感受態(tài)細(xì)胞的制備(DH5α大腸桿菌)

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備（DH5）一、 籌備工作全部試劑、容器均需提前預(yù)冷。1、實(shí)驗(yàn)器械4離心機(jī)（50ml離心管），37恒溫箱，37搖床，超凈臺(tái)（使用前需要紫外消毒15min至少）；0.22m的濾器2個(gè)（過(guò)濾滅菌TfB2種溶液），10ml注射器2個(gè)；冰盒；高壓滅菌的1.5mlEP管1盒，與離心機(jī)配套的50ml離心管6個(gè)（高壓滅菌），高壓滅菌的500ml錐形瓶2個(gè)，高壓滅菌的100ml玻璃瓶2個(gè)，高壓滅菌的1ml槍頭和200l槍頭各一盒。2、試劑配制（甘油特別難吸，用藍(lán)槍頭漸漸吸吧） LB平板：?jiǎn)渭僉B平板，加有amp或有kana的（制板時(shí)需標(biāo)注好類型，時(shí)間）。 SOB培育基（Super Optimal

2、 Broth） TfB：（100ml制備量）分別稱取乙酸鉀0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml燒杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，搖晃，使其全部溶解。然后在平安櫥中用孔徑為0.22m的濾器過(guò)濾混合液，置于高壓滅菌的100ml玻璃瓶中，4保存，使用前必須預(yù)冷。（裝在50ml離心管，封口4度保存） TfB（20ml制備量，每次現(xiàn)用現(xiàn)配，裝在50ml離心管）：分別稱取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml燒杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 搖晃，使其全部溶解。然后在平安櫥中用孔徑

3、為0.22m的濾器過(guò)濾混合液，使用前必須預(yù)冷。終體積TFB1濃度100ml200 ml250 ml1LKAcKClCaCl2MnCl2·4H2OGlycerol30 mM100 mM10 mM150 mM15%0.249g0.146g0.111g0.99g15ml0.588 g0.292 g0.223 g1.98 g30 ml0.623 g0.365 g0.278 g2.475g37.5 ml2.49 g1.46 g1.11 g9.9 g150 ml先用部分去離子水溶解，后定容至要求體積。用0.2 M醋酸調(diào)pH值至5.8（特別關(guān)鍵），用針式過(guò)濾器過(guò)濾除菌，4度保存。TFB2濃度20m

4、l200 mlMOPSCaCl2KClGlycerol10 mM75 mM10 mM15%0.042g0.164g0.015g3ml0.42g1.64 g0.15g30 ml先用部分去離子水溶解，后定容至要求體積。用1 M KOH調(diào)pH值至6.5，用針式過(guò)濾器過(guò)濾除菌，放在冰上當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用SOB培育基 配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml離心管分裝） 在90 ml的去離子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml離心管分裝） 在90 ml去離子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高

5、溫高壓滅菌。 3.稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Tryptone20 gYeast Extract5 gNaCl0.5 g 4.加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到燒杯中。 6.滴加NaOH小塊，調(diào)節(jié)pH值至7.0。 7.加入去離子水將培育基定容至l L。 8.高溫高壓滅菌后，4保存。 9.使用前加入5 ml滅菌的2 M MgCl2溶液。LB培育基配制量 1 L配制方法 1.稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?3

6、.滴加固體 NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.0。 4.加去離子水將培育基定容至1 L。 5高溫高壓滅菌后，4度保存。二、 實(shí)驗(yàn)步驟1、第一天：下午3點(diǎn)取出-80°的感受態(tài)細(xì)胞DH5a，冰浴，用槍頭沾一點(diǎn)（就可以帶出很多細(xì)菌，剩余的不要了），在500ul的LB液體培育基中吹打（輕柔），取50ul至另一個(gè)500ul的LB中再稀釋，取100ul涂板。37度恒溫箱培育過(guò)夜約16h（簡(jiǎn)略時(shí)間觀察單克隆，可以順利挑菌就行）。2、 其次天早上，觀察是否長(zhǎng)出單個(gè)菌落，菌落大小合適時(shí)，向2個(gè)無(wú)菌的搖菌管分別加入5ml高壓過(guò)的SOB培育液，標(biāo)注為對(duì)比管和DH5管。從LB平板上挑取單個(gè)菌落加入DH5管中，220

7、rpm，37，5h，OD550達(dá)0.3，將5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，3.5h后，OD550達(dá)0.36（T43.7%），取出冰上放置5min；3、 將100ml菌液轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心瓶中（平底），spin 3K,5,4，倒凈上清，倒置于吸水紙上吸干剩余上清。之后步驟必須冰上進(jìn)行，鹽處理細(xì)胞后，操作輕柔;4、 每管加入20ml TbfI 重懸，輕柔操作，冰上放置5, spin 3K,5,4。倒去上清，并倒置于吸水紙上;5、 每管加入2ml Tbf ll 重懸，輕柔操作，冰上放置15;6、 每管50ul 分裝。液氮速凍，-80度儲(chǔ)存，標(biāo)明制作日期，細(xì)菌種類;7、留出一管做鑒定，分別直接涂布陰性，含AMP，含Kana的板子；再分別轉(zhuǎn)化抗AMP和抗Kana的質(zhì)粒，分別涂布含AMP，含Kana的板子，其次天驗(yàn)證感受態(tài)狀態(tài)。8、正常感受態(tài)在陰性板子中長(zhǎng)，在含AMP，含Kana的板子中不長(zhǎng)；轉(zhuǎn)化抗AMP和抗Kana的質(zhì)粒后分別后分別在含AMP，含Kana的板子中生長(zhǎng)。（每個(gè)都需涂2個(gè)板，含AMP，含Kana的板子）內(nèi)容總結(jié)（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備（DH5）籌備工作全部試劑、容器均需提前預(yù)冷（2）0.22m的濾器2個(gè)（過(guò)濾滅菌TfB2種溶液），10ml注射器