高效液相色譜法課件

1、第十五章 高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography，HPLC15.1概述高效液相色譜又稱(chēng)為高壓液相色譜（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色譜（High Speed Liquid Chromatography）、高分離度液相色譜（High Resolution Liquid Chromatography）或現(xiàn)代液相色譜（Modern Liquid Chromatography），是在20世紀(jì)60年代末期在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。由于其適用范圍廣，分離速度快

2、，靈敏度高，色譜柱可以反復(fù)使用，樣品用量少，還可以收集被分離的組分，特別是計(jì)算機(jī)等新技術(shù)的引入使其自動(dòng)化與數(shù)據(jù)處理能力大大提高，高效液相色譜技術(shù)得到飛速發(fā)展。高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜法在分析原理上基本相同，但由于在技術(shù)上采用了新型高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，而使經(jīng)典的液相色譜法煥發(fā)出新的活力。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，高效液相色譜法在分析速度、分離效能、檢測(cè)靈敏度和操作自動(dòng)化等方面，都達(dá)到了很高的程度，可以和氣相色譜法相媲美，并保持了經(jīng)典液相色譜對(duì)樣品通用范圍廣、可供選擇的流動(dòng)相種類(lèi)多和便于用作制備色譜等優(yōu)點(diǎn)。至今，高效液相色譜法已在生物工程、制藥工業(yè)、食品行業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、石油化工

3、等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。15.1.1與經(jīng)典液相色譜法比較經(jīng)典液相色譜法通常使用的固定相是多孔粗粒，裝填在大口徑長(zhǎng)色譜柱（玻璃）管內(nèi)，流動(dòng)相是靠重力作用流經(jīng)色譜柱的，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)速度緩慢，柱入口壓力低，分析時(shí)間長(zhǎng)，因此柱效低，分離能力差，難以解決復(fù)雜混合物的分離分析；而高效液相色譜法使用的固定相是全多孔微粒，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相是通過(guò)高壓輸液泵進(jìn)入色譜柱的，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，柱效可比前者高23個(gè)數(shù)量級(jí)，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力，可以分離上百個(gè)組分?？傮w來(lái)看高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜法主要有以下不同（見(jiàn)表15.1）。表15.1 高效液相色譜法與經(jīng)

4、典液相色譜法的比較方法 項(xiàng)目高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長(zhǎng)/cm柱內(nèi)徑/mm可重復(fù)使用1025210只用一次102001050固定相粒徑/µm篩孔/目5502503007560020030色譜柱入口壓力/MPa2200.0010.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2×1035×104250進(jìn)樣量/g10-410-2110分析時(shí)間/h0.051.0120在線檢測(cè)能在線檢測(cè)不能在線檢測(cè)15.1.2與氣相色譜法比較氣相色譜法具有高選擇性、高分離效率、高靈敏度和分析速度快的特點(diǎn)，但它僅適用于分析蒸氣壓低、沸點(diǎn)低的樣品，而不適用于分析高沸點(diǎn)有機(jī)物、高分子和熱穩(wěn)定性差的

5、化合物以及生物活性物質(zhì)，因而使其應(yīng)用范圍大受限制。在全部有機(jī)合物中僅有20的樣品適用于氣相色譜法分析。而高效液相色譜法卻恰好彌補(bǔ)氣相色譜法的不足，適合分離分析80%的有機(jī)化合物，廣泛的用于天然產(chǎn)物、生物活性物質(zhì)、生物大分子等有機(jī)物的分離分析。此兩種方法的比較可見(jiàn)表15.2。表15.2 高效液相色譜法與氣相色譜法的比較 方法項(xiàng)目高效液相色譜法氣相色譜法進(jìn)樣方式樣品制成溶液樣品需加熱氣化或裂解流動(dòng)相（1）液體流動(dòng)相可為離子型、極性、弱極性、非極性溶液，可與被分析樣品產(chǎn)生相互作用，并能改善分離的選擇性（2）液體流動(dòng)相動(dòng)力粘度大，傳輸流動(dòng)相壓力高。（1）氣體流動(dòng)相為惰性氣體，不與被分析的樣品發(fā)生相互作

