基因毒性雜質(zhì)培訓(xùn)及討論20151025

1、基因毒性雜質(zhì)培訓(xùn)及討論2015.10.20 一、基因毒性雜質(zhì)基本信息 基因毒性雜質(zhì)介紹 基因毒性雜質(zhì)文件 二、ICH M7介紹及實例討論 M7適用范圍介紹 基因毒性雜質(zhì)評估及分類 基因毒性雜質(zhì)控制策略 三、問題討論目錄基因毒性雜質(zhì)基本信息雜質(zhì)的分類：雜質(zhì)的分類：Q3A/B/C/D：有機雜質(zhì)：起始物料、副產(chǎn)物、中間體、降解產(chǎn)物等無機雜質(zhì)：重金屬或其他殘留金屬、無機鹽；其他（如濾紙、活性炭）殘留溶劑M7&M7 Addendum： 基因毒性雜質(zhì) ICH外的雜質(zhì)：外源性污染物：微生物，內(nèi)毒素等。多晶型：晶型雜質(zhì)。什么是基因毒性雜質(zhì)是指能直接或間接損傷細胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌作用的物質(zhì)?；?/p>

2、毒性包括致癌性和致突變性： 致癌性主要指誘變性致癌： 第一級(Group 1)致癌物：對人類為確定致癌物。 第二級，對動物致癌性明確，對人類致癌性不確定致突變 致突變性和致癌性緊密相關(guān)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒物，致癌性強的，70% 都有比較強的致突變性致癌物分成兩大類：1、遺傳毒性致癌物，通過化學(xué)鍵合直接破壞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生致癌性； 2、非遺傳毒性致癌物， 通過遺傳物質(zhì)外的間接機制引起致癌作用（ 如促進細胞過度增殖等）。什么是基因毒性雜質(zhì)1970 年代，James 和Elizabeth Miller 夫婦在研究“烷化劑”和“?；瘎钡闹掳┬缘幕A(chǔ)上，提出了“親電性致癌論”。成為多個商業(yè)化和非商業(yè)化的毒性預(yù)測

3、軟件的理論基礎(chǔ)。常見的基因毒性物質(zhì)苯并芘、黃曲霉素、亞硝胺化療藥物，不良反應(yīng)是化療藥物對正常細胞的基因毒性所致，如順鉑、卡鉑、氟尿嘧啶等。氨基糖甙類抗生素為什么研究基因毒性雜質(zhì)呀？。甲磺酸奈非那非（維拉賽特錠）事件一種用于HIV治療的抗病毒藥物，1997年FDA批準，羅氏1998年歐洲上市羅氏2007年6月接到6名患者投述DNA序列異常羅氏2007年6月召回產(chǎn)品，EMEA暫停上市發(fā)現(xiàn)儲存罐中乙醇殘留，放置3個月導(dǎo)致甲磺酸乙酯達到2300ppm去掉存儲罐，增加對甲磺酸乙酯的控制要求低于0.5ppmEMA對新工藝重新進行了評估、對工廠進行現(xiàn)場檢查2007年10月，Roche重新獲得上市許可甲磺酸奈

4、非那非（維拉賽特錠）事件后續(xù)2008.01.24 EMEA關(guān)于要求進行基因毒性雜質(zhì)評估的函件函件內(nèi)容針對所有藥品中含以甲磺酸鹽，羥乙基磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽或苯磺酸鹽形式存在之藥物活性成分之上市許可持有人以TTC法對該類雜質(zhì)進行限度控制哪些化合物是基因毒性雜質(zhì)歐盟發(fā)布的警示結(jié)構(gòu)Development of structure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents?；蜻M入The Carcinogenic Potency Database (CPDB)， 里面有1547 種致癌物質(zhì)的列表，結(jié)構(gòu)式，CAS 號，作用部位， TTC 值等

5、一系列信息。Ashby 等人總結(jié)出來18 種警示結(jié)構(gòu)的模型，并將這些結(jié)構(gòu)特征整合到一個“超級致癌物”虛擬分子結(jié)構(gòu)中Group1:Aromatic Groups(芳香族化合物）:NAOHN-Hydroxyaryls N-羥基苯胺NAAON-Acylated aminorryls N-酰化氨基苯NO+_Aza-aryl N-oxides氮雜芳基N-氧化物NAAAminoaryls and alkylated aminoaryls芳香胺和烷基取代的芳酰胺Group 2:Alkyl and Aryl Groups(烷烴和環(huán)烷烴類化合物）AHOAldehydes 醛NAAOHN-MethylolsN-亞

