EBF3與EGFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HepG2中的表達(dá)

1、EBF3與EGFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HepG2中的表達(dá) 作者：毛麗萍 王惠民, 王躍國, 汪曉鶯【摘要】 目的: 構(gòu)建早期B細(xì)胞因子3（EBF3）與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的融合基因真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 使EBF3EGFP融合蛋白在人肝癌細(xì)胞株HepG2中得到表達(dá)。方法: 采用RTPCR技術(shù), 從人胎盤組織總RNA中逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增出EBF3全長編碼基因, 構(gòu)建EBF3與EGFP的融合基因真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP/EBF3導(dǎo)入HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表達(dá)。結(jié)果: 經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌、 抽提質(zhì)粒、 酶切鑒定和DNA序列

2、分析證實(shí), EBF3基因已正確插入pEGFPN1中EGFP基因的上游, 獲得融合基因表達(dá)載體pEGFP/EBF3。將pEGFP/EBF3導(dǎo)入HepG2細(xì)胞24 h后, 在倒置熒光顯微鏡下可觀察到EBF3EGFP融合蛋白主要表達(dá)于核內(nèi), 轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3和pEGFPN1后48 h的轉(zhuǎn)染效率分別為52%和59%。Western blot證實(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后24 h和48 h細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢出相對分子質(zhì)量（Mr）為87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期細(xì)胞比例均明顯高于pEGFPN1轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組, 表明EBF3

3、基因的導(dǎo)入可誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期向G2期發(fā)展, 從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論: 成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 并在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá), 為進(jìn)一步研究EBF3的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 早期B細(xì)胞因子3; 融合蛋白; 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白; HepG2細(xì)胞 Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression vector for early human Bcell factor 3(EBF3) fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and expre

4、ss the fusion protein EBF3EGFP in HepG2 cells. METHODS: The intact EBF3 gene was amplified from RNA isolated from the placental tissue by RTPCR. Then it was inserted into the pEGFPN1 vector to construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP/EBF3. The fusion protein EBF3EGFP was expresse

5、d in HepG2 cells by the transfection of pEGFP/EBF3 into the cells. RESULTS: The pEGFP/EBF3 recombinant expression vector was constructed and confirmed by DNA sequencing, enzymatic digestion and PCR identification. 24 h after the fusion protein EBF3EGFP was transfected wiht pEGFP/EBF3, it was observe

6、d mainly in the cellular nucleus under the inverted fluorescence microscope. Both pEGFP/EBF3 and pEGFPN1 were transfected into human HepG2 cells. 24 h after the transfection, the proportion of transfection was about 52% and 59%, respectively. Western blot analysis confirmed that the EBF3EGFP fusion

7、proteins of Mr 87 000 were detected in the cytoplasmic and nuclear protein of HepG2 transfected with pEGFP/EBF3 for 24 h or 48 h. The cell proportion in S phase increased in HepG2 cells transfected with pEGFP/EBF3 in comparison with HepG2 cells transfected with pEGFPN1 or untransfected. These findin

8、gs suggested that the transfection of EBF3 gene into HepG2 induced the cell proliferation from G1 phase to G2 phase by increasing the number of cells. CONCLUSION: The construction of pEGFP/EBF3 eukaryotic expression vector and the expression of EBF3EGFP fusion protein in HepG2 cells lay a foundation

9、 for further study of the relationship between EBF3 and its growth and the proliferation of tumor cells. Keywordsearly Bcell factor 3; recombinant fusion protein; EGFP; HepG2 cell 摘 要 目的: 構(gòu)建早期B細(xì)胞因子3（EBF3）與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的融合基因真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 使EBF3EGFP融合蛋白在人肝癌細(xì)胞株HepG2中得到表達(dá)。方法: 采用RTPCR技術(shù), 從人胎盤組織總RNA中