6、用（2）氣體流動(dòng)相動(dòng)力粘度小，傳輸流動(dòng)相壓力低固定相（1）分離機(jī)理：可依據(jù)吸附、分配、篩析、離子交換、親和等多種原理進(jìn)行樣品分離，可供選用的固定相種類(lèi)繁多（2）色譜柱：固定相粒度小為510µm；填充柱內(nèi)徑為36mm，柱長(zhǎng)1025cm，柱效為103104，毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.010.03mm，柱長(zhǎng)510m，柱效為104105；柱溫為常溫（1）分離機(jī)理：可依據(jù)吸附、分配兩種原理進(jìn)行樣品分離，可供選用的固定相種類(lèi)較多（2）色譜柱：固定相粒度大0.10.5mm；填充柱內(nèi)徑為14mm，柱長(zhǎng)14m，柱效為102104，毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.10.3mm，柱長(zhǎng)10100m，柱效為103104；柱溫為常溫

7、300檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器：UVD，PDAD，F(xiàn)D，ECD通用型檢測(cè)器：ELSD，RID通用型檢測(cè)器：TCD，F(xiàn)ID（有機(jī)物）選擇性檢測(cè)器：ECD*，F(xiàn)PD，NPD應(yīng)用范圍可分析低分子量低沸點(diǎn)樣品；高沸點(diǎn)、中分子、高分子有機(jī)化合物；離子型無(wú)機(jī)化合物；熱不穩(wěn)定，具有生物活性的生物分子可分析低分子量低沸點(diǎn)有機(jī)化合物；永久性氣體；配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；配合裂解技術(shù)可分析高聚物儀器組成溶質(zhì)在液相的擴(kuò)散系數(shù)很小，因此在色譜柱以外的死空間應(yīng)盡量小，以減少柱外效應(yīng)對(duì)分離效果的影響溶質(zhì)在氣相的擴(kuò)散系數(shù)大，柱外效應(yīng)影響較小，對(duì)毛細(xì)管氣相色譜應(yīng)盡量減小柱外效應(yīng)對(duì)分離效果的影響注：UVD-紫外吸收檢測(cè)器

8、，PDAD-二極管陣列檢測(cè)器，ECD-電化學(xué)檢測(cè)器，ECD*-電子捕獲檢測(cè)器，ELSD-蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器，F(xiàn)D-熒光檢測(cè)器，RID-折光指數(shù)檢測(cè)器，TCD-熱導(dǎo)檢測(cè)器，F(xiàn)ID-氫火焰離子化檢測(cè)器，F(xiàn)PD-火焰光度檢測(cè)器，NPD-氮磷檢測(cè)器15.1.3高效液相色譜法的特點(diǎn) （1）分離效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色譜填充柱的柱效可達(dá)2×1035×104塊·m-1理論塔板數(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣相色譜填充柱103塊·m-1理論塔板數(shù)的柱效。（2）選擇性高 由于液相色譜柱具有高柱效，并且流動(dòng)相可以控制和改善分離過(guò)程的選擇性。因此，高效液相色譜法不僅可以

9、分析不同類(lèi)型的有機(jī)化合物及其同分異構(gòu)體，還可分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體，并已在高療效的合成藥物和生化藥物的生產(chǎn)控制分析中發(fā)揮了重要作用。（3）檢測(cè)靈敏度高 在高效液相色譜法中使用的檢測(cè)器大多數(shù)具有較高的靈敏度。如使用廣泛的紫外吸收檢測(cè)器，最小檢出量可達(dá)10-9g；用于痕量分析的熒光檢測(cè)器，最小檢出量可達(dá)10-12g。（4）分析速度快 由于高壓輸液泵的使用，相對(duì)于經(jīng)典液相（柱）色譜，其分析時(shí)間大大縮短，當(dāng)輸液壓力增加時(shí)，流動(dòng)相流速會(huì)加快，通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。高效液相色譜法除具有以上特點(diǎn)外，它的應(yīng)用范圍也日益擴(kuò)展。由于它使用了非破壞性檢測(cè)器

