斑馬魚的軟骨發(fā)育及其礦化過程

1、摘要斑馬魚，作為發(fā)育生物學(xué)商量的最佳脊椎動(dòng)物模型，為人類的相關(guān)商量供應(yīng)了重要的參考依據(jù)。本文主要商量了斑馬魚幼體的軟骨，特別是脊椎軟骨的發(fā)育過程及其軟骨的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。為轉(zhuǎn)基因、基因突變魚類的商量供應(yīng)了對(duì)比依據(jù)。本文主要商量了斑馬魚脊椎軟骨的發(fā)育進(jìn)程，以及軟骨細(xì)胞特別是脊索旁軟骨的排列，形貌，大小及其顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和中胚層分化的顯微形貌。斑馬魚脊椎軟骨在配卵后23天開頭發(fā)育，圍繞在脊索周圍，并逐漸向神經(jīng)管和血管方向延長。斑馬魚脊椎軟骨沿體節(jié)發(fā)育，腹部以前的體節(jié)在6天已基本分化為軟骨細(xì)胞，并且隨著時(shí)間的推移，沿體節(jié)向尾部方向的生骨節(jié)逐步分化為軟骨細(xì)胞，在1個(gè)半月左右的時(shí)間，軟骨組織的分化基本完成。

2、斑馬魚的軟骨組織排列整齊，大多數(shù)細(xì)胞大小在520m范圍內(nèi)。斑馬魚的軟骨組織為透明軟骨，膠原纖維為II型膠原，沒有典型的周期結(jié)構(gòu)，含量很少。在TEM的觀察中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的肌肉組織分化較早，在3天已基本分化完成。而體干部的脊索旁仍為中胚層的間葉細(xì)胞，為軟骨細(xì)胞的原基，在分化成軟骨細(xì)胞的過程中，首先是在外形和排列上趨于整齊和規(guī)章。斑馬魚的骨化方式為軟骨骨化。軟骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富含大量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在細(xì)胞質(zhì)中還有大量直徑為100-400nm的囊泡，緊密排列在一起，起傳輸物質(zhì)的作用。此外，脊髓處的細(xì)胞，其細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)很少，有別于軟骨細(xì)胞。并且該處細(xì)胞有部分已死亡，被其它細(xì)胞所代替。關(guān)鍵詞：軟骨

3、細(xì)胞，發(fā)育，顯微結(jié)構(gòu)AbstractZebrafish provides an important referenced foundation for the relative research as the best pattern of vertebrate in developing biology. In this paper the process of development and the ultrastructure of the cartilage especially the parachordal cartilage in zebrafish larva are inve

4、stigated . And that supply the contradistinctive basis for the research about transgenic and gene mutation fishes.Here we investigate the developing process of parachordal cartilage and chondrocyte arrangements,shapes ,size,and ultrastrcture .In zebrafish parachordal cartilage begin to form at 2-3 d

5、ays postfertilization ,and surround the notochord and extend gradually to spinal cord and dorsal aorta. Parachordal cartilage develop along somite and at 6 days postfertilization the somite before venter have differentiated and all accomplish differentation on the whole about at one and a half month

6、 postfertilization .The chontrocytes arrange regular .The size of chontrocytes is between 5-20m mostly. In zebrafish the cartilage is hyaline cartilage and the collagen fibrils is predominantly II type fibrils. And that are relatively thin and do not display the characteristic 67nm banding.We discov

7、ered that the differentiation of musculature is more earlier than cartilage by TEM and that accomplished basically at 3 days postfertilization. During the differentiation of cartilage the shape and arrangement of mesenchymal cell in mesoblast go to orderliness and regular gradually at first. With th

8、e electron microscope ,the active cartilage cell is seen to contain numerous slick endoplasmic reticulum,mitochondria and vesicles which arrange together in order and the diameter of these vesicles is about 100-400nm, transmitting the substance. Furthermore, the nucleolus of spinal cord cells is mor

9、e larger and we also can observe that some cells have dead. Keywords : cartilage ,development, ultrastrcture第一章. 前言由于軟骨細(xì)胞所致的成骨活動(dòng)發(fā)生較早，所以對(duì)斑馬魚軟骨發(fā)育的商量在骨損傷修復(fù)過程中對(duì)骨力學(xué)功能恢復(fù)有較大意義。同時(shí)，生疏軟骨組織的發(fā)育過程及其形貌特點(diǎn)，對(duì)于生疏生物礦化的過程和機(jī)制有很大的幫助意義。生物礦化本質(zhì)上是一個(gè)受基因精確表達(dá)與調(diào)控的過程，因此商量礦化基質(zhì)蛋白的基因位點(diǎn)和基因表達(dá)調(diào)制的細(xì)節(jié)，商量基因調(diào)控下的生物礦化過程將是搞清礦化掌握機(jī)理的根本解決途徑。從分子水平

10、上商量軟骨、骨的發(fā)育及礦化機(jī)制不僅使我們的生疏更深化，同時(shí)對(duì)于骨的損傷修復(fù)及仿生材料的制備有很大的指導(dǎo)意義。關(guān)于斑馬魚脊椎軟骨的發(fā)育過程的商量報(bào)道很少。斑馬魚脊椎軟骨發(fā)育的開頭時(shí)期約為配卵后2- 3天左右，主要集中在體節(jié)的前端。目前，關(guān)于脊椎軟骨的形貌觀察主要在組織水平上，未有從分子水平上的進(jìn)一步商量。所以搞清斑馬魚脊椎軟骨的發(fā)育進(jìn)程和顯微結(jié)構(gòu)是商量轉(zhuǎn)基因和基因突變斑馬魚軟骨結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)和前提，為從分子水平上的進(jìn)一步商量供應(yīng)了重要的對(duì)比依據(jù)。其次章文獻(xiàn)綜述§1.硬骨魚的胚胎發(fā)育§1.1 卵裂、囊胚及原腸胚的形成§1.1.1 卵裂卵受精后發(fā)生卵質(zhì)分離，使細(xì)胞質(zhì)與卵

11、黃明顯分開，細(xì)胞質(zhì)集中于動(dòng)物極形成一帽狀的胚盤，后者與圍于卵黃四周一層很薄的稱為卵黃細(xì)胞質(zhì)層（yolk cytoplasm layer）的細(xì)胞質(zhì)相連。圖2-1卵裂為盤狀卵裂。第一次卵裂的分裂溝自動(dòng)物極向下但不達(dá)到胚盤的底面，因此在胚盤底部還有一薄層細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)間橋）使分裂球彼此相連。其次次卵裂則與第一次卵裂相互垂直，形成大小相像的4個(gè)細(xì)胞。第三次卵裂有兩個(gè)卵裂面，都與第一次平行，結(jié)果形成4排，每排為4個(gè)分裂球的16個(gè)細(xì)胞。這三次卵裂的分裂溝與第一次一樣都達(dá)不到胚盤底面，因此分裂球之間在底部仍通過細(xì)胞質(zhì)間橋彼此相連。從第五次分裂起，卵裂面漸漸不整齊，細(xì)胞大小也不一樣。有的魚類從第五次卵裂時(shí)，中

