光代謝物的檢測，以區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞39，

45、用人類血漿的三維熒光光譜作為臨床化學(xué)中一種新的圖形識別法以協(xié)助臨床診斷40，以及用于某些細(xì)菌的鑒別41-44。由于電視熒光計能在極短時間內(nèi)取得測量體系的三維熒光光譜，方法靈敏快速，且可以同時監(jiān)測體系中各種物質(zhì)的反應(yīng)情況，也可用于提供鑒定未知物的信息，因而對化學(xué)反應(yīng)的多組分動力學(xué)研究具有獨特的優(yōu)點，已用于蒽在多氯代鏈烷烴中的光誘導(dǎo)反應(yīng)的研究45。另外三維熒光光譜法也用于多組分混合物的定性和定量分析。時間分辨熒光分析法主要應(yīng)用于金屬配合物熒光受命的測定46-48、熒光體混合物中兩組分的同時測定46-49、痕量分析中干擾物與背景熒光的消除、多環(huán)芳烴的檢測、芳基的檢測50-51和溶劑松弛的時間分辨測量

46、52-54。相分辨熒光分析法主要應(yīng)用于熒光體兩組分混合物中個別組分的熒光光譜的直接記錄和熒光壽命的測定55、相分辨熒光法分辨9-MA、9，10-DPA和POPOP三組分混合物56、基態(tài)反應(yīng)的研究、基態(tài)反應(yīng)可逆性的檢測55、溶劑松弛的分辨57和配位體與大分子的結(jié)合反應(yīng)的分析58。熒光體的熒光偏振與熒光各向異性值的測定，能夠提供與熒光體在激發(fā)態(tài)壽命期間的旋轉(zhuǎn)運動動力學(xué)相關(guān)的信息，為諸如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用，蛋白質(zhì)-DNA健合，抗原-抗體免疫反應(yīng)，以及細(xì)胞膜的流變性等的研究提供理論基礎(chǔ)和實驗技術(shù)。低溫?zé)晒夥治龇ㄖ饕獞?yīng)用于多環(huán)芳烴及衍生物的鑒別和定量分析、煉焦廠分餾水中苯并a芘和苯并a蒽的測定59-60

47、和脫氧核糖核酸（DNA）加和物的分析。固體表面分析具有簡單、快速、取樣量小、靈敏度高、費用少等優(yōu)點，已應(yīng)用于環(huán)境研究、法庭檢測、食品分析、農(nóng)藥分析、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、臨床化學(xué)等方面的工作。近年來電子計算機、激光光源、電視式多道檢測器的采用使固體表面熒光分析有更為廣闊的用途。有關(guān)動力學(xué)熒光分析的應(yīng)用，已出版的書籍和綜述性文章61-64都陸續(xù)有所介紹。熒光顯微技術(shù)已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷65、半導(dǎo)體、微電子器件、高分子材料的生產(chǎn)檢測66和超高靈敏分析67-68等的重要工具。利用共焦熒光法已經(jīng)觀察到空氣水界面上熒光分子隨時間波動的熒光光譜圖。共焦顯微熒光在生物學(xué)研究中的應(yīng)用主要有三方面：1用共焦方式觀察

48、生物樣品。2對生物樣品進(jìn)行光學(xué)連續(xù)“切片”，并實現(xiàn)顯微結(jié)構(gòu)的三維重建。3對生物樣品進(jìn)行定量分析。共焦熒光顯微鏡能幫助醫(yī)生確定組織的層狀結(jié)構(gòu)和診斷反常皮膚生長，分辨樣品的分層結(jié)構(gòu)、各層厚度和各層熒光相關(guān)濃度等，這些都是常規(guī)方法難以做到的。共焦熒光顯微技術(shù)和時間分辨熒光法結(jié)合，可用于測繪空間分辨熒光光衰變曲線和開展熒光動力學(xué)研究；與相關(guān)譜技術(shù)結(jié)合，可測量磷脂系統(tǒng)的擴(kuò)散速度和表面密度69，探測表面結(jié)合熒光物種的微秒級動力學(xué)70等。此外，共焦熒光顯微鏡已應(yīng)用于從單分子水平上觀察和分析DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物71。 全內(nèi)反射熒光法已成為熒光光譜學(xué)在生物化學(xué)應(yīng)用中的重要工具72-74。 單分子檢測在化學(xué)分析、D