10、，樣品被分析后，在大多數(shù)情況下，可除去流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)對(duì)少量珍貴樣品的回收，亦可用于樣品的純化制備。15.2高效液相色譜儀高效液相色譜儀自1967年問(wèn)世以來(lái)，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高速、高效和高靈敏度的分離測(cè)定。20世紀(jì)7080年代高效液相色譜儀獲得快速發(fā)展，并引入微處理機(jī)技術(shù)，極大地提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。高效液相色譜儀可分為分析型和制備型，雖然它們的性能各異、應(yīng)用范圍不同，但其基本組件相似。現(xiàn)在用計(jì)算機(jī)控制的高效液相色譜儀，其自動(dòng)化程度高，既能控制儀器的操作參數(shù)（如溶劑梯度洗脫、流動(dòng)相流量、校溫、自動(dòng)進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測(cè)器功能等），又

11、能對(duì)獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，以及對(duì)保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等，為色譜分析工作者提供了高效率、功能全面的分析工具。圖15.1為高效液相色譜儀的組成示意圖。圖15.1 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜工作過(guò)程為：高壓泵將貯液器中的流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器帶入色譜柱，當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流動(dòng)相將樣品一并帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器輸出的信號(hào)記錄下來(lái)，即得到色譜圖，流動(dòng)相和樣品從色譜儀出口流出被餾分收集器收集得到。以下分別介紹構(gòu)成高效液相色譜儀的主要部件：貯液器、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、餾分收集器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。15.2.1貯液器15

12、.2.1.1簡(jiǎn)介貯液器是用來(lái)存放流動(dòng)相的容器，供給符合要求的流動(dòng)相以完成分離分析工作。貯液器的材料應(yīng)耐腐蝕、對(duì)洗脫液呈化學(xué)惰性，可為玻璃、不銹鋼、聚四氟乙烯等材料制成。容積大小與柱子的粗細(xì)、泵的種類(lèi)以及所采用的液相色譜系統(tǒng)有關(guān)。一般容積約為0.52.0 L，以便在不重復(fù)加液的情況下能連續(xù)工作。對(duì)凝膠色譜儀、制備型儀器，其容積應(yīng)更大一些。貯液器的放置位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過(guò)程中貯液器應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成的變化，還可防止空氣中O2、CO2重新溶解于已脫氣的流動(dòng)相中。 高效液相色譜所用的溶劑在放入貯液器之前必須經(jīng)過(guò)0.45µm的濾膜過(guò)濾，除去溶劑中可能

13、含有的機(jī)械性雜質(zhì)，以防輸液管道或進(jìn)樣閥產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象。對(duì)輸出流動(dòng)相的連接管路，其插入貯液罐的一端，通常要連有孔徑為0.45µm的多孔不銹鋼過(guò)濾器或由玻璃制成的專(zhuān)用膜過(guò)濾器。15.2.1.2流動(dòng)相脫氣高效液相色譜所用的流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣，以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，從而影響色譜柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線的穩(wěn)定性，嚴(yán)重時(shí)無(wú)法進(jìn)行分析。此外溶解在流動(dòng)相中的氧氣，會(huì)造成熒光淬滅現(xiàn)象，影響熒光檢測(cè)器的檢測(cè)，還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或會(huì)使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有如下幾種：（1）吹氦脫氣

14、法 使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣，在0.1MPa壓力下，以約60mL·min-1的流速通入流動(dòng)相1015min以驅(qū)除溶解的氣體。此法適用于所有的溶劑、脫氣效果較好，但因氦氣價(jià)格較貴，使用具有局限性。（2）加熱回流法 此法脫氣效果較好，但操作較復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。（3）真空脫氣法 此時(shí)可使用微型真空泵，降壓至0.050.07MPa即可除去溶解的氣體。顯然使用水泵連接抽濾瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成過(guò)濾機(jī)械雜質(zhì)和脫氣的雙重任務(wù)。由于抽真空易抽走有機(jī)相會(huì)引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑體系脫氣。對(duì)于多元溶劑體系，每種溶劑應(yīng)預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合，以保證混合后的比例不變。

