轉(zhuǎn)不同外源基因提高薯類作物抗逆能力的研究

1、轉(zhuǎn)不同外源基因提高薯類作物抗逆能力的研究薯類作物又稱為根莖類作物，主要包括馬鈴薯、甘薯和木薯等以塊根塊莖為主要糧食、飼料及工業(yè)加工材料來源的作物。薯類作物在我國的糧食生產(chǎn)中排第四，種植面積達到了1.3億畝。薯類作物共有的特性為耐瘠、耐旱、適應(yīng)力廣，為高產(chǎn)救荒類作物，且都以無性繁殖為主。在我國，薯類作物主要種植于北方干旱半干旱地區(qū)，而日益嚴重的干旱及其他環(huán)境問題也嚴重制約了當下糧食作物的生長和產(chǎn)量，因此，提高薯類作物的抗逆能力及產(chǎn)量形成，對我國北方地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展有著重要的意義。在本研究中，以甘薯和馬鈴薯這兩種主要的薯類作物為實驗材料，采用或培育了外源超表達不同具有提高植物抗逆能力基因的轉(zhuǎn)基因植株

2、，通過以水分脅迫和鹽漬脅迫為主的非生物脅迫的室內(nèi)實驗處理，對轉(zhuǎn)基因植株和對照株在產(chǎn)量構(gòu)成、抗氧化酶系統(tǒng)、氧化傷害、光合作用及基因表達等方面進行了研究，以此探討超表達不同基因的轉(zhuǎn)基因甘薯或馬鈴薯對逆境脅迫的生理響應(yīng)機制。主要研究內(nèi)容如下：1.采用盆栽控水方法，在甘薯的薯塊膨大期共設(shè)置正常供水（土壤含水率為田間最大持水量的80%）；中度脅迫（土壤含水率為田間最大持水量的60%）和重度脅迫（土壤含水率為田間最大持水量的40%），實驗材料為轉(zhuǎn)Cu/ZnSOD和APX基因的轉(zhuǎn)基因甘薯（TS）及非轉(zhuǎn)基因甘薯（NT。結(jié)果表明，TS中的SOtMAPX酶的活性、可溶性糖含量均高于NT,但是POD酶則表現(xiàn)出相反的

3、趨勢。隨著干旱程度的加劇，兩個株系甘薯中的APX酶活、可溶性糖含量、光合速率及蒸騰速率均逐漸降低。雖然從干旱的第20天到第70天兩株系甘薯中的光合參數(shù)均表現(xiàn)出下降的趨勢，但凈光合速率在TS和NT之間沒有顯著的差異。在中度脅迫下兩株系甘薯中的產(chǎn)量最高而在重度脅迫下最低，其中TS的產(chǎn)量顯著高于NT。在不同的水分條件下，TS的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著低于NT,因而降低了水分的散失，使水分利用效率增高。實驗說明，在薯塊膨大期，干旱脅迫下超表達的Cu/ZnSO于口APX基因能夠提高*$基因甘薯中SO于口APX酶的活性、可溶性糖的含量和水分利用效率，最終提高了甘薯的產(chǎn)量。2. 馬鈴薯是重要的糧食作物之一，在

4、全世界范圍內(nèi)，已經(jīng)培育出了上千種的不同基因型的馬鈴薯品種。馬鈴薯主要種植于干旱半干旱地區(qū)，因此，馬鈴薯的抗逆能力是應(yīng)對環(huán)境脅迫的最主要的因素。本實驗的實驗?zāi)康氖菍⑽宸N來自不同地區(qū)的馬鈴薯品種，經(jīng)過干旱、鹽漬、高溫和氧化脅迫不同的環(huán)境脅迫處理，從這幾個品種中篩選出對一種或幾種脅迫具有更強抗性的品種。實驗結(jié)果表明，由中國甘薯農(nóng)科院馬鈴薯研究所培育的馬鈴薯品種隴薯三號對干旱，鹽漬以及氧化脅迫有較強的綜合抗性，主要表現(xiàn)為具有更強的SODftAPX酶活性，更強的根系生長能力和根干重，但是該品種對高溫相對敏感。美國的Superior這一馬鈴薯品種與隴薯三號的特性相反，表現(xiàn)出對高溫有很強的耐受性，在經(jīng)過24

