酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定方法 ELISA概述 ELISA基本原理 ELISA試劑的組成 ELISA測定方法 ELISA實驗過程 ELISA在食品檢測中的應用 ELISA在國外研究進展ELISAELISA概述概述 enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA ELISA屬于標記免疫學技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測中得到了廣泛的應用。目前市場上有多種基于ELISA方法開發(fā)的用于食品中抗生素檢測的試劑盒產(chǎn)品。 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定法和其他免疫方法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合

2、為基礎(chǔ)，其差別在于酶聯(lián)免疫方法以酶或者輔酶作為標記物來標記抗原或抗體，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。 其最大的特點是利用聚苯乙烯微量反應板（或球）吸附抗原或者抗體使之固相化，在其中進行免疫反應和酶促反應。ELISAELISA基本原理基本原理v使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗體的形成）v在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應（抗原抗體反應）v用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與干擾物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標抗原抗體復合物的分離）

3、 v加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應）ELISAELISA基本原理圖示基本原理圖示洗滌的方法將固相載體上的復合物與其他物質(zhì)分離 將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性 使抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標抗原或抗體加入酶反應底物，復合物上的酶催化底物使其分解，氧化或還原成有色產(chǎn)物 待測樣品與酶標抗原或抗體反應ELISAELISA試劑組成試劑組成完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）（3）酶的底物

4、（4）系列參考標準品（定量測定）（5）酶標記物及樣本的稀釋液（6）洗滌液（7）反應終止液 1.固定載體固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。2. 免疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。3. 酶標記物即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。 酶標記

5、物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在酶標記物中應盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。 在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)4. 酶的底物 HRP的底物常用的供氫體有鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 。 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高。 OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。 先進的ELISA試劑盒中則直接配成含

6、保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用。5. 洗滌液洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。 6. 酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，

7、在板式ELISA中一般采用2mol/L。7.參考標準品定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。 ELISAELISA測定方法測定方法ELISA常用測定方法主要直接法和間接法。直接法是酶標記抗體與待檢測樣本中固相抗原直接作用，加入底物后，顯色，其顏色深淺與樣本中抗原量成正比；間接法是使已知抗原吸附在固相載體上，與待檢測樣本中的抗體作用，加入酶底物，顯色，顏色深淺與樣本中抗體量成正比。ELISA大致分為三類：（1）測定抗體的間接法。（2）測定抗原的雙抗體夾心法。（3）測定抗原的競爭法。 前兩種方法主要

8、用于測定抗體和大分子抗原，適用于臨床診斷上，而競爭法事測定小分子抗原的方法，因而尤其適用于食品分析。 ELIZA 方法圖示間接法“Indirect” ELISA The steps of indirect ELISA follows the mechanism below:1.A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to adhere to the plastic through

9、charge interactions. 2.A solution of non-reacting protein, such as bovine serum albumin, or casein is added to block any plastic surface in the well that remains uncoated by the protein antigen. 3.Then the serum is added, which contains a mixture of the serum donors antibodies, of unknown concentrat

10、ion, some of which may bind specifically to the test antigen that is coating the well. 4.Afterwards, a secondary antibody is added, which will bind any antibody produced by a member of the donors species (for example, an antibody produced in a mouse that will bind any rabbit antibody). This secondar

11、y antibody often has an enzyme attached to it, which has no effect on the binding properties of the antibody. 5.A substrate for this enzyme is then added. Often, this substrate changes color upon reaction with the enzyme. The color change shows that secondary antibody has bound to primary antibody,

12、which strongly implies that the donor has had an immune reaction to the test antigen. This can be helpful in a clinical setting, and in R&D. 6.The higher the concentration of the primary antibody that was present in the serum, the stronger the color change. Often a spectrometer is used to give q

13、uantitative values for color strength雙抗體夾心法雙抗體夾心法非競爭結(jié)合反應非競爭結(jié)合反應 常用于抗原的檢測常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇同抗原決定簇Sandwich ELISA A less-common variant of this technique, called sandwich ELISA, is used to detect

14、 sample antigen. The steps are as follows: 1. Prepare a surface to which a known quantity of capture antibody is bound. 2. Block any non specific binding sites on the surface. 3. Apply the antigen-containing sample to the plate. 4. Wash the plate, so that unbound antigen is removed. 5. Apply enzyme

15、linked primary antibodies as detection antibodies which also bind specifically to the antigen. 6. Wash the plate, so that the unbound antibody-enzyme conjugates are removed. 7. Apply a chemical which is converted by the enzyme into a color or fluorescent or electrochemical signal. 8. Measure the abs

16、orbency or fluorescence or electrochemical signal (e.g., current) of the plate wells to determine the presence and quantity of antigen. A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) enzyme linked capture ant