15、（4）超聲波脫氣法 將欲脫氣的流動(dòng)相放于超聲波清洗器中，用超聲波振蕩1015min。但此法的脫氣效果較差。（5）在線真空脫氣法（on-1ine degasser） 以上幾種方法均為離線（off-1ine）脫氣操作，隨著流動(dòng)相存放時(shí)間的延長(zhǎng)又會(huì)有空氣重新溶解到流動(dòng)相中。在線真空脫氣技術(shù)是把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，結(jié)合膜過(guò)濾器，實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。此法能智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果優(yōu)于上述幾種方法，并適用于多元溶劑體系。15.2.2高壓輸液泵15.2.2.1高壓輸液泵的特點(diǎn)高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要單元部件，用于將流動(dòng)相和樣品輸入到色譜柱和檢測(cè)器中，從

16、而使樣品得以分析，其性能的好壞直接影響整個(gè)儀器和分析結(jié)果的可靠性。高壓輸液泵應(yīng)具備以下特點(diǎn)：（1）泵體材料耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸、堿和緩沖液腐蝕的不銹鋼。（2）能在高壓下連續(xù)工作。通常要求耐壓4050MPa·cm-2，能長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)工作。（3）輸出流量范圍寬。對(duì)填充柱：0.110 mL·min-1（分析型）；1100 mL·min-1 （制備型）。對(duì)微孔柱：101000µL·min-1（分析型）；19900µL·min-1（制備型）。（4）輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高。高效液相色譜使用的檢測(cè)器，大多數(shù)對(duì)流量變化敏感，高壓輸液泵

17、應(yīng)提供無(wú)脈沖流量，這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測(cè)下限。流量控制的精密度應(yīng)小于1%，最好小于0.5%，重復(fù)性最好小于0.5%。其次還應(yīng)具有易于清洗、易于更換溶劑、具有梯度洗脫功能等。15.2.2.2高壓輸液泵的類(lèi)型高壓輸液泵按排液性能可分為恒流泵和恒壓泵，按其結(jié)構(gòu)不同又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。目前多用柱塞往復(fù)泵。（1）恒流泵 輸出恒定體積流量的流動(dòng)相，在色譜分析中，柱系統(tǒng)中阻力總是會(huì)變的，因此恒流泵比恒壓泵更具優(yōu)勢(shì)，使用更普遍。按工作方式恒流泵又可分為注射型泵和往復(fù)型泵。注射型泵 又稱(chēng)注射式螺桿泵，如圖15.2所示。圖15.2 注射型泵工作原理圖1.步進(jìn)電動(dòng)機(jī) 2.變速齒輪

18、箱 3.螺桿 4.活塞5.載液 6.至色譜柱 7.用單向閥封閉的載液入口工作原理：它利用步進(jìn)電動(dòng)機(jī)經(jīng)齒輪螺桿傳動(dòng)、帶動(dòng)活塞以緩慢恒定的速度移動(dòng)，使載液在高壓下以恒定流量輸出。當(dāng)活塞達(dá)到每個(gè)輸出沖程末端時(shí)，暫時(shí)停止輸出流動(dòng)相，然后以極快速度進(jìn)入吸入沖程，再次將流動(dòng)相由單向閥封閉的載液入口吸入泵中，再重新進(jìn)入輸出沖程的運(yùn)行，如此往復(fù)交替進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)：可在高輸液壓力下給出精確的（0.1%）無(wú)脈動(dòng)、可重現(xiàn)的流量；可通過(guò)改變電動(dòng)機(jī)的電壓，控制電動(dòng)機(jī)的轉(zhuǎn)速，來(lái)改變活塞的移動(dòng)速度，從而可調(diào)節(jié)流動(dòng)相流量，使其輸出流量與系統(tǒng)阻力無(wú)關(guān)；該泵因其流量穩(wěn)定、操作方便、可與多種高靈敏度檢測(cè)器聯(lián)接使用。缺點(diǎn)：由于泵液缸容積