6、甲基醇NAANON-Nitrosamines N-亞硝基胺ANO2Nitro compounds 硝基化合物OANH2OCarbamates氨基甲酸類OAAEpoxides環(huán)氧丙烷HNAAAziridines氮丙啶類OCO(S)Propiolactones 環(huán)丙酯NHalogen(S)N or S Mustards 鹵代乙胺NNRAAAHydrazines and azo Compounds肼和偶氮化合物Group 3:Heteroatomic Groups(含雜原子化合物）EWGMichale-reactiveAcceptors邁克爾加成反應(yīng)受體POORSOORAlkyl Esetrs of

7、 Phosphonates or Sulfonates 膦酸酯或者磺酸酯HalogenHalo-alkenes鹵代烯烴AHalogenPrimary Halides烷烴和環(huán)烷烴鹵代物哪些化合物是基因毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)基因毒性雜質(zhì)基本信息基因毒性雜質(zhì)控制相關(guān)文件及指南介紹遺傳毒性雜質(zhì)指南：控制，檢驗和風(fēng)險評估 指南類別指南類別 指南名稱指南名稱遺傳毒性雜質(zhì)控制控制指南PhRMA 意見書：測定、檢驗和控制藥物中特定潛在遺傳毒性雜質(zhì)的基本原理 (2006)。EMA：遺傳毒性雜質(zhì)限度指南。EMA安全工作組 (SWP)：關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)限量指南的問答FDA 行業(yè)指南（草案）：原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌

8、性雜質(zhì)：推薦方法 (2008)。ICH M7：誘變性雜質(zhì)評估和控制遺傳毒性試驗試驗指南ICH S2：人用藥物的遺傳毒性試驗和數(shù)據(jù)解釋。EMA：草藥物質(zhì)/制劑遺傳毒性評估指南 (2008)。遺傳毒性和致癌性物質(zhì)的風(fēng)險評估風(fēng)險評估歐盟委員會健康與消費者保護局：遺傳毒性和致癌性物質(zhì)一般風(fēng)險評估的方法學(xué)和途徑 (2009)。有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的指南EMEAEMEA （歐洲藥品局） 2006年首先頒布了基因毒性雜質(zhì)限度指南，并自2007年1月1日起正式實施。 該指南為限制新活性物質(zhì)中的基因毒性雜質(zhì)提供了解決問題的框架和具體做法。彌補了ICH Q3不足 引入了毒理學(xué)關(guān)注閾值 (TTC) 的概念及其取值 提出

9、了遺傳毒性雜質(zhì)可接受性評估的決策樹FDAFDA 2008年12月正式簽發(fā)：原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)，推薦方法 (2008) 。 繼EMEA指南發(fā)表的適用于美國的文件，內(nèi)容和EMEA指南基本一致 主要內(nèi)容包括： 原料藥和制劑中的基因毒性雜質(zhì)生成的預(yù)防辦法 基因毒性雜質(zhì)的分析方法、處理方法和減少方法 上市申請和臨床研究申請的可接受限度 草藥原料藥和制劑中基因毒性雜質(zhì)評估指南有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的指南有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的指南ICH M7：二、ICH M7介紹及實例討論M7適用范圍介紹基因毒性雜質(zhì)評估及分類基因毒性雜質(zhì)控制策略 情景情景原料藥原料藥制劑制劑備注備注新原料藥和制劑是是M7基本意圖新

10、化合物及制劑的臨床申請是是M7基本意圖M7適用范圍介紹上市后變更-原料藥研發(fā)、生產(chǎn)和控制 起始物料后的合成路線、試劑、溶劑或工藝條件變更時特別是，變更評估要確定其是否會導(dǎo)致任何新的誘變性雜質(zhì)或已知誘變性對原料藥、中間體或起始物料的生產(chǎn)場所的變更，或變更原料供應(yīng)商則不需要對誘變性雜質(zhì)風(fēng)險重新進行評估。 原料藥用于新劑型，不需要重新評估上市后變更-制劑研發(fā)、生產(chǎn)和控制 上市后申報涉及制劑（例如、成分、生產(chǎn)工藝、劑型），則應(yīng)對所有新的誘變性降解產(chǎn)物或已有誘變性降解產(chǎn)物更高的可接受標準進行評估。制劑生產(chǎn)場所變更不需要重新評估。復(fù)方制劑使用已上市成分和新成分，已上市不需要重新評估，新成分需要評估上市后變