10、逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增出EBF3全長編碼基因, 構(gòu)建EBF3與EGFP的融合基因真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP/EBF3導(dǎo)入HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表達(dá)。結(jié)果: 經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌、 抽提質(zhì)粒、 酶切鑒定和DNA序列分析證實(shí), EBF3基因已正確插入pEGFPN1中EGFP基因的上游, 獲得融合基因表達(dá)載體pEGFP/EBF3。將pEGFP/EBF3導(dǎo)入HepG2細(xì)胞24 h后, 在倒置熒光顯微鏡下可觀察到EBF3EGFP融合蛋白主要表達(dá)于核內(nèi), 轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3和pEGFPN1后48 h的轉(zhuǎn)染效率分別為52%和59%。Western blot證實(shí)轉(zhuǎn)

11、染pEGFP/EBF3后24 h和48 h細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢出相對分子質(zhì)量（Mr）為87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期細(xì)胞比例均明顯高于pEGFPN1轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組, 表明EBF3基因的導(dǎo)入可誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期向G2期發(fā)展, 從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論: 成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 并在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá), 為進(jìn)一步研究EBF3的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞早期B細(xì)胞因子3; 融合蛋白; 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白; HepG2細(xì)胞 早期B細(xì)胞因子3（early Bcell factor 3 , EBF3）是轉(zhuǎn)錄

12、因子EBF家族成員之一, 1997年由Wang等1利用序列同源性篩選的方法在鼠胚胎cDNA文庫中發(fā)現(xiàn), 人EBF3由551個(gè)氨基酸殘基組成, 相對分子質(zhì)量（Mr）約為60 000, mRNA全長為4 361 bp, 基因定位于染色體10q26.3。Zardo等2研究發(fā)現(xiàn)EBF3 mRNA廣泛表達(dá)于心臟、 胎盤、 肝臟、 骨骼肌等組織, 在大多數(shù)WHO組織病理學(xué)的分級標(biāo)準(zhǔn)中分級高的原發(fā)性腦腫瘤病例EBF3被復(fù)等位地甲基化和/或被刪除, 與此一致的是EBF3表達(dá)于正常的人腦細(xì)胞系, 在腦腫瘤細(xì)胞系中沉默。Zhao等3研究提示EBF3可能是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子。原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一。

13、為探討EBF3在肝腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用, 我們采用RTPCR方法從人胎盤組織總RNA中逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增出EBF3基因的全長編碼區(qū)序列, 構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）與EBF3的融合基因真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3, 轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表達(dá), 并通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期的變化。 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株（HepG2）由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院陳瑜惠贈(zèng)。真核表達(dá)載體pEGFPN1由本室保存; 限制性內(nèi)切酶Hind 和BamH 、 dNTPs購自Promega公司; T4 DNA連接酶購自New England

14、Bio公司; TRIzol試劑、 SuperScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、 質(zhì)粒抽提純化試劑盒、 LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司; PhusionTM Hot Start高保真DNA聚合酶購自Finnzymes公司; 膠回收試劑盒購自上海華舜公司; DNA marker DL 2 000購自TaKaRa公司; RPMI1640培養(yǎng)液購自南京凱基公司; 胎牛血清購自Gibco公司; 倒置熒光顯微鏡購自Leica公司; 流式細(xì)胞儀購自BD FACSCalibur公司。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、 cocktail酶抑制劑購自Pierce公司; Wes

15、tern blot化學(xué)發(fā)光ECL試劑購自北京普利萊公司; 電泳及電轉(zhuǎn)移儀購自BioRad公司; 小鼠抗人EBF3單克隆抗體（mAb）購自Abnova公司; PVDF膜、 二喹啉甲酸（BCA）法蛋白濃度測定試劑盒、 小鼠抗人Tubulin mAb、 兔抗GFP抗體、 HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所; 小鼠抗人Lamin B mAb購自Calbiochem公司; HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗購自Jackson公司; RNase A、 碘化丙啶購自南京生興公司。 1.2 方法 1.2.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP/EBF3 根據(jù)GenBank收錄的人EBF3 mRNA（N