49、NA測序、納米材料分析、醫(yī)學(xué)診斷、醫(yī)學(xué)分析、單DNA操縱、活細(xì)胞分析、分子動力學(xué)機理等方面都具有獨特的應(yīng)用價值，對許多科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生了和正在產(chǎn)生著深遠(yuǎn)的影響。單分子水平上的生物分子研究，揭示了生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，單分子熒光檢測尤其在生命科學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景，為生命科學(xué)提供了新的研究手段。 在生化、臨床醫(yī)學(xué)以及環(huán)境分析中，對分析的靈敏度和準(zhǔn)確性要求越來越高，甚至要求單分子檢測。熒光免疫分析法作為一種廣泛采用的生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)，同樣在不斷追求超高靈敏度和操作的自動化，其發(fā)展趨勢主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）高特異性、高親和性抗原和抗體的制備，這是一切免疫分析特異性和靈敏性的基礎(chǔ)。 （2）

50、熒光標(biāo)記物進(jìn)一步更新和相應(yīng)的熒光檢測技術(shù)提高，如能避開背景熒光的長壽熒光（磷光）標(biāo)記物，避免生物本底熒光的近紅外熒光標(biāo)記物、上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記物等。另外，具有信號放大能力的納米標(biāo)記物也是一個重要發(fā)展方向。 （3）與高效分離技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)熒光免疫分析的快速、自動化和多組分同時測定。 （4）實際應(yīng)用中的在線和現(xiàn)場熒光免疫分析。 （5）免疫芯片的實用化以現(xiàn)實微量多組分的免疫分析。 導(dǎo)數(shù)熒光技術(shù)用于蛋白質(zhì)分析和葉綠素a、b和脫鎂葉綠素a、b的定量測定17.6 實驗聚苯胺的熒光光譜測試一、實驗?zāi)康?1、了解FluoroLog-3熒光光譜分析方法的物理和化學(xué)的原理， 2、了解儀器的結(jié)構(gòu)、操作方法、測試原理和

51、定性定量分析方法， 3、通過對聚苯胺的熒光光譜測試實驗，了解聚合物的熒光光譜的紅移現(xiàn)象。二、實驗儀器、設(shè)備名稱及其主要性能參數(shù) 本中心配置的熒光光譜儀是法國Horiba Jobin Yvon生產(chǎn)的FluoroLog-3熒光光譜儀。 該儀器具有以下特點： 計算機控制，界面顯示、儀器能自動記錄熒光光譜； 高分辨率、低雜散光單色系統(tǒng)； 高靈敏度、低噪聲單光子計數(shù)器做接收系統(tǒng)； 采用氙燈作為光源； 配有穩(wěn)定性好、精度高的外光路系統(tǒng)； 配有多種附件，適用于液體、固體樣品的分析。主要參數(shù)及性能指標(biāo)： 波長范圍 200nm-850nm 波長精度 ±0.4nm 波長重復(fù)性0.2nm 狹縫寬度0-2m

52、m連續(xù)可調(diào)，示值精度0.01mm、最大高度20mm 接收單元為單光子計數(shù)器技術(shù)指標(biāo) 靈敏度:穩(wěn)態(tài)測量信噪比S/N5000:1（條件：R928P PMT，5nm帶寬，1s響應(yīng)時間，350nm激發(fā)，397nm水拉曼峰，450nm強度，S/N=（I397-I450）/（I450）1/2）,這是JY的計算方法，在分母中考慮了全部的噪聲。三、實驗輔助設(shè)備、儀器、裝置四、實驗原理（實驗原理、設(shè)備結(jié)構(gòu)及其功能）光源：450W氙燈激發(fā)單色儀樣品室：T-box發(fā)射單色儀檢測儀：R928P PMT （photomultiplier-tube,光電倍增管）五、實驗操作方法（演示性實驗）開機步驟：1、 開啟電源（Po