19、（約100150mL）有限，每次流動(dòng)相輸完后，需重新吸入流動(dòng)相，故當(dāng)流動(dòng)相流量大時(shí)，流動(dòng)相中斷頻繁，不利于連續(xù)工作，使用兩臺(tái)泵交替工作可克服此不足之處；此泵在高壓下工作，對(duì)活塞和液缸間的密封要求很高，更換溶劑不方便，且價(jià)格昂貴。注射型泵目前在高效液相色譜儀中使用較少，而在超臨界流體色譜儀中使用較多。 往復(fù)型泵工作原理：柱塞往復(fù)式泵，類(lèi)似于具有單向閥的往復(fù)運(yùn)動(dòng)的小型注射器。通常由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)凸輪（或偏心輪）轉(zhuǎn)動(dòng)，再用凸輪驅(qū)動(dòng)活塞桿作往復(fù)運(yùn)動(dòng)，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液器中流動(dòng)相吸入缸體。前后往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中。通過(guò)單向閥的開(kāi)啟和關(guān)閉，定期將貯存在液

20、缸里的液體以高壓連續(xù)輸出。當(dāng)改變電動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)速時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)活塞沖程的頻率，就可調(diào)節(jié)輸出液體的流量，如圖15.3所示。此泵每往復(fù)一次輸出的流量由柱塞的截面積和沖程決定，單位時(shí)間輸出的流量由柱塞的往復(fù)次數(shù)決定。隔膜式往復(fù)泵的工作原理與柱塞式往復(fù)泵相似，只是流動(dòng)相接觸的不是活塞，而是具有彈性的不銹鋼或聚四氟乙烯隔膜。此隔膜經(jīng)液壓驅(qū)動(dòng)脈沖式地排出或吸入流動(dòng)相，隔膜式往復(fù)泵的優(yōu)點(diǎn)是可避免流動(dòng)相被污染。目前已研制出雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵，它由馬達(dá)從相反方向推動(dòng)兩個(gè)球形螺旋傳動(dòng)，由于球形螺旋傳動(dòng)的齒輪有不同的圓周（2：1），使第一個(gè)活塞的運(yùn)動(dòng)速度是第二個(gè)活塞的兩倍，如圖15.4所示。它啟動(dòng)時(shí)，通過(guò)運(yùn)行一個(gè)初始程序來(lái)

21、決定兩個(gè)柱塞向上移動(dòng)能到達(dá)的最高位置，然后再向下移動(dòng)至一個(gè)預(yù)定高度，控制器將兩個(gè)活塞位置貯存在記憶中，完成初始化設(shè)定，泵I和泵就按設(shè)定參數(shù)操作。當(dāng)驅(qū)動(dòng)馬達(dá)正向運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，泵I流動(dòng)相入口主動(dòng)單向閥打開(kāi)時(shí)，柱塞I向下移動(dòng)，將流動(dòng)相吸入泵I內(nèi)，與此同時(shí)，泵柱塞向上移動(dòng)，將流動(dòng)相送入色譜系統(tǒng)。在完成由控制器設(shè)定的第一種柱塞運(yùn)行沖程長(zhǎng)度后，驅(qū)動(dòng)馬達(dá)停止，泵I入口主動(dòng)單向閥門(mén)關(guān)閉，然后驅(qū)動(dòng)馬達(dá)反向運(yùn)轉(zhuǎn)，泵I流動(dòng)相出口被動(dòng)單向閥打開(kāi)，此時(shí)柱塞I向上移動(dòng)，泵柱塞向下移動(dòng)，使泵I中流動(dòng)相轉(zhuǎn)移至泵，就完成控制器設(shè)定的第二種柱塞運(yùn)行程序。重復(fù)進(jìn)行上述過(guò)程，就使泵I吸入的流動(dòng)相連續(xù)不斷地進(jìn)入泵，而泵每次僅排出壓入流動(dòng)相的

22、一半，而實(shí)現(xiàn)以恒定流量連續(xù)向色譜系統(tǒng)輸液。雙桿塞往復(fù)式串聯(lián)泵的主要特點(diǎn)是僅在泵I配有一單向閥，全部操作是用計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制的。 圖15.3 柱塞式往復(fù)型泵工作原理圖 圖15.4 雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵1.偏心輪 2.柱塞 3.密封墊 1.貯液罐 2.泵（柱塞） 3.單向閥4.流動(dòng)相進(jìn)口 5.單向閥 6.流動(dòng)相出口 4.阻尼器 5.泵（柱塞） 6.至色譜柱優(yōu)點(diǎn)：可在高壓下連續(xù)以恒定的流量輸液；泵的液缸容積很小，其柱塞尺寸小易于密封；容易清洗及更換流動(dòng)相、特別適用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：輸出流動(dòng)相雖然是連續(xù)的恒流量的，但存在脈沖波動(dòng)，若與對(duì)流量敏感的折光指數(shù)檢測(cè)器連接，就產(chǎn)生基線波動(dòng)，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析工