16、M001005463）基因5端序列并在ATG前加入Kozak序列（GCCACC）以提高翻譯起始效率, 并在5引入Hind 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基, 設(shè)計(jì)前向引物為5CCAAAAGCTTGCCACCATGTTTGGGATTCAGGAG3。逆向引物設(shè)計(jì)時(shí), 將人EBF3的終止密碼子刪除并使其閱讀框與下游的EGFP基因一致, 在5加入BamH 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基, 其序列為5CGTCGGATCCCGCATTGGCGGGACTACCAGC3。引物由上海生工公司合成。提取人胎盤組織總RNA, 紫外分光分析儀確定RNA純度和濃度, 取總RNA 4 g以隨機(jī)六聚體為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 取cDNA 2 L為模板,

17、PCR擴(kuò)增并膠回收目的產(chǎn)物, EBF3全長編碼區(qū)PCR產(chǎn)物和pEGFPN1同時(shí)用Hind 和BamH 雙酶切, 膠回收酶切片段, 再用T4 DNA連接酶將二者在16連接16 h, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5, 涂布于含30 mg/L卡那霉素的篩選LB培養(yǎng)基上, 經(jīng)挑取克隆, 抽提質(zhì)粒, 酶切鑒定, 陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)測序鑒定。測序由上海捷瑞公司完成。 1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM 2000試劑盒。含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)液將HepG2置37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 用RPMI1640培養(yǎng)液無血清饑餓培養(yǎng)HepG2

18、細(xì)胞24 h, 使細(xì)胞周期基本同步在G1期, 換含100 mL/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h, 細(xì)胞按1108/L的細(xì)胞量接種12或6孔培養(yǎng)板, 培養(yǎng)24 h, 按試劑說明書步驟轉(zhuǎn)染, 6 h后換含100 mL/L FBS無雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2472 h。收獲6孔板細(xì)胞用于Western blot分析, 收獲12孔板細(xì)胞用于細(xì)胞周期分析。 1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞EGFP表達(dá)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率 將pEGFP/EBF3、 pEGFPN1轉(zhuǎn)染后24 h、 48 h及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞置倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP陽性細(xì)胞, 并初步確定融合蛋白的亞細(xì)胞定

19、位。胰酶消化, 粗略調(diào)整細(xì)胞密度為11085108/L之間, 血球計(jì)數(shù)板普通視野下計(jì)細(xì)胞數(shù)A, 換熒光下相同視野計(jì)熒光細(xì)胞數(shù)a, 計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染效率a/A100%）。 1.2.4 Western blot確證EBF3EGFP融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位 胰酶消化轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1 24 h、 48 h及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞, PBS洗滌2次后按細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明書分別提取細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核蛋白, BCA法測定蛋白濃度, 蛋白與5上樣緩沖液混合煮沸5 min后, 取20 g核蛋白、 60 g胞質(zhì)蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳。

20、電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 用TBST緩沖液（20 mmol/L Tris HCl, 150 mmol/L NaCl和0.5 mL/L Tween 20）洗膜3次, 每次5 min, 用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液4封閉過夜。棄去封閉液, TBST洗膜3次, 每次5 min, 然后于4過液結(jié)合一抗。TBST洗膜5次, 每次5 min, 再加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗4孵育2 h, TBST洗膜3次, 每次5 min, 暗室中應(yīng)用ECL發(fā)光液覆蓋膜2 min, X光膠片曝光, 顯影, 定影。PVDF膜浸沒于蛋白印跡膜再生液Stripping buffer（62.5 mmol/L TrisH

21、Cl pH6.8, 100 mmol/L 巰基乙醇, 20 g/L SDS）, 搖床緩慢振搖再生20 min, TBST洗膜3次, 每次5 min, 再用封閉液封閉后可進(jìn)一步檢測其他抗原帶。分別以tubulin、 Lamin B作為細(xì)胞質(zhì)蛋白、 核蛋白上樣量校準(zhǔn)品。 1.2.5 FCM分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期 胰酶消化轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1后24 h、 48 h、 72 h及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞, PBS洗滌2次后用-20預(yù)冷的700 mL/L無水乙醇于-20固定過夜。離心除去固定液, PBS洗滌2次后加PI染液（檸檬酸三鈉100 mg, Triton X100 300 L, P