5、小時的38c高溫處理后葉片含水量和Fv/Fm仍維持在較高水平，但對干旱和鹽漬敏感。富含花青素的JaYoung品種，表現(xiàn)出了較強的綜合抗性，與花青素這一抗氧化劑有密不可分的關(guān)系。3. 可以被膽堿氧化酶（COD催化合成的甜菜堿，在植物體中是具有很強地活性氧清除能力的可溶性物質(zhì)，同時也具有保護光和系統(tǒng)和大型功能蛋白的能力。為了研究膽堿氧化酶（CodA）基因?qū)︸R鈴薯耐旱能力及旱后恢復(fù)能力的影響，本實驗對外源轉(zhuǎn)入膽堿氧化酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（S。及其野生型對照株（NT）進行了中度和重度的水分脅迫處理，以此研究外源轉(zhuǎn)入的膽堿氧化酶對馬鈴薯抗旱及旱后修復(fù)能力的影響。實驗包括一個持續(xù)兩天，用20%PE覦行的預(yù)處理

6、實驗，和一個由四天水分脅迫處理和兩天旱后恢復(fù)組成的脅迫處理實驗兩部分。在四天的水分脅迫處理中，植物被分別置于對照（0%PE6中度脅迫（10%PEG和重度脅迫（20%PEG三種水分處理中，在第五天時對所有的馬鈴薯植株提供正常的水分條件使其恢復(fù)。預(yù)處理實驗的結(jié)果證明了CodA基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達和甜菜堿在馬鈴薯中的積累，同時其水勢也顯著高于對照植株。在脅迫及修復(fù)的處理中，SC相對于NT表現(xiàn)出更強的抗氧化能力，更高效的光和系統(tǒng)，更高的葉綠素含量，較低的MD給量以及更好的旱后修復(fù)能力。4. 農(nóng)桿菌侵染法是在馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用較為成熟的方法，在本實驗中采用的農(nóng)桿菌載體為pCAMBIA2300

7、首先將由甘薯中克隆得到了IbMYBI基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌載體中，利用葉盤法將農(nóng)桿菌與馬鈴薯葉片組織進行共培養(yǎng)后，通過誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織分化以獲得新的擬轉(zhuǎn)基因再生馬鈴薯株系。通過大量的組培工作，卡那霉素篩選，對質(zhì)粒DNA勺基因特異性引物的PCR分析，證實了已經(jīng)成功了將外源基因整合到了馬鈴薯基因組中，共獲得了11個IbMYBI轉(zhuǎn)基因株系。冉通過高溫脅迫后的RT-PCR析，IbMYBI基因能夠在SWPA2啟動子的調(diào)控下在轉(zhuǎn)錄水平上進行表達，并以此為基礎(chǔ)篩選出了兩個基因表達量較高的株系：SM異口SM125. IbMYBI是屬于R2R2-MY瞄一個大的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個轉(zhuǎn)錄因子，已有的研究表明它的功能主要表現(xiàn)為調(diào)控植物中花青素的合成。在前一個階段的實驗中，IbMYBI已經(jīng)被成功的轉(zhuǎn)入了馬鈴薯隴薯三號中，且經(jīng)過篩選最終確定了SM用口SM12兩個轉(zhuǎn)基因株系為生理階段實驗材料，同時將轉(zhuǎn)入空白載體的轉(zhuǎn)基因株系作為對照株系，在本研究中，對三個株系進行鹽脅迫處理，以研究外源基因?qū)D(zhuǎn)基因馬鈴薯在鹽脅迫處理下的生理調(diào)控。結(jié)果表明，IbMYBI基因表達量顯著增強的轉(zhuǎn)基因株系在含NaCl的培養(yǎng)基中受到的抑制更低，根干重顯著高于對照。同時，在用含300mMNaC的水澆灌六天的馬鈴薯植株中，相對于對照，轉(zhuǎn)基因株系中積累了更多的次生代謝產(chǎn)物，更強的