17、ibody used as detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form. 競爭法如下圖所示.在進行測定時首先將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度的系列標準品溶液和酶標記物；在測定孔中同時加入酶標記物和待檢樣本（抗原），酶標記物和樣品互相競爭包被抗體的結(jié)合點，形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸附的酶標記物通過洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上的酶催化底

18、物使其水解、氧化還原成為有色的產(chǎn)物。當測定孔內(nèi)的樣本不含抗原時，固相上的抗體將和酶標記物結(jié)合加入底物后呈色較深，當樣本含有抗原時，樣本中的抗原和酶標記物共同競爭抗體的結(jié)合位點，酶標抗原的比例越高，結(jié)合在固相抗體上的酶標抗原就越多，酶標抗原的比例越低，結(jié)合在固相上的抗體就越少，而在一定的條件下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的量，從而進一步得知樣本中抗原的多少。這就是競爭法ELISA的原理。測定孔EEEEE底物溶液對照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣

19、本(含抗原)Competitive ELISA A third use of ELISA is through competitive binding. The steps for this ELISA are somewhat different than the first two examples:1. Unlabeled antibody is incubated in the presence of its antigen. 2. These bound antibody/antigen complexes are then added to an antigen coated we

20、ll. 3. The plate is washed, so that unbound antibody is removed. (The more antigen in the sample, the less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence competition.) 4. The secondary antibody, specific to the primary antibody is added. This second antibody is coupled to the enzyme

21、. 5. A substrate is added, and remaining enzymes elicit a chromogenic or fluorescent signal. ELISAELISA實驗過程實驗過程1. 實驗試劑的準備 按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。 ELISA實驗中應用蒸餾水或去離子水，自配的緩沖液的PH應用pH計進行較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。2. 加樣在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的

22、底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。3. 保溫 在ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點

23、。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。 為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進行溫育反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。4. 洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的

24、物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程如下： a.吸干或甩干孔內(nèi)反應液； b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）； c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短； d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干

25、； e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。5. 顯色和比色5.1 顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。底物顯色一般在室外溫或37反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達到顯色的頂峰，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結(jié)束時加入終止液終止反應。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。5.2 比色

26、比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如TMB的吸收波長為450nm，表示方法為A450nm或OD450nm。 酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）比傳統(tǒng)的檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速、方法操作簡單、樣品處理量大、使用范圍寬、檢測費用低、易商品化等優(yōu)點。因此可以肯定，酶聯(lián)免疫在食品領(lǐng)域必將得到廣泛的應用。ELISAELISA在食品檢測中的應用在食品檢測中的應用（1）檢測食品中的

27、毒素 目前發(fā)現(xiàn)能引起人中毒的霉菌代謝產(chǎn)物至少有150種以上，常見的產(chǎn)毒性真菌有曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮刀菌屬等，其中最常見且研究最多的是黃曲霉毒素、超曲霉毒素等。例如有報道利用酶聯(lián)免疫法測定醬油中黃曲霉毒素B1(AFTB1)。過去醬油的AFTB1測定多采用限量法，指標僅限于5g/kg。 有學者做了檢測證明，利用酶聯(lián)免疫測定法測定，最低檢出限為0.1ng/ml，如果采用樣品稀釋法排除干擾，稀釋50倍可排除共存物的干擾，按稀釋50倍算，最小檢出物濃度為50ng/ml。（2）檢測食品中的殘留農(nóng)藥 在美國已將其作為飲用水的檢測指標之一，規(guī)定最大殘留量為0.04mg/l。用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測克百威，已有報

28、道最低檢測限為0.01mg/l，線性檢測范圍為0.0110mg/l，回收率高于90%。用酶聯(lián)免疫法檢測殺蟲劑克百威殘留較常規(guī)的儀器分析具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等的優(yōu)點。（3）檢測食品中的微生物 目前，傳統(tǒng)的微生物檢測方法仍然是食品中的常用方法，但是存在操作繁瑣、時間長、工作量大等缺點，對大部分微生物來說，用傳統(tǒng)的檢測方法至少要45d，有些致病的微生物甚至無法進行人工培養(yǎng)。 各類肉品易受多種致病微生物的污染。其中沙門氏菌使人畜共患腸道病原菌和細菌性食物中毒重要的病原菌。原有的常規(guī)檢測方法，存在操作復雜、需要特殊的儀器、檢測時間長等弊端。因而開始有學者開始利用酶聯(lián)免疫吸附檢測法檢測沙門氏菌

29、。該方法比常規(guī)的培養(yǎng)法提前34d，不需要特殊的實驗設備，肉眼即可觀察結(jié)果，且樣品易保存。 （4）檢測食品中的其它成分 免疫球蛋白指具有抗體活性、能與相應的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，是構(gòu)成體液免疫的重要物質(zhì)。牛乳中特別是初乳中免疫球蛋白的含量特別高，最近開發(fā)的免疫乳，就是通過對乳牛進行免疫注射從而提高牛乳中免疫球蛋白的含量。因免疫球蛋白也是一種蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)的共性，但其在上述制品中的含量又相對較少，常規(guī)的蛋白質(zhì)的測定方法無法測出免疫球蛋白的含量。用酶聯(lián)免疫法即可成功解決這個問題，且同時完成含量與活性的檢測。 ELISA在國外研究進展 Shearera.L.通過實驗證實了ELISA應用于BF