12、央幾個(gè)分裂球成切線裂，即分裂面與胚盤表面平行，將分裂球分為上下兩層，上層分裂球?yàn)橥暾募?xì)胞，下層分裂球的底部仍舊沒有質(zhì)膜包圍，通過細(xì)胞質(zhì)間橋與相鄰的分裂球以及與卵黃細(xì)胞質(zhì)層相連。在斑馬魚，第五次卵裂后只有胚盤邊緣的細(xì)胞通過細(xì)胞質(zhì)間橋與卵黃細(xì)胞質(zhì)層相連，直到第十次卵裂都是這種情況。位于胚盤下面的腔稱為胚盤下腔（subgerminal cavity）。§1.1.2 囊胚隨著卵裂的不斷進(jìn)行，胚盤分裂球數(shù)量日益增多，稱為被膜層，它是一連續(xù)的細(xì)胞層，細(xì)胞排列較為緊密，其邊緣附著于表胚層上；另一部分位于被膜層下，為一群疏松的細(xì)胞團(tuán)，稱為深層細(xì)胞。在深層細(xì)胞與卵黃之間的空腔稱為囊胚腔。在胚盤下面卵

13、黃表面為一層非細(xì)胞層（也即最早位于卵黃四周的卵黃細(xì)胞質(zhì)層）稱為表胚層或卵黃融合層（yolk syncytical layer），由于它有很多核但無質(zhì)膜相間隔，所以又稱為卵黃多核體。表胚層可分為內(nèi)表胚層和外表胚層：前者指位于胚盤下的部分；后者指位于與胚盤四周相連部分。外表胚層向外與包在卵黃外的卵黃細(xì)胞質(zhì)層相連。表胚層的形成過程，在斑馬魚已經(jīng)商量清晰，它是在第九次卵裂后開頭形成，在第十次卵裂結(jié)束時(shí)完成。第九次卵裂后與卵黃細(xì)胞質(zhì)層相連的胚盤的邊緣細(xì)胞界限逐漸消失，邊緣細(xì)胞似乎倒坍到卵黃細(xì)胞層中，致使此層明顯加厚。邊緣細(xì)胞的細(xì)胞核通過有絲分裂不斷增加核的數(shù)量，而形成卵黃多核體，就這樣形成了表胚層。表胚

14、層的主要作用有三：將消化卵黃的物質(zhì)傳遞到分裂腔（囊胚腔），然后被分裂球利用；作為胚盤和卵黃之間的過渡地區(qū)；作為原腸作用時(shí)胚環(huán)的細(xì)胞外包擴(kuò)展的附著基質(zhì)。§1.1.3 原腸胚的形成硬骨魚原腸作用最明顯的特點(diǎn)是外包和集中。斑馬魚囊胚時(shí)胚盤也是由被膜層細(xì)胞和深層細(xì)胞組成。原腸作用開頭時(shí)，與外包的同時(shí)，胚盤邊緣的深層細(xì)胞發(fā)生內(nèi)卷，由于這種內(nèi)卷作用使胚盤分為上胚層（將來成為胚胎的外胚層）和下胚層（將來成為胚胎的中胚層和內(nèi)胚層）。在深層細(xì)胞發(fā)生內(nèi)卷的同時(shí)，上、下胚層細(xì)胞向原腸胚的背部集中和伸展而形成胚盾。胚環(huán)形成后可分為上、下兩層：上胚層和下胚層。上胚層包在卵黃之外，形成卵黃囊的外胚層和中胚層；下

15、胚層細(xì)胞則不斷向胚盾集中，形成正在不斷增長的胚胎的中胚層，這點(diǎn)與兩棲類和鳥類胚孔形成時(shí)的形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)是不同的。胚盤外包首先是由于外表胚層的皮層中的微絲網(wǎng)發(fā)生收縮，使其表面卷曲變狹，這就對(duì)同它親密相連的被膜層產(chǎn)生一種拉力，同時(shí)也對(duì)內(nèi)表胚層產(chǎn)生一種拉力，使被膜層和內(nèi)表胚層一起下包。而內(nèi)胚層表面有很多長的微絨毛，它們隨外包的進(jìn)展而逐漸變短，這就為外包時(shí)供應(yīng)足夠數(shù)量的膜；同時(shí)在這些微絨毛中也有大量的微絲，為外包也供應(yīng)了收縮條件。此外，接近表胚層的被膜層細(xì)胞的皮層中也有很多微絲網(wǎng)，同時(shí)還以緊密連接和閉鎖連接相連接，這也為外表胚層產(chǎn)生拉力是把被膜層一起向下包供應(yīng)了結(jié)構(gòu)上的條件。如果把外表胚層連接的被膜層邊

16、緣切去，胚盤立即縮回去，胚盤就不發(fā)生外包，而表胚層仍能獨(dú)立完成其外包過程，并且外包的速度要比有胚盤存在的更快。被膜層在外包時(shí)其細(xì)胞數(shù)量增加不多，所以外包不是依靠它的細(xì)胞數(shù)量的增加，而是依靠細(xì)胞外形發(fā)生轉(zhuǎn)變和細(xì)胞的重新排列，細(xì)胞縱向伸長的結(jié)果。被膜層不參加胚胎的器官發(fā)生，只形成胚胎的外胚層表皮。由于胚盤不斷向植物極外包，最終在植物極處形成一胚孔，至此原腸作用才告結(jié)束。§1.2 早期胚胎的形成§神經(jīng)系統(tǒng)的形成在被膜層下面的預(yù)定神經(jīng)物質(zhì)向中央集中形成一實(shí)心的，以后在此細(xì)胞索中央裂出縫狀的腔，逐漸成為管狀的神經(jīng)管。在神經(jīng)管前端膨大成腦部，并產(chǎn)生兩個(gè)收縮，這樣就把腦部分為前腦泡、中腦

17、泡和后腦泡，其后為管狀的脊髓。硬骨魚的前腦很不發(fā)達(dá)，因此不形成腦曲。首先在前腦兩側(cè)凸出一對(duì)視囊，這時(shí)前腦分為端腦和間腦。端腦向前伸出一對(duì)較長的嗅神經(jīng)和嗅球。在端腦和間腦交界處的腦部頂壁甚薄，附以血管形成前脈絡(luò)叢。間腦除兩側(cè)為一對(duì)視囊外，其頂壁有一不發(fā)達(dá)的腦上腺突起，腹壁也形成一漏斗，與來自外胚層的腦下腺組成垂體。從漏斗向后伸出一囊狀突起，它的壁很薄，與頭部的靜脈血竇相遇，由于囊狀突起不斷生長，囊壁產(chǎn)生很多皺褶伸入靜脈血竇，組成一個(gè)簡(jiǎn)單的血網(wǎng)狀體，稱為血脈囊。這器官在深水魚中十分明顯；在淡水魚中極不發(fā)達(dá)，僅為一痕跡器官。因此，血脈囊可能是生活于深水魚類的特征，與檢測(cè)水的深度和壓力有關(guān)。中腦的背壁

