Optogenetics光基因?qū)Wfss

1、Optogenetics Optogenetics School of Life Science, PKU光遺傳學(xué)及光學(xué)在其中的應(yīng)用光遺傳學(xué)及光學(xué)在其中的應(yīng)用Photo courtesy: Nature ViodeoOpto: related with opticsGenetic: Expression, regulation of genesPhoto courtesy: Nature ViodeoAndNeuroscience.tw/neuroscience/Single-component optogenetics 單單組分光遺傳學(xué)組分光遺傳學(xué)19

2、79，F(xiàn)rancis Crick提出： 神經(jīng)生物學(xué)主要挑戰(zhàn)控制腦中一種神經(jīng)細(xì)胞，而使其他細(xì)胞保持不變。神經(jīng)元的激活或者抑制行為的變化行為的獲得或者缺失 神經(jīng)元的變化復(fù)雜病理機制的研究阿茲海默癥PET scanning 視蛋白視蛋白(Opsins)的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)1971，Stoeckenius and Oesterhelt發(fā)現(xiàn)細(xì)菌視紫紅質(zhì)在光激發(fā)下有離子泵的作用；1977，Matsuno-Yagi and Mukohata發(fā)現(xiàn)鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)；光照激發(fā)- 離子泵活動- 動作電位、神經(jīng)沖動Stoechkenius et al, 1971離子通道與動作電位離子通道與動作電位動作電位與離子通道 神經(jīng)細(xì)胞膜

3、電位為負(fù)； 膜內(nèi)外離子濃度不同； 去極化膜電位上升，超極化膜電位下降； 動作電位與離子進(jìn)出相關(guān)Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光遺傳學(xué)未應(yīng)用于神經(jīng)學(xué)光遺傳學(xué)未應(yīng)用于神經(jīng)學(xué) 外源蛋白質(zhì)對脆弱的神經(jīng)元造成傷害； 光電流太微弱、速度慢； 不滿足Single-component strategy視蛋白的作用需要一個共同作用因子 all-tans retinal（全反式視黃醛）視蛋白與離子通道視蛋白應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)開端視蛋白應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)開端2005年8月， Karl Deisseroth課題組發(fā)表報告： 在神經(jīng)元中只導(dǎo)

4、入視蛋白基因，而無其他化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)入，使得神經(jīng)元在光照刺激下發(fā)生反應(yīng)。 脊椎動物組織中有視黃醛，光控效果理想視黃醛結(jié)構(gòu)Karl Deisseroth 1971 born， B.A. Biochemistry, Harvard; M.A. & Ph.D. Neuroscience, Standford; Creating CLARITY & optogenetics135光光遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience Keyword: bacteriorhodop

5、sin Keyword:optogenetics135細(xì)菌視紫紅質(zhì)19711971鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)1977,19821977,1982視紫紅質(zhì)通道蛋白1984,1991,20021984,1991,2002三種重要視蛋白的發(fā)現(xiàn)Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展135細(xì)菌視紫紅質(zhì)在神經(jīng)元和線蟲行為獲得中應(yīng)用，20052005神經(jīng)元與光纖的接觸，光基因?qū)W在線蟲行為缺失、哺乳動物行為獲得中的應(yīng)用，20072007通過軸突投射和重組酶實現(xiàn)的行為控制，閉環(huán)光基因?qū)W，20092

6、009視蛋白Opsin在神經(jīng)學(xué)研究中的應(yīng)用和設(shè)備發(fā)展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作發(fā)展 2010年Optogenetics被評為Nature年度技術(shù)，此后領(lǐng)域內(nèi)跟進(jìn)大量研究 光學(xué) 微電子 蛋白質(zhì)工程 神經(jīng)生物學(xué)Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience2010Nature2010Nature年度技術(shù)年度技術(shù)l光遺傳學(xué)的由來與神經(jīng)生物學(xué)研究l視蛋白的發(fā)現(xiàn)、離子泵作用l神經(jīng)學(xué)家渴求的單組分研究工具

7、l光遺傳學(xué)的發(fā)展進(jìn)程l光遺傳學(xué)的具體研究l光遺傳中光學(xué)的作用以及待解決的問題光遺傳學(xué)光遺傳學(xué)光遺傳學(xué)光遺傳學(xué)l光遺傳學(xué)的由來與神經(jīng)生物學(xué)研究l光遺傳學(xué)的具體研究l視蛋白的原理和開發(fā)l光遺傳神經(jīng)生物學(xué)研究過程l光遺傳中光學(xué)的作用以及待解決的問題Optogenetics: controlling cell function with light, Nat. Method,2011視蛋白與神經(jīng)細(xì)胞動作電位視蛋白與神經(jīng)細(xì)胞動作電位激活型通道：陽離子自由進(jìn)出，去極化更容易；抑制型通道：氫離子外流，或氯離子內(nèi)流，膜電位超極化；激活和抑制疊加2012 Hideaki Kato et al視蛋白離子泵作用原理