22、I 10 mg, RNase A 2 mg, 加蒸餾水至100 mL, 4避光保存）400 L, 混勻, 室溫避光20 min, 300目尼龍膜過濾, FCM分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 取均值報(bào)告。 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用STATA7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xs表示, 采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析, P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 pEGFP/EBF3融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 依據(jù)GenBank收錄的人EBF3 mRNA（NM001005463）設(shè)計(jì)并合成ATG前帶有Kozak序列的上游引物, 刪除了終止密碼子的下游引物, 以隨機(jī)六聚

23、體為引物對胎盤總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, PCR擴(kuò)增cDNA, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 結(jié)果在約1 700 bp處有一特異性條帶, 與目的基因相符, 膠回收目的產(chǎn)物, Hind 和BamH 雙酶切回收產(chǎn)物和pEGFPN1, 連接, 轉(zhuǎn)化DH5, 挑取克隆, 抽提質(zhì)粒, 酶切鑒定, 酶切產(chǎn)物分析見圖1。陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)測序鑒定, 結(jié)果顯示288 nt處由a突變?yōu)閏, 即密碼子agg突變?yōu)閏gg, 由于氨基酸編碼的簡并性, agg和cgg均編碼精氨酸, 不影響融合蛋白的正確表達(dá)。重組質(zhì)粒命名為pEGFP/EBF3, 其表達(dá)的融合蛋白命名為EBF3EGFP。 2.2 倒置熒光顯微鏡觀察

24、細(xì)胞EGFP表達(dá)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP/EBF3、 pEGFPN1分別轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞后24 h, 倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP陽性細(xì)胞并初步確定融合蛋白的亞細(xì)胞定位（圖2）?？蛰d體pEGFPN1轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中EGFP蛋白呈全細(xì)胞表達(dá), 而pEGFP/EBF3轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中EBF3EGFP融合蛋白則主要表達(dá)于核內(nèi), 當(dāng)細(xì)胞處于G1和M期時(shí)可清楚地觀察到融合蛋白完全表達(dá)于核內(nèi)。轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1后24 h, 轉(zhuǎn)染效率分別為41%和45%, 48 h后, 轉(zhuǎn)染效率分別為52%和59%, 但轉(zhuǎn)染效率從轉(zhuǎn)染48 h達(dá)到峰值后開始下降。

25、2.3 Western blot確證EBF3EGFP融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位結(jié)果 分別提取pEGFP/EBF3、 pEGFPN1轉(zhuǎn)染后24 h、 48 h及未轉(zhuǎn)染的HepG2的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白。Western blot檢測其中EGFP、 EBF3EGFP融合蛋白的表達(dá)（圖3）。分別以tubulin、 Lamin B作為細(xì)胞質(zhì)蛋白、 核蛋白上樣量校準(zhǔn)品, 結(jié)果顯示在細(xì)胞質(zhì)蛋白中幾乎檢測不出核內(nèi)參Lamin B條帶, 在細(xì)胞核蛋白中細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參tubulin條帶非常纖細(xì)淺淡, 說明細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白相互污染較少。EBF3EGFP融合蛋白條帶略小于預(yù)染蛋白質(zhì)Mr標(biāo)準(zhǔn)90 000, 與預(yù)計(jì)結(jié)果（E

26、BF3 60 000+GFP 27 000）87 000相符。轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后24 h和48 h細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢出Mr 87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)染后48 h融合蛋白斷裂或降解而出現(xiàn)Mr 27 000的GFP條帶, 而在細(xì)胞核中該條帶在轉(zhuǎn)染后24 h就顯現(xiàn)。在轉(zhuǎn)染pEGFPN1和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白中均未檢出Mr 87 000的融合蛋白條帶, 在轉(zhuǎn)染pEGFPN1后24 h和48 h細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢出Mr 27 000的GFP條帶。結(jié)果說明EBF3EGFP融合蛋白是在細(xì)胞質(zhì)中合成后由EBF3核定位信號引導(dǎo)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入核, 而GFP由于Mr&