18、發(fā)育為視葉。后腦分化為小腦和延腦。§脊索和內(nèi)胚層的分化在神經(jīng)物質(zhì)下面為脊索、中胚層和內(nèi)胚層，后者剛好位于表胚層之上，為一層扁平細(xì)胞。脊索中腦層位于神經(jīng)物質(zhì)和內(nèi)胚層之間。脊索向前達(dá)到耳囊處，向后則終止于尾端。在眼發(fā)生之后，脊索細(xì)胞內(nèi)發(fā)生空泡化，其外的細(xì)胞形成脊索鞘。原腸作用結(jié)束后不久，內(nèi)胚層細(xì)胞向中央集中形成一條細(xì)胞團(tuán)，爾后內(nèi)部逐漸消失空腔，在前端空腔擴(kuò)大成咽，后端的腔消失較晚。這就是原始的消化道?？谇皇怯汕澳X腹面的外胚層加厚成細(xì)胞團(tuán)，然后產(chǎn)生空隙擴(kuò)大而成的，并與咽相通。咽部有6對(duì)咽囊（第1對(duì)為舌頜囊，后為第26對(duì)咽囊），與其外胚層凹陷的鰓溝相通成為鰓裂。舌頜囊不與鰓溝相通，因此魚類只

19、有 5對(duì)鰓裂。鰓蓋亦由舌弓形成。甲狀腺由咽部腹壁產(chǎn)生一對(duì)實(shí)心細(xì)胞團(tuán)所形成，胸腺則從咽囊背壁分出的細(xì)胞發(fā)育而成。肝在消化道尚未形成之前，由食道后端內(nèi)胚層細(xì)胞索的腹面突出一團(tuán)細(xì)胞所組成。與消化道產(chǎn)生的同時(shí)，這團(tuán)細(xì)胞增殖形成分支的肝索，并產(chǎn)生空隙與消化道相通，這就是膽管。胰是在肝突形成的同時(shí)，在內(nèi)胚層細(xì)胞索的背部突出一細(xì)胞團(tuán)，將來發(fā)育成胰。隨發(fā)育與肝緊靠，由胰管通人消化道背側(cè)。當(dāng)胚孔閉合時(shí)，在胚體后端有全都密細(xì)胞團(tuán)，此即末球，它由脊索、中胚層和內(nèi)胚層所組成，與兩棲類的尾芽組織相類似。胚體的加長就是由末球不斷增生，以增加這些胚層的細(xì)胞。在末球的前方有一囊狀結(jié)構(gòu)，這就是硬骨魚所特有的Kupffer氏囊，

20、它隨末球向后分化也向后方遷移，待胚體長足時(shí)此囊仍留在尾部的動(dòng)身點(diǎn)，以后閉塞，自行消失。所以，Kupffer氏囊只是由內(nèi)胚層細(xì)胞間的空隙組成，其意義不明。§1.2.3 中胚層的分化在胚胎發(fā)育到原腸后期，中胚層由下胚層分離出來以后，排列于脊索兩側(cè)、內(nèi)外胚層之間。位于脊索兩側(cè)的中胚層可分為背側(cè)和腹側(cè)兩部分，背側(cè)部形成體節(jié)，腹側(cè)部則形成側(cè)板。隨著胚胎的發(fā)育，頭部的中胚層分散形成間葉細(xì)胞，將來分化為六條眼部肌肉（眼肌）以及下頜收肌、鄂弓提肌、鄂弓收肌、鰓蓋提肌和鰓蓋收肌等頭部肌肉。而體干部的中胚層分化為粗厚的體節(jié)（節(jié)板中胚層）和斜列于胚體兩側(cè)的側(cè)板中胚層以及節(jié)板中胚層與側(cè)板中胚層之間的血管帶，

21、它們進(jìn)一步分化如下：（一）體節(jié) 硬骨魚類的體節(jié)是致密無腔的結(jié)構(gòu)，與其他脊椎動(dòng)物一樣，不久，它分化為下列三部分：1生肌節(jié) 由體節(jié)內(nèi)側(cè)大部分中胚層細(xì)胞分化而成，生肌節(jié)的腹側(cè)部細(xì)胞將將沿著側(cè)板與外胚層之間的區(qū)域向腹面伸展分化為橫紋肌，在魚類的尾部沒有內(nèi)臟器官和側(cè)板，這里的生肌節(jié)平行地向腹面伸展，并在腹面相互連接，同時(shí)分化為尾部的橫紋肌。生肌節(jié)在發(fā)育過程中，為了適應(yīng)身體的運(yùn)動(dòng)，其外形不斷轉(zhuǎn)變。在發(fā)育的早期，即生肌節(jié)剛形成時(shí)，呈簡(jiǎn)潔的方形，以后由方形變?yōu)椤叭恕弊中?，這時(shí)胚胎在膜內(nèi)可作抽搐狀收縮運(yùn)動(dòng)，以后進(jìn)一步變成“W”形，并在肌節(jié)之間消失結(jié)締組織隔膜（肌隔），這樣可使幼魚和成魚具有很強(qiáng)的游泳能力。不同魚

22、類的胚胎和仔魚，各具有自己特有的肌節(jié)數(shù)。各種魚類的軀干?。ㄗ灶^部至肛門）和尾部肌節(jié)（自肛門至尾端）的數(shù)目也不同。軀干年尾部肌節(jié)數(shù)目之間的比例是分類學(xué)上的一個(gè)特征，依據(jù)該特征可將一些魚類的胚胎或仔魚和另一些魚類的胚胎和仔魚區(qū)分開來。魚類胚胎和仔魚的不同肌節(jié)數(shù)目，系決定于它們的生態(tài)學(xué)特點(diǎn)，例如在鯉科魚類中，肌節(jié)數(shù)目最多（4448對(duì)）的是棲息于急流中營巖石上產(chǎn)卵的魚類，這樣可保證它們具有較大的活動(dòng)性。而生活在比較安靜的水域中并過著不太活動(dòng)生活方式的草上產(chǎn)卵魚類的仔魚，其肌節(jié)數(shù)較少（3840對(duì)），肌節(jié)數(shù)最少的喜貝類產(chǎn)卵魚類的仔魚，它們長期處在雙殼貝類（如河蚌）的外套腔內(nèi)發(fā)育，南開貝體后即生活于不太流淌