23、作；柱塞式往復(fù)泵，柱塞直接與流動(dòng)相接觸造成污染（使用隔膜式往復(fù)泵可克服此缺點(diǎn)）；長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)后，因流動(dòng)相含有的機(jī)械雜質(zhì)會(huì)造成單向閥的阻塞，或因單向閥的閥球磨損而不能關(guān)閉單向閥。這些都會(huì)造成往復(fù)泵不能正常工作。柱塞式往復(fù)泵在高效液相色譜儀中獲得最廣泛的應(yīng)用，也是最重要的高壓輸液泵。（2）恒壓泵 恒壓泵又稱(chēng)氣動(dòng)放大泵，是輸出恒定壓力的泵。工作原理：當(dāng)系統(tǒng)阻力不變時(shí)可保持恒定流量，當(dāng)系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時(shí)，輸入壓力雖然不變，但流量卻隨阻力而變。其氣動(dòng)放大泵的工作原理如圖15.5所示。恒壓泵是利用氣體的壓力去驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力，通常采用壓縮空氣作為動(dòng)力去驅(qū)動(dòng)氣缸中橫截面積大的活塞5，再經(jīng)過(guò)一個(gè)連桿去驅(qū)動(dòng)液

24、缸中橫截面積小的活塞6。由于兩個(gè)活塞面積有一定的比例（約50：1），則氣缸壓力p2傳于液缸壓力p1時(shí)，其壓力也增加相應(yīng)的倍數(shù)，而獲得輸出液的高壓p1：， （15.1）式中：A1活塞面積；A2大活塞面積。當(dāng)=50時(shí)，。此高壓可將液缸中的液體排出。單液缸氣動(dòng)放大泵，每個(gè)輸液沖程結(jié)束，氣缸和液缸活塞即快速反向運(yùn)行而重新吸液，結(jié)果幾乎不中斷流動(dòng)相輸出，但基線會(huì)有暫時(shí)的波動(dòng)。若其具有雙液缸，則可通過(guò)兩個(gè)電磁閥定時(shí)切換氣體壓力，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)液缸輸液的同時(shí)，另一個(gè)液缸正在吸液，從而使流動(dòng)相連續(xù)輸出且不引起基線波動(dòng)。使用氣動(dòng)放大泵時(shí)，輸出流動(dòng)相的流量不僅由泵的輸出壓力決定，還取決于流動(dòng)相的粘度及色譜柱的壓力降，

25、因此在分析過(guò)程不能獲得穩(wěn)定的流量。圖15.5 氣動(dòng)放大泵1.空氣 2.連桿 3.輸液 4.吸液 5.大活塞 6.小活塞優(yōu)點(diǎn)：能以比較簡(jiǎn)單的方式建立高壓并輸出無(wú)脈動(dòng)的、穩(wěn)定的流動(dòng)相液流；可與折光指數(shù)檢測(cè)器配合使用；可利用改變氣源壓力的方法來(lái)調(diào)節(jié)載液流速。缺點(diǎn)：液缸體積大（約70mL），更換流動(dòng)相不方便，如不使用兩臺(tái)泵無(wú)法實(shí)現(xiàn)梯度洗脫。不能輸出恒定流量的流動(dòng)相，不易測(cè)出重復(fù)的保留時(shí)間，不能獲得可靠的定性結(jié)果。在高效液相色譜儀發(fā)展初期，恒壓泵使用較多，隨往復(fù)式恒流泵的廣泛使用，恒壓泵現(xiàn)已基本不再使用。但在填充高效液相色譜柱時(shí)，使用的勻漿裝柱機(jī)都配備氣動(dòng)放大泵，以快速建立所需的高壓輸出。15.2.2.