8、視蛋白離子泵作用原理結(jié)構(gòu)與功能光照結(jié)構(gòu)域光譜吸收構(gòu)象變化特定離子沿梯度進(jìn)出X射線衍射得到ChR感光部分的結(jié)構(gòu)細(xì)菌視紫紅質(zhì)H+泵示意圖Inbal Goshen et al, Cell, 2011視蛋白家族視蛋白家族光遺傳學(xué)神經(jīng)研究的重要工具 視蛋白的光譜、峰值、半衰期數(shù)據(jù)方法方法：位點突變（蛋白質(zhì)工程），基因組掃描 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遺傳學(xué)光遺傳學(xué)l光遺傳學(xué)的由來與神經(jīng)生物學(xué)研究l光遺傳學(xué)的具體研究l視蛋白的原理和開發(fā)l光遺傳神經(jīng)生物

9、學(xué)研究過程l光遺傳中光學(xué)的作用以及待解決的問題Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience, Nat.Neuronsci.,2015光遺傳學(xué)神經(jīng)研究過程光遺傳學(xué)神經(jīng)研究過程視蛋白基因轉(zhuǎn)入視蛋白基因轉(zhuǎn)入腺病毒轉(zhuǎn)染視蛋白基因過程 通過腺病毒在神經(jīng)細(xì)胞中導(dǎo)入視蛋白基因 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光纖插入與顱頂固定光纖插入與顱頂固定兼給藥和光線插入視蛋白注入點和光照區(qū)域的吻合改進(jìn)：加轉(zhuǎn)動關(guān)節(jié)，便于實驗動物運動；固定光纖和金屬片，減少對神經(jīng)組織的傷

10、害，減小動物壓力光纖裝置示意圖Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience視蛋白激發(fā)或者抑制動作電位效果驗證視蛋白激發(fā)或者抑制動作電位效果驗證光照刺激后動作電位記錄結(jié)論： 光照可引起神經(jīng)沖動光激發(fā)小鼠從冷凍狀態(tài)的恢復(fù)光激發(fā)小鼠從冷凍狀態(tài)的恢復(fù)The Microbial Opsin Family of Optogenetic Tools, Cell, 2011視頻一 未導(dǎo)入視蛋白基因小鼠光照后無明顯反應(yīng)視頻二 導(dǎo)入視蛋白基因小鼠在光線刺激下從冷凍狀態(tài)恢復(fù)Optogenetics: 10 years of microbial o

11、psinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遺傳學(xué)光遺傳學(xué)l光遺傳學(xué)的由來與神經(jīng)生物學(xué)研究l光遺傳學(xué)的具體研究l視蛋白l顱外裝置l光遺傳中光學(xué)的應(yīng)用及待解決的問題l光源l光信號檢測Optical neural interfaces, Melissa R. Warden et al, 2014光源的選擇光源的選擇1激光激光激光：laser diode、DPSS（全固態(tài)半導(dǎo)體激光器）視蛋白激發(fā)：1-5mW/mm2細(xì)胞組織反射和散射：100mV優(yōu)點：定位準(zhǔn)確，帶寬窄缺點： 費用較高，$1,000 for 473-nm laser, $5

12、,000-10,000 for 590-nm laser； 激光光源比較脆弱，warm-up time比較長； 體積較大，需專用光學(xué)工具實現(xiàn)光纖耦合； 轉(zhuǎn)接環(huán)：方便運動，價格&能量損失多位點光源輸出光源的選擇光源的選擇2LEDLED: PN結(jié)中載流子復(fù)合，轉(zhuǎn)化電能為光能LED置于顱外、皮質(zhì)層，插入腦內(nèi)，或者與光纖耦合深入腦內(nèi) 價格經(jīng)濟(jì)（$300），便捷，有多個波段的發(fā)光 容易與已有的電生理通道對接缺點： 易造成局部過熱，故不能插入大腦深處； 與光纖耦合能力較弱； 光帶相對比較寬，對于bistable opsin的使用造成困難； 容易造成電流刺激偽跡;神經(jīng)電生理工具光源的選擇光源的選擇2