23、的靜水水域內(nèi)。2生骨節(jié) 由位于生肌節(jié)腹面內(nèi)側(cè)的體節(jié)細(xì)胞分化而成，為魚類骨骼系統(tǒng)的原基。生骨節(jié)細(xì)胞從肌節(jié)中分離出來以后形成中胚層的間葉組織，它們隨著胚胎和仔魚的發(fā)育而遷移到肯定的生骨區(qū)分化為不同的骨骼。魚類的生骨區(qū)有：皮膚區(qū)，分化產(chǎn)生鱗片及其衍生物；水平隔區(qū)，位于體側(cè)上下軸骨之間，在此分化產(chǎn)生背肋；背生骨隔區(qū)和腹生骨隔區(qū)，分化產(chǎn)生奇鰭的支鰭骨；肌隔區(qū)，位于前后兩肌節(jié)之間，分化產(chǎn)生肌間骨；圍繞脊索、神經(jīng)管及中軸血管區(qū)，分化形成腦顱和脊柱；咽顱區(qū)，分化形成咽顱骨骼；附肢區(qū)，分化形成偶鰭和奇鰭的骨胳。絕大多數(shù)魚類的骨骼是硬骨，它們的發(fā)生方式分為兩種：一是由分散的生骨節(jié)中胚層間葉細(xì)胞先分化為軟骨，然后再

24、骨化成硬骨，這類骨骼稱為軟骨化骨；另一方式是由分散的生骨節(jié)中胚層間葉細(xì)胞直接骨化成硬骨，這種骨稱為膜骨。3.生皮節(jié) 位于生肌節(jié)外測(cè)的體節(jié)細(xì)胞群分離而成，將來分化為真皮和皮下結(jié)締組織，并參加鱗片的形成。（二）側(cè)板（側(cè)板中胚層） 自體節(jié)分離出以后，便沿著胚胎或仔魚地兩側(cè)向腹面伸展，同時(shí)分為兩層，靠近內(nèi)臟的一層稱為臟壁中胚層，它們之間所形成的腔隙，在體干前端心區(qū)的腔稱為圍心腔，圍心腔后部（體干部）的腔稱為體腔。（三）血管帶 它是硬骨魚類胚胎特有的結(jié)構(gòu)，位于體節(jié)與側(cè)板中胚層之間。在體干前部的血管帶呈薄板狀且不分節(jié)，稱為血板；胚體后部（自第5體節(jié)至尾部）的血管帶較粗厚，其橫斷面呈三角形，稱為中間團(tuán)。血管

25、帶是硬骨魚類循環(huán)系統(tǒng)的原基。脊椎動(dòng)物三胚層的分化表胚胎成體外胚層體壁外胚層表皮皮膚的表皮和其衍生物（角質(zhì)構(gòu)造和皮膚腺）口腔和直腸末端的上皮感受器腦垂體前葉神經(jīng)嵴鰓部骨骼神經(jīng)節(jié)和感覺神經(jīng)腎上腺髓質(zhì)神經(jīng)管腦和脊髓腦神經(jīng)合脊神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)腦垂體后葉內(nèi)胚層原腸及其突出物消化道內(nèi)層肝臟和胰腺呼吸系統(tǒng)內(nèi)層膀胱和尿道內(nèi)層一部分內(nèi)分泌腺中胚層脊索脊索，其后被脊椎骨所替代上節(jié)生皮節(jié)真皮生骨節(jié)脊柱生肌節(jié)骨骼肌中節(jié)排泄系統(tǒng)生殖系統(tǒng)的一部分下節(jié)體壁層腹膜臟壁層臟膜系膜心血管系統(tǒng)，血細(xì)胞生殖腺平滑肌體腔體腔§2.軟骨組織的特點(diǎn)及其分類§2.1 軟骨組織的結(jié)構(gòu)軟骨是一種結(jié)締組織，包括軟骨

26、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨細(xì)胞位于被稱作陷窩的腔內(nèi)，陷窩外是胞外基質(zhì)，包括軟骨基質(zhì)和膠原纖維。同腱和韌帶之類的結(jié)締組織一樣，軟骨是無血管的組織，基質(zhì)供應(yīng)了周圍結(jié)締組織和軟骨細(xì)胞之間物質(zhì)集中的通道。軟骨的基質(zhì)是固態(tài)的，堅(jiān)硬而有一點(diǎn)彈性，這正解釋了軟骨特別的回彈特性。符合軟骨在承重和在關(guān)節(jié)特別的運(yùn)動(dòng)中所起的作用。所以軟骨成為骨生長過程中的一個(gè)重要的組織。§2.2 軟骨膜軟骨周圍覆有一層較致密的結(jié)締組織，稱為軟骨膜。分為兩層，外層較致密富含纖維，主要起保護(hù)作用；內(nèi)層疏松，富含細(xì)胞、血管及神經(jīng)，能形成骨原細(xì)胞，分裂分化形成軟骨細(xì)胞。所以軟骨膜能保護(hù)和營養(yǎng)軟骨，同時(shí)對(duì)軟骨的生長有重要的作用。

27、67;2.3 軟骨類型通常來講，依據(jù)基質(zhì)的特性不同，軟骨分為三種類型：（1）透明軟骨，（2）纖維軟骨，（3）彈性軟骨。透明軟骨基質(zhì)中的膠原纖維含量較少，主要是II型膠原，沒有典型的周期結(jié)構(gòu)。彈性軟骨基質(zhì)除了膠原纖維和基質(zhì)外，其軟骨基質(zhì)還包含大量的彈性纖維和層狀的彈性物質(zhì)，相互交織成網(wǎng)狀。彈性物質(zhì)提高了軟骨的彈性，外耳軟骨的良好柔韌性即是很好的證明。同透明軟骨不同的是，彈性軟骨基質(zhì)不礦化。纖維軟骨的基質(zhì)包含有大量的很明顯的粗膠原纖維簇，主要是I型膠原，平行或交叉，軟骨細(xì)胞較小而少，常成行排列。透明軟骨：透明軟骨具有玻璃狀的，均一的不定型基質(zhì)。在軟骨中分布著很多被稱作陷窩的腔，陷窩內(nèi)是軟骨細(xì)胞。陷

