免疫共沉淀實驗原理與方法

1、免疫共沉淀實驗原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation , CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方 法，屬于免疫沉淀技術(shù)的一類，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。免疫共沉淀的設(shè)計理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可能將整個蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來（常說的“ pull - down ）, 進而可以用于鑒定這個蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。免疫共沉淀的特點可以概括為兩點，第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物。免疫共沉淀的優(yōu)勢：與其他研究蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)（如 GST-Pul

2、l down、酵母雙雜交等）相比，免疫共沉淀鑒定的相互作用蛋白是在細胞內(nèi)與目的蛋白發(fā)生的天然結(jié)合，避免了人為的影響，因此符合體內(nèi)實際情況，得到的蛋白可信度更高。免疫共沉淀的局限性和注意事項：1 .免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上，意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測不到；2 .由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后，某些表位就會被掩蓋，因此可能導(dǎo)致使用某一種pulldown 抗體，無論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來，如 有必要最好使用多種不同抗體分別進行CoIP;3 .由于檢測的是天然狀態(tài)，因此在不同的時間和不同的處理下，CoIP拉下來的蛋白復(fù)合物都可能是不

3、同的，當(dāng)然隨著實驗次數(shù)的增加，得到的蛋白復(fù)合物成員也會越來越龐大；4 .如果使用Western Blot的方法檢測的蛋白復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白，則需要在試驗前 進行預(yù)測，具有一定的冒險性；當(dāng)然如果將蛋白復(fù)合物直接進行質(zhì)譜分析就不存在上述問題， 但需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品也非易事，并且成本較高；5 . CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用，進一步區(qū)分 還需要進行GST-Pull down等實驗檢測；6 .為了保證CoIP實驗的可靠性和嚴(yán)謹(jǐn)性，需要使用復(fù)合物的不同成員分別獨立進行 CoIP實驗，并且結(jié)果應(yīng)該能夠彼此驗證，因為原則上使用復(fù)合物的任一成員進行CoIP

4、都會得到其他所有成員1免疫共沉淀的一般操作流程（中英文對照）：.下載可編輯Cell orIncubafion withPrutei 門 MixtL 鹿AnTibmiy<oupl6d ResinACoupled Anti 附g§M and washAritig&riPn?(ein InterCtirVj th An：iy： nAna'V7 P1.用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2 .加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液(107細胞加入1ml);Add

5、in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).1.5EP管中。并置于低3 .用預(yù)冷的細胞刮將細胞從培養(yǎng)介質(zhì)上刮離，并轉(zhuǎn)移到干凈的 速搖床，4c緩慢晃動15min；Scrap cells off to clean 1.5ml eppendorf tubes with a clean, cold scraper.Put them on a low- speed rotating shaker for 15 min at 4° C.4 . 4 C, 14000g離心15min,立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中Centrifuge at 14,00

6、0 g 4° C for 15min, transfer the supernatant to new tubesimmediately.5 .將 Protein A/G-agarose 微球用 PBS 洗兩遍，用 PBS配制成 50%勺 protein A/G- agarose工作液；Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50% proteinA/G agarose working solution (in PBS)6 .在樣品中以每 1ml中加100(11的比例，加入 50%勺Protein

7、A/G agarose工作液。水平搖床4c搖動10min (該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白)Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100科 l for a 1ml sample solution.Shake on horizontal shaker for 10min, 4° C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)7 . 4C , 14000g離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除protein A/G-agraose微球；Cent

8、rifuge 14,000g at 4° C for 15min, transfer the supernatant to new tubesand discard protein A/G-agraose beads8 .使用BCA法或者其他方法測定總蛋白的濃度Quantify total protein with BCA assay or other methods.9 .用PBS各總蛋白稀釋到1 pg/以降低裂解液中去垢劑的濃度。如果你覺得你的 目的蛋白的濃度低了，你可以將總蛋白濃度提高到10 pg/。(假設(shè)濃度夠的話)Dilute the total protein to 1g

9、/l with PBS to decline the concentrationsof detergents. If you feel the concentration of your target protein is low, you can dilute the total protein to 10科 g/ 科 l. (if it ' s high enough)10 .加入一定體積的一抗，至總體積約為500 d l;Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500l totalvolume.

10、C for overnight.11步改為室溫孵育2h;assay for kinase or2h incubation at room11 .用搖床緩慢搖動抗原抗體混合物，4c過夜Slowly shake antigen- antibody complex on rotating shaker at 4注意：如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活測定，則最好將Note: if downstream experiment is enzyme activity phosphatase, it ' s better to change step 11 to a temperature.PBS）

11、洗滌3遍12 . 14000g離心5s,收集沉淀，并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液(或者預(yù)冷的 (每次加入800口)Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilled washing buffer (or cold PBS) for 3 times. (800l each)13 .(用合適體積的上樣緩沖液重懸)收集上清，用于進一步的下游 SDS-PAGEwestern- blot或者質(zhì)譜分析Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or

12、mass spectra analysis.注意：該CoIP操作步驟是將抗體先結(jié)合到Protein A/G-argarose微球上，然后再與抗原混合。相對其他方法，最終的得率較低，但避免了抗體共洗脫的問題。如果你希望獲得高純度的目的蛋白，而不考慮非特異性結(jié)合的話，你可以將抗體和蛋白樣品在加入 Protein A/G-argarose微球之前進行混合，這樣最后抗體也會和目的蛋白一同被洗脫下 來，從而可能會對 western blot檢測造成干擾。Note: This Co-IP protocol is tobind antibody to the Protein A/G-argarosemixb

13、eads and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of target protein regardless of non-specificbinding,you canantibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the ant