27、lt;40 000, 能自由通過核孔復(fù)合體而在胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可檢出。 2.4 細(xì)胞周期檢測結(jié)果 FCM分析細(xì)胞周期結(jié)果（表1）表明, 空載體pEGFPN1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期與未轉(zhuǎn)染對照組相比未發(fā)生明顯改變, 而pEGFP/EBF3和pEGFPN1組相比, 在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞各期比例基本相似, 在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后, 轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染pEGFPN1的細(xì)胞G1期細(xì)胞明顯減少, S期明顯增加, G2/M期變化不大。表明EBF3基因的導(dǎo)入改變了細(xì)胞周期, 促進(jìn)了細(xì)胞增殖, 而且轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后G2/M比例未見增加, 說明轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后未引起細(xì)胞周期阻

28、滯在G2/M期。 表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間細(xì)胞周期變化 3 討論 實(shí)驗(yàn)所選用的真核表達(dá)載體pEGFPN1中帶有EGFP序列, 是比GFP熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的一種GFP“紅移”突變體, 其熒光蛋白的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和507 nm, EGFP已成為蛋白質(zhì)分子定位和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的生物標(biāo)志分子4, 5。克隆在pEGFPN1中的外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后, 能通過觀察熒光細(xì)胞而檢測出細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白定位。 Zardo和Zhao等2, 3的研究結(jié)果提示EBF3可能是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子, Zhao還發(fā)現(xiàn)EBF3在75%（6/8）的肝癌細(xì)胞系中基因沉默。為了進(jìn)一步探索EBF3在肝癌發(fā)生發(fā)

29、展中的作用, 本研究中, 我們采用不表達(dá)EBF3的HepG2細(xì)胞作為研究用細(xì)胞株, 利用含CMV強(qiáng)啟動(dòng)子（PCMV IE）的pEGFPN1質(zhì)粒, 在ATG前添加Kozak序列及刪除了終止密碼子的EBF3全部編碼區(qū)PCR產(chǎn)物克隆至pEGFPN1, 在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下, 將pEGFP/EBF3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞, 并使EBF3EGFP融合蛋白獲得表達(dá)。通過倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)EBF3EGFP融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi), 當(dāng)細(xì)胞處于G1和M期時(shí)可清楚地觀察到融合蛋白完全表達(dá)于核內(nèi)。FCM分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示, 在轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, G1期細(xì)胞比例明顯減少, S期明顯增

30、加, G2/M期變化不大, 表明EBF3基因的導(dǎo)入改變了細(xì)胞周期, 促進(jìn)了細(xì)胞增殖, 并且轉(zhuǎn)染pEGFP/EBF3后未引起細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。研究結(jié)果與我們的前期研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中EBF3 mRNA及其蛋白表達(dá)均高于遠(yuǎn)端配對非癌肝組織結(jié)果相符（結(jié)果另文發(fā)表）, 與Zhao等3將重組腺病毒AdEBF3轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞株Saos2發(fā)現(xiàn)的EBF3的導(dǎo)入使細(xì)胞周期阻滯和發(fā)生凋亡結(jié)果不一致, 可能與EBF3對不同細(xì)胞株的作用存在差異有關(guān)。我們還推測EBF3是一個(gè)大Mr蛋白（60 000）, 與EGFP形成的融合蛋白彼此之間緊密相連, 在空間結(jié)構(gòu)上可能存在相互作用, 影響了EBF3羧基端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的充分發(fā)揮, 如果在2個(gè)蛋白之間設(shè)計(jì)加上非極性甘氨酸短片段, 可能有助于消除二者在空間上的相互作用6。 總之, pEGFP/EBF3融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HepG2細(xì)胞中的有效表達(dá), 為今后亞克隆至其他載體, 進(jìn)一步研究EBF3對細(xì)胞生長增殖的影響、 探討EBF3在肝癌及其他腫瘤發(fā)生中的作用, 尋找更好的預(yù)測指標(biāo)和干預(yù)治療靶點(diǎn)提供參考。 致謝: 誠摯感謝南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所吳小梅老師、 南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液病研究室丁潤生主任在實(shí)驗(yàn)過程中所給予的熱心幫助。【參考文獻(xiàn)】 1 Wang SS, Tsai