28、窩周圍是胞外基質(zhì)，它由兩種組元構(gòu)成：膠原纖維（主要是II型膠原）和基質(zhì)。透明軟骨的基質(zhì)的化學(xué)分析表明白三種糖胺聚糖的存在：透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素。硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素結(jié)合在軸心蛋白上形成了蛋白多糖單體。在組織中，透明質(zhì)酸和大約80個(gè)蛋白多糖單元聯(lián)合形成大的聚合體，其結(jié)構(gòu)由連接蛋白所加固。軟骨基質(zhì)也包含其它的不形成聚合體的蛋白多糖和無膠原、無蛋白多糖的糖蛋白。同其它的基質(zhì)一樣，軟骨基質(zhì)也是高度水合的。透明軟骨凈重的60%-78%是水。這些水的大部分是結(jié)合水，這正解釋了軟骨的回彈性。然而，一些水結(jié)合較弱，足以允許小溶質(zhì)的集中。在關(guān)節(jié)軟骨中，水的含量有局部的轉(zhuǎn)變。這些轉(zhuǎn)變發(fā)生在關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)

29、過程中和關(guān)節(jié)受壓時(shí)。高度的含水量和水的運(yùn)動(dòng)影響軟骨基質(zhì)對(duì)壓載荷的轉(zhuǎn)變作出的反應(yīng)及軟骨的承重能力。盡管透明軟骨的基質(zhì)是均一的，無定型的，但基質(zhì)的成分并不是均勻分布。由于大量的硫酸鹽類的存在，蛋白多糖經(jīng)基本染劑和蘇木青染色，這樣，在軟骨染色的斷面上嗜堿性細(xì)胞增多的現(xiàn)象供應(yīng)了硫酸鹽類蛋白多糖的分布信息。這些物質(zhì)迅速集中在陷窩的周圍。這一環(huán)狀的深度染色基質(zhì)被傳統(tǒng)的組織學(xué)家命名為被膜。在細(xì)胞團(tuán)簇四周也有一些濃度稍低的硫酸鹽類蛋白多糖，這些區(qū)域被稱為區(qū)基質(zhì)。在離細(xì)胞較遠(yuǎn)的基質(zhì)區(qū)域硫酸鹽蛋白多糖的含量很低，這些區(qū)域被稱為區(qū)間基質(zhì)。除了存在蛋白多糖分布的區(qū)域差別，同時(shí)還存在與年齡有關(guān)的差別，即隨著軟骨年齡的增

30、長，蛋白多糖含量削減。§2.4 軟骨生長軟骨存在兩種生長方式。1. 內(nèi)積生長（interstitial growth）：軟骨細(xì)胞在軟骨基質(zhì)內(nèi)可連續(xù)發(fā)育、分裂和不斷產(chǎn)生新的基質(zhì)和纖維，使軟骨從內(nèi)部生長。2. 外加生長（appositional growth）：由軟骨膜內(nèi)層的骨原細(xì)胞向軟骨表面不斷添加新的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，使軟骨從表面對(duì)周圍擴(kuò)大。§2.5 軟骨骨化生物內(nèi)大多數(shù)的軟骨在生長過程中逐漸替換成骨。軟骨骨化包括軟骨周骨化和軟骨內(nèi)骨化。1. 軟骨周骨化 軟骨膜內(nèi)層的骨原細(xì)胞分裂分化為成骨細(xì)胞，在軟骨表面形成類骨質(zhì)，稱為骨領(lǐng)。骨領(lǐng)不斷鈣化為骨質(zhì)并向骨的兩端擴(kuò)展，逐漸形成骨

31、干。2. 軟骨內(nèi)骨化 骨領(lǐng)包圍的軟骨部分，軟骨細(xì)胞肥大，軟骨基質(zhì)迅速鈣化，隨后軟骨細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)而迅速退化死亡。骨膜的血管連同破骨細(xì)胞和骨原細(xì)胞等穿越骨領(lǐng)，進(jìn)入軟骨。破骨細(xì)胞將鈣化的軟骨基質(zhì)逐漸分解吸取，形成了很多與骨干長軸平行并相互連通的隧道，即原始的骨髓腔。然后，骨原細(xì)胞分裂分化為成骨細(xì)胞，在殘留的鈣化軟骨基質(zhì)表面形成類骨質(zhì)，并漸鈣化為骨質(zhì)，形成很多骨小梁，軟骨內(nèi)消失了初級(jí)骨化中心。初級(jí)軟骨中心由骨干中央向兩端不斷擴(kuò)展。同時(shí)骨領(lǐng)也不斷增長、增厚，使長骨增長和骨化。軟骨內(nèi)骨化是骨發(fā)生、生長和損傷修復(fù)的一種成骨方式。在成骨過程中軟骨組織中的肥大軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)、鈣化、死亡，軟骨組織退變、崩解、

32、被吸取，血管侵入，成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨組織。目前對(duì)體外（in vitro）、在體（in vivo）軟骨、骨組織和細(xì)胞活動(dòng)的商量手段主要有核酸雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)、組織計(jì)量學(xué)和放射自顯影技術(shù)等。對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的定性、定位及其定量主要依靠其特征性產(chǎn)物來確定。軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生特征性的、和型膠原，肥大軟骨細(xì)胞還可產(chǎn)生特征性的型膠原。各期的軟骨細(xì)胞均有酸性磷酸酶的活動(dòng)。骨鈣素是成骨細(xì)胞的特征性產(chǎn)物，它是骨中最豐富的非膠原蛋白，它的表達(dá)說明細(xì)胞具有成骨的特性。骨橋素對(duì)細(xì)胞增殖和礦化很重要，膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨組織中，前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中均含有這種蛋白。骨涎蛋白在礦化組織的細(xì)胞內(nèi)存在，認(rèn)為它是羥基磷灰石的晶

33、核。骨連接素是一種酸性磷蛋白，最先在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，含量豐富，以后在包括軟骨細(xì)胞的各種其它細(xì)胞中均有表達(dá)和分泌。§3. 斑馬魚120h內(nèi)的發(fā)育特點(diǎn)§3.1 斑馬魚發(fā)育生物學(xué)商量的最佳脊椎動(dòng)物模型在脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)商量方面，由于缺少適當(dāng)?shù)纳塘磕Ｐ?，有關(guān)早期發(fā)育階段，基因表達(dá)調(diào)控的商量始終未獲突破性進(jìn)展。包括小鼠、雞、爪蟾等在內(nèi)的一些脊椎動(dòng)物都只適用于胚胎學(xué)或者遺傳學(xué)某一學(xué)科的商量，均不是抱負(fù)的發(fā)育生物學(xué)商量模型。小鼠的胚胎太小，幼體和成體又太大，這使得進(jìn)行大規(guī)模的突變體實(shí)驗(yàn)有很大的困難。此外，小鼠的胚胎又在體內(nèi)，很難移動(dòng)。雞和爪蟾都是很好的胚胎學(xué)商量模型，但它們繁殖慢，記錄后