26、3輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備為了給色譜柱提供穩(wěn)定、無(wú)脈動(dòng)、流量準(zhǔn)確的流動(dòng)相，除具備高壓輸液泵外、還需配備管道過(guò)濾器和脈動(dòng)阻尼器等輔助設(shè)備。（1）管道過(guò)濾器 在高壓輸液泵的進(jìn)口和它的出口與進(jìn)樣閥之間，應(yīng)設(shè)置過(guò)濾器。高壓輸液泵的柱塞和進(jìn)樣閥閥芯的機(jī)械加工精密度非常高，微小的機(jī)械雜質(zhì)進(jìn)入流動(dòng)相，會(huì)導(dǎo)致上述部件的損壞，同時(shí)機(jī)械雜質(zhì)在接頭的積累，會(huì)造成柱壓升高，使色譜柱不能正常工作，因此管道過(guò)濾器的安裝是十分必要的。過(guò)濾器的濾芯是用不銹鋼燒結(jié)材料制造的，孔徑約23µm，耐有機(jī)溶劑的侵蝕。若發(fā)現(xiàn)過(guò)濾器堵塞（發(fā)生流量減小的現(xiàn)象），可將其浸入稀HNO3溶液中，在超聲波清洗器中用超聲波振蕩1015min，即可

27、將堵塞的固體雜質(zhì)洗出，若清洗后仍不能達(dá)到要求，則應(yīng)更換濾芯。（2）脈動(dòng)阻尼器 往復(fù)式柱塞泵輸出的壓力脈動(dòng)，會(huì)引起記錄儀基線的波動(dòng)，這種脈動(dòng)可以通過(guò)在高壓輸液泵出口與色譜柱入口之間安裝一個(gè)脈動(dòng)阻尼器（或稱(chēng)緩沖器）來(lái)加以消除。圖15.6為幾種脈動(dòng)阻尼器示意圖。其中圖15.6（a）為最簡(jiǎn)單、最常用的脈動(dòng)阻尼器，它由一根外徑約1.11.5mm、內(nèi)徑0.25mm，長(zhǎng)約5m的螺旋狀不銹鋼毛細(xì)管組成，利用它的撓性來(lái)阻滯壓力和流量的波動(dòng)。起到緩沖作用，毛細(xì)管內(nèi)徑越細(xì)，其阻滯作用越大。這種阻尼器制作簡(jiǎn)單，但會(huì)引起系統(tǒng)中一定的壓力損失。如將它改裝成圖15.6（b）所示的三通式，即可避免壓力損失，且阻尼效果更好。圖

28、15.6（a）和（d）分別是可調(diào)彈簧式和波紋管式脈動(dòng)阻尼器，它們的阻尼效果好，但其體積大，更換溶劑很不方便不適于梯度洗脫。圖15.6（e）為一種新式脈沖阻尼器，它的內(nèi)管壁用彈性材料制成，內(nèi)、外管之間裝有已脫氣可壓縮的液體，內(nèi)管的彈性和裝填液體的可壓縮性，都可吸收輸液系統(tǒng)中的壓力波動(dòng)。這種阻尼器死體積小，適用于梯度洗脫。在輸液系統(tǒng)中還應(yīng)配備由壓力傳感器組成的壓力測(cè)量、顯示裝置及流動(dòng)相流量的測(cè)量裝置。圖15.6 脈動(dòng)阻尼器15.2.2.4梯度洗脫裝置高效液相色譜洗脫技術(shù)有等強(qiáng)度（isocratic）和梯度（gradient）洗脫兩種。等強(qiáng)度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定不變，適合于組分?jǐn)?shù)

29、目較少、性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)由程序來(lái)控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等。在分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜樣品時(shí)須采用梯度洗脫技術(shù)、使所有組分都在適宜條件下獲得分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間、提高分離度、提高柱效、改善峰形、提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫的方法是使流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過(guò)程連續(xù)或間斷改變流動(dòng)相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分在最短的分析時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離效果。當(dāng)樣品中第一個(gè)組分的k值和最后一個(gè)峰的k值相差幾十倍至上百倍時(shí)，使用梯度洗