11、更-臨床使用 臨床使用劑量的顯著增加、用藥時長的增加，需重新評估在病情較嚴重或危及生命的病患狀態(tài)下采用較高可接受攝入量的情況，變成不那么嚴重的病患，原有的雜質(zhì)可接受攝入量可能不再適當。已上市藥品的臨床應(yīng)用變更包涵：使用新的給藥途徑，或擴大使用患者群，（孕婦和/或小兒），需重新評估以下類型的原料藥和制劑：生物/生物技術(shù)制品、肽類、寡核苷酸、放射藥物、發(fā)酵產(chǎn)品、草藥制品和動物或植物來源的粗品本指南不適用于ICH S9中所定義的晚期癌癥指征用原料藥和制劑。不適用于已上市藥物中使用的輔料、調(diào)味劑、著色劑和香料。不適用于藥物包材中的可浸出雜質(zhì)。如果輔料首次使用，且是化學(xué)合成的，則本指南適用。M7不適用范

12、圍介紹二、ICH M7介紹及實例討論M7適用范圍介紹基因毒性雜質(zhì)評估及分類基因毒性雜質(zhì)評估及分類基因毒性雜質(zhì)控制策略第1類：已知的、具有基因毒性（突變性）和致癌性的雜質(zhì)第2類：已知的、具有基因毒性（突變性），但致癌性未知的雜質(zhì)第3類：具有警示結(jié)構(gòu)、與API無關(guān)、基因毒性（突變性）未知的雜質(zhì)第4類：具有警示結(jié)構(gòu)、與API有關(guān)、基因毒性（突變性）未知的雜質(zhì)第5類：沒有警示結(jié)構(gòu)，沒有基因毒性（突變性）的雜質(zhì)基因毒性雜質(zhì)分類基因毒性雜質(zhì)分類及控制BNAmes等經(jīng)十余年努力，于1975年建立并完善的沙門氏菌回復(fù)突變試驗（亦稱Ames試驗）。原理：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriu

13、m）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。Ames試驗（埃姆斯實驗）-污染物致突變性檢測Ames試驗（埃姆斯實驗）-污染物致突變性檢測決策路線圖-雜質(zhì)的分類、驗證和風(fēng)險評估第一類No第二類TTC法No or unknowYesPDE法YesNot tested第三類第四類普通雜質(zhì)控制第五類NoNo清除雜質(zhì)？風(fēng)險評估用閾值控制該雜質(zhì)是否有基因毒性？該原料是否有基因毒性？基因毒性雜質(zhì)的限度計算：具有陽性致癌數(shù)據(jù)的誘變雜質(zhì)（第1類）-計算可接受攝入量（

14、AI） M7 Addendum中列出的15種化合物中有10個為該計算方法計算 Carcinogenicity Potency Database (CPDB）中列明了1574種致癌物質(zhì)的TD50值毒理學(xué)關(guān)注門檻-TTC法(第2/3類) ICHM7主要討論的方法，主要針對第2/3類基因毒性雜質(zhì)，比如低級磺酸酯類等。 有些化合物可能顯示出非常高的誘變性（關(guān)注的隊列），例如，黃曲霉毒素類、 N-亞硝基化合物、以及烷基-氧化偶氮結(jié)構(gòu)。則要顯著低于TTC法可接受攝入量。 有實際閾值證據(jù)的誘變性雜質(zhì)-使用不確定性因子（ICH Q3C計算允許日暴露量（PDE） 即非線性響應(yīng)的， M7 Addendum中列出的

15、15種化合物中有3個為該計算方法計算 ICHQ3C殘留溶劑計算采用該法。 比如雙氧水（M7 Addendum ）1、具有陽性致癌數(shù)據(jù)的誘變雜質(zhì)（第1類）-計算可接受攝入量（ AI）Threshold of Toxicological Concern (TTC，毒理學(xué)關(guān)注閾值) ：從給定的50% 腫瘤發(fā)生率（TD50）簡單線性外推線性外推到十萬分之一發(fā)生率（終生暴露情況下），采用的數(shù)據(jù)是來自于最敏感物種和最敏感腫瘤部位的TD50 數(shù)據(jù)。值為1.5ug/day。基于TTC 的方法一般被認為是非常保守的。該法最早用于食品及食品包材控制，EMEA指南中引入該法。相關(guān)概念介紹-TTC相關(guān)概念介紹- M7