34、代的遺傳信息很困難，并且母體太大，價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模突變體商量。而一種小型的鯉科魚斑馬魚，由于其諸多的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為發(fā)育生物學(xué)商量的最佳脊椎動(dòng)物模型。斑馬魚個(gè)體小，成體只有3-4cm，并且價(jià)格廉價(jià)，易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大規(guī)模的養(yǎng)殖。同時(shí)，斑馬魚產(chǎn)卵量大（幾十到上百），產(chǎn)卵周期短（幾天到兩周），卵大，胚胎在體外發(fā)育，胚胎發(fā)育速度快，通常2-3天即發(fā)育成幼體。而在轉(zhuǎn)基因的商量中注入的mRNA通常在48小時(shí)后降解，對(duì)于斑馬魚來說，因其胚胎發(fā)育速度快，所以基因有足夠的時(shí)間進(jìn)行表達(dá)。斑馬魚早期的胚胎完全透明，單倍體、雌核發(fā)育二倍體的制作和突變體的獲得均較容易。這些特點(diǎn)使它成為很好的脊椎動(dòng)物胚胎學(xué)、遺傳學(xué)商

35、量模型。此外，盡管斑馬魚不是哺乳動(dòng)物，但它作為脊椎動(dòng)物與人體有肯定的相像之處，對(duì)斑馬魚某些基因及其軟骨、骨的礦化機(jī)制的商量對(duì)人體的發(fā)育及同源基因的表達(dá)等方面均有重要的意義。同時(shí)，從基因水平上商量軟骨、骨的發(fā)育和礦化對(duì)人類仿生材料的研制供應(yīng)了重要的依據(jù)。§3.2 斑馬魚幼體縱截面組織切片圖1. 24h的斑馬魚圖1-1圖1-22. 48h的斑馬魚圖1-3 圖1- 43. 120h的斑馬魚圖1-5圖1-6§4. 生物礦化生物礦化是指在生物體內(nèi)形成礦化材料的過程。由細(xì)胞分泌的有機(jī)物自組裝成的有機(jī)物對(duì)無機(jī)物的形成和聚集起模板和掌握作用?；|(zhì)和礦物間動(dòng)態(tài)的相互協(xié)調(diào)作用，才使得無機(jī)礦物具

36、有肯定的外形、尺寸、取向和結(jié)構(gòu)。生物礦化過程是一個(gè)天然存在的高度掌握過程，該過程受基因、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)制，在分子水平到介觀水平上對(duì)晶體外形、大小、結(jié)構(gòu)、位向和排列實(shí)現(xiàn)精確掌握和組裝。該過程涉及膠原蛋白等有機(jī)體系，磷酸鈣、碳酸鈣等無機(jī)體系和多類型細(xì)胞體系三方面的相互作用。理解這一簡(jiǎn)單系統(tǒng)中生物結(jié)構(gòu)的高度選擇性掌握、以及基質(zhì)和礦物的復(fù)合機(jī)制是商量生物礦化的關(guān)鍵問題。§5. Hedgehog基因家族Hedgehog基因家族編碼一類分泌性信號(hào)分子，是1980年由üsslein-Volhard和Weieschaus通過突變篩選在果蠅中首先發(fā)現(xiàn)的，于1992年被克隆。hh基因在果

37、蠅的體節(jié)和成蟲盤等的圖式形成中具有重要作用。Hh掌握TGF （transforming growth factor ）,Wnt和FGF(fibroblast growth factor )信號(hào)分子的表達(dá)。隨后，在不同無脊椎動(dòng)物（如海膽、水蛭和甲蟲）和脊椎動(dòng)物（如斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠和人）中均發(fā)現(xiàn)了同源基因，構(gòu)成一個(gè)基因家族。目前在果蠅和其它無脊椎動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因，而在脊椎動(dòng)物中則具有多個(gè)同源基因，包括Sonic hh (Shh)、Indian hh (Ihh)、Deserth hh (Dhh)等。其中Shh在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管、體節(jié)和肢等的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，Dhh和Ihh則分別參加精巢和

38、軟骨等的發(fā)育。在小鼠、雞和斑馬魚中，Shh基因的表達(dá)均開頭于原腸胚期，分別消失于頭突、亨氏節(jié)和胚盾處，然后逐漸擴(kuò)展到整個(gè)預(yù)定脊索中胚層，隨后在神經(jīng)管腹側(cè)基板中也開頭表達(dá)。在小鼠和雞中，Shh基因在脊索中的表達(dá)至少持續(xù)到體節(jié)發(fā)生結(jié)束，但在斑馬魚中Shh基因在脊索中的表達(dá)隨著它在神經(jīng)管基板中表達(dá)的開頭而逐漸減弱，到22體節(jié)時(shí)Shh基因在中胚層中的表達(dá)已僅限于尾部脊索和尾芽中的少部分未分化細(xì)胞。這種差別的意義仍不清晰。有人認(rèn)為誘導(dǎo)基板產(chǎn)生是脊椎動(dòng)物Shh基因最原始的功能，而其它信號(hào)功能如誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化是隨后產(chǎn)生的。第三章 實(shí)驗(yàn)方法§1. 斑馬魚的獲得斑馬魚【Zebrafish (Da

39、nio rerio)】取自清華高校生命科學(xué)學(xué)院分子發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，在28.5，按標(biāo)準(zhǔn)方法養(yǎng)殖。§2. 透射電鏡樣品的組織固定及包埋將斑馬魚幼體直接至于容器內(nèi)，進(jìn)行如下處理：1. 用0.1M的磷酸緩沖液（PH=7.2）進(jìn)行清洗。2. 2.5的戊二醛磷酸緩沖液固定23小時(shí)。3. 用0.1M的磷酸緩沖液清洗4次，每次15分鐘。4. 1的鋨酸緩沖液固定2小時(shí)。5. 用0.1M的磷酸緩沖液清洗4次，每次15分鐘。6. 丙酮脫水： 50丙酮1020分鐘70丙酮1020分鐘， 4過夜80丙酮1020分鐘90丙酮兩次，每次20分鐘95丙酮兩次，每次15分鐘100丙酮兩次，每次30分鐘7. 浸透：2體積丙

40、酮1體積樹脂1小時(shí)1體積丙酮1體積樹脂1小時(shí)純樹脂1小時(shí)純樹脂4過夜8. spurr氏環(huán)氧樹脂聚合：70加熱10小時(shí)。§3. 半薄切片的組織染色半薄切片厚度為1，用亞甲基藍(lán)品紅染色17，用于光學(xué)顯微鏡的觀察。§3.1 染色劑的配制§3.1.1亞甲基藍(lán)溶液亞甲基藍(lán) 0.130gGiemsa0.020g丙三醇 C.P.10ml甲醇C.P.10ml磷酸鹽緩沖液*（PH6.9）30ml蒸餾水50ml*磷酸鹽緩沖液：無水KH2PO49.078g無水NaHPO411.876g 加蒸餾水至1L§品紅溶液堿性品紅0.100g50%乙醇 至10ml蒸餾水 至 200ml