30、DV（一種導致鸚鵡的嘴和羽毛病變的病毒）的檢測中與先前一直應用的HI試驗相比，試驗過程（對于樣品的處理等）大為簡化，而且ELISA試驗結(jié)果更加準確。 2008 Sacha Stelzer-Braid 在這篇文章中，通過試驗發(fā)現(xiàn)ELISA可以進行抗H5抗體快速檢測以適應臨床需要。但同時發(fā)現(xiàn)ELISA在進行H5抗體檢測的過程中會受到H3N2和H1N1的聯(lián)合作用而呈現(xiàn)出假陽性。 由于肉類產(chǎn)品在加工過程中摻假行為時有發(fā)生，同時考慮到以下三個方面的原因：首先肉類摻假會使經(jīng)濟波動，其次某些消費者有可能會發(fā)生變態(tài)反應，第三宗教的原因。從以上三點出發(fā)，我們就應該考慮到一種方法，來鑒定肉的真實性或是可靠性。由于

31、ELISA的快速專一等優(yōu)點，很快使其在這一領(lǐng)域大顯身手。 有學者就對熟肉制品的來源進行了ELISA的分析(Ayaz, Y., Ayaz, N. D., & Erol, I. (2006). Detection in meat and meat products using enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Muscle Foods, 17, 214.) 同樣在魚類食品深加工的過程中，也存在外形被破壞后無法進行種類識別的問題。而這種問題的存在往往導致一定的商業(yè)欺騙，如將一些不值錢的小魚混充值錢的魚類做成罐頭。因此進行這一方面的研究

32、也是有必要的，而Rehbein等人通過研究證實了ELISA再魚種類的檢測上與PCR技術(shù)比起來要簡單而且有效，更適合于大規(guī)模的生產(chǎn)應用?！綬ehbein, H., Sotelo, C. G., Pe rez-Mart n, R. I., Chapela-Garrido, M. J.,Hold, G. L., Russell, V. J., et al. (2002). Differentiation of raw orprocessed eel by PCR-based techniques: Restriction fragment length polymorphism analysis (

33、RFLP) and single strand conformation polymorphism analysis (SSCP). European Food Research and Technol-ogy, 214, 171177.】 在牛奶制備奶酪的過程中摻假的行為會導致諸如變態(tài)反應、宗教、道德等方面的問題。比如在以羊奶為原料的高級奶酪的制備過程中，常常有人會用一些山羊奶加上牛奶來冒充原料。而利用ELISA方法的可靠性和敏感性就可以檢測出那些造假的奶酪。Hurley等人就通過ELISA的方法在一些未注明含有牛奶的羊奶和水牛奶中將其檢測出來。 【Hurley, I. P., Colema

34、n, R. C., Ireland, H. E., & Williams, J. H. H. (2004).Measurement of bovine IgG by indirect competitive ELISA as a meansof detecting milk adulteration. Journal of Dairy Science, 87, 215221.】 果汁造假的現(xiàn)象時有發(fā)生，比如摻水或是摻入一些人造的成分。隨著果汁化學成分的研究深入，人們逐漸向果汁中加入一些果皮的提取物或是兌入一些廉價的果汁。而為了保證消費者的權(quán)利，杜絕這種現(xiàn)象，就要求有一種安全、快速、可靠

35、的檢測技術(shù)。Sass-Kiss在柚子汁和橘子汁方面的摻假檢驗方面做了深入的研究。 【Sass-Kiss, A., & Sass, M. (2000). Immunoanalytical method for quality control of orange juice products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 40274031. Sass-Kiss, A., & Sass, M. (2002). Distribution of various peptides in citrus fruits (gra

36、pefruit, lemon, and orange). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 21172120.】轉(zhuǎn)基因食品的不確定因素很多，如它或許可能會引起某些人的變態(tài)反應，因此在包裝時要進行標注。而有些廠家并不在意這一點，這實際上是一種欺騙行為。為了規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品的市場，需要一種可靠的檢測手段能夠準確地檢測出某種食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。ELISA在一些半成品或是生食中可以做為轉(zhuǎn)基因食品的檢測手段，但是對于完全加工的產(chǎn)品來說，由于轉(zhuǎn)基因表達出來的蛋白質(zhì)降解，導致ELISA不能夠認定該食品是否是轉(zhuǎn)基因食品。而大量的研究也都證實了這一點。【Terry, C. F., Harris, N., & Parkes, H. C. (2002). Detection of genetically modified crops and their derivatives: Critical steps in sample