16、 Addendum中AI介紹acceptable intakes(AI，可接受攝入量) ：通過從給定的50% 腫瘤發(fā)生率（TD50）簡單線線性外推性外推到十萬分之一發(fā)生率（終生暴露情況下），每日可以接受的攝入量。該法主要針對TD50確定的化合物，計算原理和TTC法一樣。 Carcinogenicity Potency Database (CPDB）中列明了1574種致癌物質(zhì)的TD50值。AI的TD50選擇，基于保守的目的，采用最敏感部位的TD50值，以及權(quán)威機構(gòu)的報道值（CPDB、NTP等）另外，有的物質(zhì)在特定部位有很強的敏感性，也是人體主要接觸方式（吸入），故通常會針對吸入有一個可接受攝入量

17、，值一般很低。AI的計算方法M7 Addendum中使用AI計算的10種化合物黃曲霉毒素（1402-68-2）：基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素,該類目前已經(jīng)鑒定出12種。其他致癌性已知雜質(zhì)的毒性計算-黃曲霉素CPDB查詢顯示：采用最敏感部位的TD50，即大鼠(rat)肝（liv）:TD50=0.00299mg/kg/天=0.00299ug/天假如每天服用的藥物為100mg，則該藥物中控制黃曲霉素的濃度限度為：C=AI/100mg=0.00000299%=0.0299ppm其他致癌性已知雜質(zhì)的毒性計算-亞硝胺、苯并芘 BenzoapyreneCAS No. 50-32-8Also known as

18、BaP毒理學(xué)關(guān)注門檻TTC法(第2/3類)-ICHM7中主要介紹方法根據(jù)TTC計算可接受攝入量時，一個具有誘變性的雜質(zhì)每天每人攝入1.5g時其風(fēng)險被認為是可以忽略的，可以通用于大部分藥物，作為默認的可接受限度控制標準。該方法一般用于長期治療用藥物中的誘變性雜質(zhì)（10年），且沒有致癌數(shù)據(jù)時（第2類和3類）。在不同的服藥時間周期，TTC值可以不同在不同的試驗階段（臨床試驗），TTC值不同。多個基因毒性雜質(zhì)，需要合并考慮限度結(jié)算如下： =1.5ug/day/劑量（g/day）低于生命周期（LTL）暴露對已知致癌物（第1類）的標準風(fēng)險評估，長期低劑量暴露于短期高劑量暴露有同樣風(fēng)險-可以依據(jù)暴露時長進行

19、調(diào)整。TTC計算的可接受日攝入量1.5g/天被認為是在終生每日暴露情況下可以受到保護的量。 累積終生劑量為;1.5g/天X25,550天=38.3mg 日攝入量可以高于平均終生日暴露量，而其風(fēng)險水平仍與每日或非每日治療方案相持平單個雜質(zhì)可以接受的攝入量時間劑量關(guān)系表2是從上述概念得到的數(shù)據(jù)，其中寫出了臨床研發(fā)階段和上市階段終生暴露LTL下可接受攝入量數(shù)值。如果給藥是間歇性的，則可接受日攝入量應(yīng)根據(jù)給藥總天數(shù)計算。例如，2年期間每周服用一次的藥物（即104個服藥天數(shù)），其可接受攝入劑量為每劑20 g。該擬定的攝入水平一般大大低于計算值，在很短期治療時，安全性更大，詳見下圖：短于生命周期的可接受攝

20、入量不同治療時長舉例LTL應(yīng)用于臨床階段和已上市藥物的情況-臨床階段采用LTL概念，誘變性雜質(zhì)的可接受攝入量在臨床研究中的治療期限最高為1個月、1-12個月及長于1年直到完成3期臨床試驗（表2）。保持早期臨床風(fēng)險水平為百萬分之一，后期臨床為十萬分之一。 進一步地，經(jīng)過調(diào)整的可接受攝入量可以應(yīng)用于14天的一期臨床試驗階段。只有1類和2類，以及3類中關(guān)注序列雜質(zhì)予以誘變性考慮。僅僅只是含有警示結(jié)構(gòu)（3類）不需要在一期臨床試驗期間進行評估如果治療時長不超過6個月，被接受的日攝入量符合100萬分之一患癌風(fēng)險水平。LTL應(yīng)用于臨床階段和已上市藥物的情況-已上市藥物已上市藥品的治療時長分類與可接受攝入量在

21、上表中列出。它可以用來預(yù)計絕大部分患者的暴露時長。有些情況下，患者中一部分人群可能會延長治療時長，延長治療時長導(dǎo)致的風(fēng)險增加（如上例，增加比例為1.5/100000）可以忽略。 在短期服用時，第1類，以及有特定閾值的也可以按上述的比例進行調(diào)整（臨床階段和已上市），或限制不超過0.1%(ICH 3A)，取低者例如，如果一個特定化合物的可接受服用量為終生暴露期15g/天，在短于終生時長暴露時的限度（表2）可以增加至100g（1-10年治療進長），200g（1-12月）或1200g（1個月）。但是，對于具有最大日服用劑量的藥物，例如，100mg，則0.1%的，取限度0.1%基因毒性雜質(zhì)的控制策略第三