41、§3.2 染色過程：1 把玻璃片浸泡在65的亞甲基藍(lán)溶液中15分鐘。2 去離子水清洗2次。3 浸泡在室溫的品紅溶液中5分鐘。4 去離子水清洗3次5 空氣中自然晾干。細(xì)胞核蘭色；細(xì)胞質(zhì)淺蘭色；粘蛋白粉紅至紫色；糖和膠淀粉粉紅至紅色；脂?；抑翜\蘭色（有時(shí)，黃棕色）；紅細(xì)胞藍(lán)綠。§4. 超薄切片的染色超薄切片用于透射電鏡的觀察。超薄切片的厚度約為500Å700Å。由于未經(jīng)染色的超薄切片的反差很弱，在電鏡下觀察時(shí)，幾乎看不清樣品的結(jié)構(gòu)。因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行染色。其目的是增強(qiáng)樣品中各種結(jié)構(gòu)圖象之間的反差或選擇性地顯示某些結(jié)構(gòu)或成分。超薄切片的染色是一種“電子染色”

42、，它只呈現(xiàn)黑白對(duì)比度，而不像光學(xué)顯微鏡的厚切片染色那樣顯現(xiàn)出各種顏色。實(shí)驗(yàn)中，染色接受醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙染法。前者主要使細(xì)胞核及結(jié)締組織染色，而后者主要提高細(xì)胞質(zhì)成分的反差。第四章 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果與商量§1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察2天、3天、6天、10天的斑馬魚的組織切片和超薄切片，主要利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡（JEOL 100-CX）觀察斑馬魚脊椎軟骨的發(fā)育進(jìn)程，以及軟骨細(xì)胞特別是脊索旁軟骨的排列，形貌，大小及其顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和中胚層分化的顯微形貌。§2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與商量§2.1 斑馬魚幼體隨時(shí)間發(fā)育的橫截面切片圖§2.1.1 2天、3天、6天斑馬魚腹部及腹

43、前切片圖下列圖中脊索區(qū)域?yàn)閷淼某晒菂^(qū)，生骨節(jié)細(xì)胞逐漸分化為軟骨細(xì)胞，包圍在脊索周圍，逐漸向四周擴(kuò)展和骨化。隨著發(fā)育的進(jìn)行，脊索消失，該區(qū)域被脊椎所代替。§2.1.2 10天的斑馬魚頭骨連續(xù)切片圖圖4-10 10天斑馬魚頭骨連續(xù)切片圖由圖410可見，斑馬魚的頭骨發(fā)育較早，軟骨細(xì)胞的形貌與圖4-6和圖4-7所示的脊索旁軟骨細(xì)胞基本相同。§2.2 斑馬魚幼體的顯微結(jié)構(gòu)§2.2.1 2天的顯微結(jié)構(gòu)圖4-11為圖4-1中箭頭所示位置的顯微結(jié)構(gòu)。該區(qū)域?yàn)榧顾鲄^(qū)，圖中d區(qū)域?yàn)橐逊只募∪饨M織，a區(qū)域無明顯的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，b區(qū)域含有大量的小囊泡，直徑在100400nm左右。c區(qū)為間

44、葉細(xì)胞。圖4-11 脊索區(qū)的顯微結(jié)構(gòu)（6.1K倍） 圖4-12 圖4-11中(a)區(qū)放大圖4-13 圖4-11中（b）區(qū)放大 圖4-14 圖4-11中（c）區(qū)放大圖4-15 圖4-3中箭頭I所示區(qū)域 圖4-15為外胚層和生肌節(jié)分化的肌肉組織。首先在細(xì)胞內(nèi)分化，隨著分化的進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。圖4-16 圖4-15中（a）區(qū)放大 圖4-17 圖4-3中箭頭II所示區(qū)域圖4-17為生骨節(jié)的間葉細(xì)胞，尺寸在10m的數(shù)量級(jí)，外形不規(guī)章，無明顯得細(xì)胞核，還未分化為軟骨細(xì)胞。§2.2.2 3天的顯微結(jié)構(gòu)圖4-18和圖4-19為3天斑馬魚的生骨節(jié)細(xì)胞（截面C）。 圖4-18 3天的斑馬魚生骨節(jié)細(xì)胞 圖

45、4-19 3天的斑馬魚生骨節(jié)細(xì)胞§2.2.3 6天的顯微結(jié)構(gòu)右圖為6天斑馬魚截面A處的軟骨細(xì)胞。 圖4-20 6天斑馬魚截面A處的軟骨細(xì)胞圖4-21為圖4-9中箭頭所示的脊索區(qū)域的顯微照片。圖4-22為圖4-21中（a）處的肌肉組織放大照片，圖4-23為圖4-21中（b）處脊索表面的生骨節(jié)的放大照片。 圖4-21 圖4-9中箭頭所示的脊索區(qū)域圖4-22 圖4-21中（a）區(qū)放大§2.2.4 10天的顯微結(jié)構(gòu)圖4-24為圖4-10（i）中箭頭所示區(qū)域的顯微照片，為脊髓區(qū)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖4-25為脊髓區(qū)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。圖4-26和圖4-27為脊索旁軟骨，圖4-28為脊索區(qū)。圖

46、429為細(xì)胞質(zhì)的線粒體。 圖4-23 圖4-21中（b）區(qū)放大圖4-24 10天的斑馬魚脊髓區(qū)的細(xì)胞 圖4-25 10天的斑馬魚脊髓區(qū)環(huán)狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 圖4-26 10天的斑馬魚脊索旁軟骨 圖4-27 10天的斑馬魚軟骨 圖4-28 10天斑馬魚的脊索區(qū) 圖4-29 10天斑馬魚的軟骨細(xì)胞質(zhì)§2.3 結(jié)果商量斑馬魚的脊椎軟骨細(xì)胞由生骨節(jié)細(xì)胞分化而成，在配卵后2-3天開頭消失21，并圍繞在脊索周圍（脊索旁軟骨），逐漸向脊髓和背動(dòng)脈方向延長。并且隨著時(shí)間的推移，脊椎軟骨細(xì)胞將沿體節(jié)方向逐漸分化。在1個(gè)半月左右的時(shí)間基本分化完成（見圖4-30，該圖為張漾博士生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。圖431為斑馬魚脊椎軟