13、LEDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)材料：GaN材料，藍(lán)光方法：材料擠壓后灌入針頭，由針頭注射進(jìn)入組織間隙深處，粘合劑溶解，抽出針頭Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意圖IPD: inorganic photon detector;ILED: inorganic LED；光源的選擇光源的選擇2LEDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)優(yōu)點： 體積50*50*60m，小于光纖(200m)； 減少神經(jīng)細(xì)胞傷害、炎癥； 可與其他材料

14、的條帶一同注射，如熱學(xué)材料、電生理感受器;局部過熱問題： 0.3mm深度， 23.5mW/mm2-上升10Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意圖 猴子等動物馴養(yǎng)時間成本、人力成本高，組織切片需要處死動物神經(jīng)活動的光學(xué)信號神經(jīng)活動的光學(xué)信號熒光化學(xué)物熒光化學(xué)物 Ca2+離子轉(zhuǎn)錄蛋白指示劑 （GECIs: genetically encoded Ca2+ indicators） 基于綠色熒光蛋白和鈣離子結(jié)合域的蛋白，鈣離子濃度變化導(dǎo)致熒光變化（激光激發(fā)） 變種完善：發(fā)出不同波長的熒光，基于細(xì)胞膜電壓變化 小分子熒光染料：電

15、壓或鈣離子濃度 1.fast, sensitive, but not cell-type-specific 2.每次成像前都需要注射，可以持續(xù)幾分鐘到幾小時光纖讀?。悍从齿^大范圍內(nèi)的神經(jīng)元熒光情況神經(jīng)活動的光學(xué)神經(jīng)活動的光學(xué)讀取讀取光纖光纖 GCaMP3(基于GFP的鈣離子指示蛋白) 激發(fā)：單模 檢測：多模，16-channel PMT ； TCSPC(time-correlated single-photon counting)光子數(shù)量統(tǒng)計Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014 Ca2+ 染料注射：200-m，0.48-N.A.

16、光纖，PMT收集和檢測光子神經(jīng)活動的光學(xué)讀取神經(jīng)活動的光學(xué)讀取單光子與雙光子單光子與雙光子目標(biāo)：精準(zhǔn)讀取，高時空分辨率單光子和雙光子顯微鏡雙光子和單光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡成像 雙光子激發(fā)，非線性光學(xué)，熒光強度衰減與1/z2成正比，光強集中雙光子與單光子激發(fā)的結(jié)果比較雙光子與單光子激發(fā)的結(jié)果比較John Peter Rickgauer et al, Nat. Neuronsci, 2014Two Photon Excitation Vs Single Photon Excitation單光子與雙光子比較： 單光子深度不超過50-100m； 雙光子能穿透至500m，掃描時間較長，視野小，運動偽

17、跡參數(shù)：25g，7.5cm近紅外激光：Ti:Sapphire 激光器能夠于成像200-250m深度神經(jīng)活動的光學(xué)讀取神經(jīng)活動的光學(xué)讀取 雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學(xué)In awake, freely moving rats, stable imaging was possible except during sudden head movements.A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2

18、001神經(jīng)活動的光學(xué)讀取神經(jīng)活動的光學(xué)讀取 雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學(xué)一對衍射光柵消除色散A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡信號掃描信號掃描A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neu

19、ro, 2001壓電材料獲得光纖振動；二維不同頻，300-800Hz信號掃描設(shè)計李薩如圖形雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡掃描相位矯正掃描相位矯正A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001解決驅(qū)動相位與掃描相位不一致發(fā)光位置的坐標(biāo)定位相移補償和定位雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡信號控制系統(tǒng)信號控制系統(tǒng)A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolutio

20、n brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001信號控制系統(tǒng)運動偽跡明顯： 掃描時間長，掃描視野小矯正方法： Heart-beat triggering scanning Licking correction with tunable lens Adaptive image-based movement compensation system雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡缺點和矯正方法缺點和矯正方法微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學(xué)A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014神經(jīng)活動的光學(xué)讀取神經(jīng)活動的光學(xué)讀取 單單光子顯微鏡光子顯微鏡特點： 儀器聚集在頭部裝置 成像速度快，運動偽跡少 工具量產(chǎn)性能參數(shù)： 600-800m視野，2.5m分辨率，每秒36-100幀微型單光子顯微鏡用于光遺傳學(xué)目前光遺傳學(xué)有待改進(jìn)的地方目前光遺傳學(xué)有待改進(jìn)的地方Crystal structure of th