22、種方法在原料、起始物料或中間體的質(zhì)量標準中包括對雜質(zhì)的檢測， 或作為中控檢測，同時制訂一個高于原料藥中可接受限度的質(zhì)量標準，采用適當?shù)姆治龇椒?，配合?jīng)過證明毒性認識， 在后續(xù)工藝中被清除的知識，并對后續(xù)工藝進行控制，保證原料藥中的該雜質(zhì)殘留水平低于可接受限度，不需要在后續(xù)工藝中再行檢測。當實驗室級試驗（鼓勵采用加樣試驗）數(shù)據(jù)，必要時可以采用中試生產(chǎn)或商業(yè)批次數(shù)據(jù)加以支持，顯示原料藥中雜質(zhì)水平低于可接受限度的30% 時，可以采用該方法。第三種方法實例ICHM7案例1：第3種控制策略舉例差2步到原料藥時，生成了中間體X，雜質(zhì)A在中間體X中常規(guī)檢出。雜質(zhì)A是一個穩(wěn)定的化合物，會被帶入原料藥。在實驗室

23、中，將雜質(zhì)A以不同濃度加入中間體X，發(fā)現(xiàn)即使在1%水平時，也能降到根據(jù)TTC制訂的限度的30%以下。由于中間體X的形成離原料藥只有2步，雜質(zhì)A在中間體X中的水平相對較高，因此另外又通過檢測不同中試規(guī)模批次中，原料藥里的雜質(zhì)A水平確認了工藝清除水平，獲得的結(jié)果為根據(jù)TTC制訂的限度的30%以下。因此，對中間體X中雜質(zhì)A控制在1.0%水平是可以接受的，不需要在原料藥標準中對該雜質(zhì)進行檢測。ICHM7案例2：第3種控制策略舉例 根據(jù)加樣研究采用標準分析方法所獲得的預(yù)期清除數(shù)據(jù)一個5步合成工藝中，起始物料Y在第3步引入，采用標準分析方法在起始物料Y中檢出雜質(zhì)B通常低于0.1%。為了確定0.1%的標準是

24、否可接受，在實驗室里進行了清除研究。將雜質(zhì)B以不同濃度（最高10%）加入起始物料Y中，通過最后3步工藝步驟，得到清除系數(shù)500倍。該清除系數(shù)應(yīng)用于起始物料Y含雜質(zhì)B為0.1%時，雜質(zhì)B在原料藥中的期望水平低于2 ppm。由于該值低于根據(jù)TTC限度計算的原料藥中該雜質(zhì)允許水平50 ppm，因此認為起始物料Y中雜質(zhì)B為0.1%的質(zhì)量標準是可接受的，不需要再提交中試生產(chǎn)數(shù)據(jù)或商業(yè)放大批數(shù)據(jù)。第三種方法實例第四種方法對工藝參數(shù)和殘留雜質(zhì)水平（包括致命性和清除知識）影響有了解，確信原料藥中的雜質(zhì)一定會低于可接受限度；建議該雜質(zhì)不需要進行分析測試（例如，不需要將雜質(zhì)列在任何質(zhì)量標準中）。在很多情況下，只需

25、要根據(jù)科學(xué)原理對該控制方法進行論述就可以了?？茖W(xué)風(fēng)險評估要素可以用來論證第4 種方法。第4種方法特別適用于不穩(wěn)定的雜質(zhì)（例如 ，二氯亞砜），以及那些在合成路線早期引入，但已被有效清除的雜質(zhì)?；蚨拘噪s質(zhì)的控制策略第四種方法實例ICHM7案例3：第2種和第4種控制策略舉例 結(jié)構(gòu)相似的誘變性雜質(zhì)一個5步合成工藝中第1步中間體是一個硝基芳烴化合物，可能含有較高水平的雜質(zhì)C（位置異構(gòu)物）。第1步中間體中雜質(zhì)C的量采用常規(guī)分析方法未能檢出，但可能以較低水平出現(xiàn)。第1步中間體細菌誘變含量呈陽性。第2步加氫反應(yīng)中第1步中間體轉(zhuǎn)化率為99%，得到對應(yīng)的芳烴胺。該轉(zhuǎn)化率通過中控檢測確認。對中間體殘留的清除情況進行了評估，第3步和第4