47、骨發(fā)育時(shí)間模型圖。從2天到6天的組織切片圖和顯微結(jié)構(gòu)圖可以看到，2天時(shí)的脊索還不明顯，存在大量的基質(zhì)，3天時(shí)體節(jié)增多，脊索區(qū)逐漸變空，范圍擴(kuò)大，開頭消失軟骨，6天時(shí)軟骨數(shù)目增多，并向脊髓和血管方向延長。發(fā)育模型如圖432。過程中同時(shí)伴有骨化過程。圖4-30圖4-31由圖4-7可知，斑馬魚的脊椎軟骨細(xì)胞在發(fā)育早期時(shí)排列比較整齊，脊索旁軟骨末端為單排排列，該處細(xì)胞同脊索四周的軟骨細(xì)胞相比外形更規(guī)章，形體較大。并且，從圖中可見，斑馬魚的脊椎軟骨細(xì)胞的大小多數(shù)在520m范圍內(nèi)。軟骨細(xì)胞為透明軟骨，排列緊密，細(xì)胞外基質(zhì)含量較少，染色為粉紅色，同人類的透明軟骨相同22，為葡糖胺聚糖（粘多糖），通常含有三種

48、粘多糖：透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素。由有關(guān)文獻(xiàn)和圖4-10可知，斑馬魚的頭部軟骨發(fā)育較早，軟骨細(xì)胞也為透明軟骨，多數(shù)為單排排列3。圖4-32從電子顯微水平觀察可知，肌肉組織分化較早，從圖4-15可見，2天時(shí)生肌節(jié)已大部分分化為肌肉組織，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。由圖4-22，6天時(shí)截面C處已全部分化為典型的肌肉組織，看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。從圖4-11可以看出在2天時(shí)脊索區(qū)域含有大量的囊泡（V），直徑在100-400nm范圍，與成魚的囊泡大小基本相同。該區(qū)域仍存在細(xì)胞輪廓，但細(xì)胞的細(xì)節(jié)消失，在細(xì)胞內(nèi)為大量的囊泡，局部區(qū)域細(xì)胞質(zhì)消失，形成小空腔。從圖4-21可以看到，6天時(shí)的脊索區(qū)域形成較大的空腔，細(xì)胞結(jié)

49、構(gòu)消失，在脊索內(nèi)表面可以看到少量的囊泡。由于基質(zhì)囊泡在骨形成過程中對(duì)蛋白的輸運(yùn)和礦物的形成起著重要的作用。所以可以推測(cè)在2天時(shí)脊索區(qū)域消失的大量的囊泡起著輸運(yùn)和降解細(xì)胞質(zhì)的作用。在圖4-24的脊髓區(qū)域和圖4-18的生骨節(jié)細(xì)胞以及圖4-26的軟骨結(jié)構(gòu)中仍可以看到大量的囊泡，而且在脊髓區(qū)可看到很多正在死亡的細(xì)胞。由此我們可以猜想，囊泡在新舊組織更替和代謝旺盛的區(qū)域會(huì)大量消失，對(duì)基質(zhì)的輸運(yùn)和新組織的形成有著重要的作用。對(duì)于囊泡的簡(jiǎn)略作用仍需進(jìn)一步的商量和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由圖4-17和圖4-18的生骨節(jié)細(xì)胞的變化中我們可以看到，中胚層間葉細(xì)胞即生骨節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞核很大，細(xì)胞質(zhì)含量很少。2天的間葉細(xì)胞外形不規(guī)章

50、，排列雜亂，而3天的間葉細(xì)胞在外形上趨于規(guī)章，排列整齊。可見在間葉細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的過程中，首先是在外形和排列上趨于整齊和規(guī)章。由圖4-20和圖4-26的軟骨細(xì)胞可見，軟骨細(xì)胞在形成開頭時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞距離較近，占據(jù)同一個(gè)陷窩，被稱為同源細(xì)胞組，隨著一些基質(zhì)的分泌，軟骨細(xì)胞發(fā)生分離。由圖4-27可見，軟骨細(xì)胞較長，細(xì)胞質(zhì)中含有大量的線粒體。細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量細(xì)小的II型膠原纖維。圖4-25為10天斑馬魚脊髓區(qū)的光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（SER）。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍有大量的空腔，環(huán)形內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中包圍著細(xì)胞質(zhì)。依據(jù)有關(guān)報(bào)道，光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要起著降解的作用，所以從圖4-25也可看到，在光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在的區(qū)域細(xì)胞已死亡?？梢?，光

51、滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞更替中起著降解細(xì)胞質(zhì)的作用。從圖4-18，圖4-28和圖4-29中，我們可以看到大量的線粒體（M）。線粒體主要為細(xì)胞供應(yīng)能量。在間葉細(xì)胞期、脊索區(qū)、軟骨細(xì)胞期都有大量的線粒體存在，說明在細(xì)胞分化和類型轉(zhuǎn)變過程中需要大量的能量。由以上商量可見，在軟骨分化和發(fā)育過程中，囊泡和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起著重要的作用。第五章 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)主要利用光學(xué)顯微鏡和JEOL 100-CX透射電鏡，對(duì)2天、3天、6天、10天的斑馬魚進(jìn)行了觀察商量。主要商量了斑馬魚脊椎軟骨的發(fā)育進(jìn)程，以及軟骨細(xì)胞特別是脊索旁軟骨的排列，形貌，大小及其顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和中胚層分化的顯微形貌。主要得出以下結(jié)論：1. 斑馬魚脊椎軟骨在配

52、卵后23天開頭發(fā)育，圍繞在脊索周圍，并逐漸向神經(jīng)管和血管方向延長。斑馬魚脊椎軟骨沿體節(jié)發(fā)育，在1個(gè)半月左右的時(shí)間，軟骨組織的分化基本完成。2. 斑馬魚的軟骨組織排列較為整齊，脊索旁軟骨末端和頭部軟骨細(xì)胞為單排排列。大多數(shù)軟骨細(xì)胞大小在520m范圍內(nèi)。斑馬魚的軟骨組織為透明軟骨，胞外基質(zhì)含量較少，主要為II型膠原纖維。3. 在TEM的觀察中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的肌肉組織分化較早，在3天已基本分化完成。而體干部的脊索旁仍為中胚層的間葉細(xì)胞，為軟骨細(xì)胞的原基。4. 中胚層間葉細(xì)胞的細(xì)胞核很大，在分化成軟骨細(xì)胞的過程中，首先是在外形和排列上趨于整齊和規(guī)章。5. 斑馬魚的骨化方式為軟骨骨化。軟骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富

53、含大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，在細(xì)胞的分化和更替過程中分別起著降解細(xì)胞質(zhì)和供應(yīng)能量的作用。在細(xì)胞質(zhì)中還有大量直徑為100-400nm的囊泡，推測(cè)囊泡對(duì)基質(zhì)的輸運(yùn)和新組織的形成有著重要的作用。6. 脊髓處的細(xì)胞的細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)含量很少，有別于軟骨細(xì)胞。并且該處細(xì)胞有部分死亡，被其它細(xì)胞取代。參考文獻(xiàn)1. Miyake.T,Hall.BK.(1994). Development of in-Vitro Organ-Culture Techniques for Differentiation and Growth of Cartilages and Bones from Teleost Fish an

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