53、wer）開關(guān)，風(fēng)扇開動；2、 開啟Xe燈電源（Main Lam）開關(guān)；3、 開啟控制器開關(guān)，軟盤啟動，等待至聽到一聲鳴響（約30秒）；4、 開啟操作電腦開關(guān)，運行FluorEssence操作軟件，點擊M系統(tǒng)初始化，進(jìn)入操作界面。系統(tǒng)轉(zhuǎn)換和操作1、由穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換到TCSPC狀態(tài)： 關(guān)閉SPECTRACQ電源。 將PMT信號輸出連接到TB-02前置放大器的輸入端。 拆下穩(wěn)態(tài)樣品箱，換上TCSPC樣品箱。 裝NanoLED。 開IBH Hub 和TB-02前置放大器的電源。 開SPECTRACQ電源，等待軟盤啟動完成。 運行DataStation軟件，系統(tǒng)初始化，選擇TCSPC Lifetime。 做未

54、知樣品的時間衰減曲線。 做熒光散射體（Ludox）的時間衰減曲線。 保存數(shù)據(jù)文件。 運行DAS6軟件，做曲線擬合，得到熒光壽命。2、由TCSPC狀態(tài)轉(zhuǎn)換到穩(wěn)態(tài)： 關(guān)閉SPECTRACQ電源。關(guān)閉IBH Hub 電源和TB-02前置放大器的電源。 將PMT信號輸出連接到DM302的輸入端。 取下NanoLED。 拆下TCSPC樣品箱，換上穩(wěn)態(tài)樣品箱。 開Xe燈風(fēng)扇，電源。 開SPECTRACQ電源。 運行FluorEssence軟件。六、實驗數(shù)據(jù)處理或譜圖解析方法 以苯胺和聚苯胺為例，演示兩種樣品的操作過程，最后得到兩個樣品的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并比較最大發(fā)射波長的移動情況。七、注意事項 1、F

55、L3-TCSPC為精密光譜儀，不得隨意打開機蓋，觸摸反光鏡和光柵表面。 2、開Xe燈前，必須確定計算機、顯示器、打印機、控制器等設(shè)備的電源在關(guān)閉位置。關(guān)Xe燈前，必須先關(guān)閉所有設(shè)備的電源。否則，開、關(guān)Xe燈時產(chǎn)生的尖峰電脈沖會損壞上述設(shè)備。 3、關(guān)Xe燈電源（Main Lamp）后，不能立即關(guān)閉Xe燈的冷卻風(fēng)扇，15分鐘后關(guān)Xe燈主電源（Power）。 4、Xe燈上的4個冷卻出入風(fēng)口必須保持干凈，通風(fēng)良好。每季度的第一個工作日用除塵器將4個通風(fēng)口上的雜物清理干凈。 5、儀器的工作狀態(tài)可以通過測試Xe燈得激發(fā)光譜和純凈水的拉曼光譜檢查。 6、穩(wěn)態(tài)測試時，信號強度不能大于10E+06，如果信號過強

56、：可以將激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫關(guān)?。唤档蚉MT探測器的高壓。 7、系統(tǒng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，由穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換到TCSPC狀態(tài)或由TCSPC狀態(tài)轉(zhuǎn)換到穩(wěn)態(tài)時，必須關(guān)閉系統(tǒng)電源。八、思考及討論 紫外電子吸收光譜、拉曼光譜和熒光光譜的關(guān)系。參 考 文 獻(xiàn)1 慈云祥等. 生命科學(xué)中的熒光光譜分析/高鴻主編. 分析化學(xué)前沿. 北京：科學(xué)出版社，1991；31.2 陳國珍等. 紫外-可見光分光光度法.上冊，北京原子能出版社，1983:99.3 黃賢智等. 光學(xué)與光譜技術(shù)，1986,4:434 Green,G.L.et al.Anal.Chem.,1974,46:2191.5 光機電信息，2003,6:41.6 張景超等.

57、傳感技術(shù)學(xué)報，2002,2:161.7 Nakashima K.et al. Talanta,1984,31:749.8 王尊本等. 環(huán)境化學(xué). 1985,4（3）：61.9 Myint T.et al.Clin. Chem.,1965,11:617.10 歐陽耀國等. 化學(xué)試劑，1986,8:70.11 黃賢智等. 化學(xué)分析，1986,14:348.12 Seybold P.G. et al. Anal. Chem.,1983,55:1996.13 Lloyd J. B. F. Nature(London),1971,231:64.14 Vo-Dinh T. Anal. Chem.,1978,50:396.15 Wehry E. L. Modern Fluorescence Spectroscop