30、脫的效果就特別好。此技術(shù)相似于氣相色譜中使用的程序升溫技術(shù)，現(xiàn)已在高效液相色譜法中獲得廣泛的應(yīng)用，有兩種實(shí)現(xiàn)梯度洗脫的裝置，即高壓梯度裝置和低壓梯度裝置。（1）低壓梯度（外梯度） 在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）通過(guò)梯度比例閥按程序混合，然后再用高壓輸液泵送入到色譜柱中，其裝置圖15.7所示，此法的主要優(yōu)點(diǎn)是僅需使用一個(gè)高壓輸液泵。如對(duì)二元混合溶劑體系，操作時(shí)先將弱極性溶劑A，通過(guò)由微處理機(jī)控制的低壓計(jì)量泵和時(shí)間比例電磁閥（6）直接流入混合器；強(qiáng)極性溶劑B，也通過(guò)低壓計(jì)量泵，并由微處理機(jī)控制另一時(shí)間比例電磁閥（7）的開(kāi)關(guān)時(shí)間，來(lái)調(diào)節(jié)流入混合器的B溶劑的體積百分?jǐn)?shù)、以控制輸出混合溶劑的組成。溶劑

31、A和B在混合器內(nèi)充分混合后，再用高壓輸液泵輸至色譜柱。通過(guò)預(yù)先設(shè)定溶劑A、B時(shí)間比例電磁閥的開(kāi)啟時(shí)間，就可控制二元混合溶劑流動(dòng)相的組成，并連續(xù)輸出具有不同極性的流動(dòng)相。此種梯度洗脫方式可以減小溶劑可壓縮性的影響，并能完全消除由于溶劑混合引起的熱力學(xué)體積變化所帶來(lái)的誤差。（2）高壓梯度（內(nèi)梯度） 目前，大多數(shù)高效液相色譜儀均配有高壓梯度裝置，它是用兩臺(tái)高壓輸液泵分別將兩種溶劑A、B輸入混合室，進(jìn)行混合后再送入色譜柱。兩種溶劑進(jìn)入混合室的比例可由溶劑程序控制器或計(jì)算機(jī)來(lái)調(diào)節(jié)。此類(lèi)裝置如圖15.8所示，它的主要優(yōu)點(diǎn)是兩臺(tái)高壓輸液泵的流量可獨(dú)立控制，可獲得任何形式的梯度程序，且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。由于高壓

32、梯度裝置中，每種溶劑是分別由泵輸送的，進(jìn)入混合器后，溶劑的可壓縮性和溶劑混合時(shí)熱力學(xué)體積的變化，可能影響輸入到色譜柱中的流動(dòng)相的組成。在梯度洗脫中為保證流速穩(wěn)定必須使用恒流泵，否則很難獲得重復(fù)性結(jié)果。 圖15.7 低壓梯度裝置圖 圖15.8 高壓梯度裝置圖1.低壓計(jì)量泵 2.微處理機(jī) 3.混合器 1.程序控制器 2.溶劑A 3.溶劑B 4.高壓泵A 5.高壓泵B4.高壓輸液泵 5.至色譜柱 6、7.時(shí)間比例電磁閥 6.反饋控制器 7.混合室 8.流量計(jì)信號(hào) 9.混合溶劑出口（3）梯度洗脫曲線 梯度洗脫時(shí)常用一個(gè)弱極性溶劑A和一個(gè)強(qiáng)極性溶劑B組合。以梯度洗脫時(shí)間作橫坐標(biāo)，以流動(dòng)相中強(qiáng)極性組分B的

33、體積百分含量作縱坐標(biāo)，可繪出梯度曲線。若在單位時(shí)間內(nèi)，強(qiáng)極性溶劑B在流動(dòng)相中的體積百分含量以恒定的速率增加，則流動(dòng)相的極性呈“線性梯度輸出”，若不以恒定速度增加，流動(dòng)相呈現(xiàn)凸形或凹形輸出，如圖15.9所示。當(dāng)梯度洗脫方式確定后。對(duì)應(yīng)于不同梯度洗脫形狀，獲得的色譜分離圖如圖15.10所示。若呈線性梯度洗脫，如圖15.10（b），譜圖中每個(gè)譜帶寬度相等，且各個(gè)譜帶間具有相同的分離度。若呈“指數(shù)形式”的凸形洗脫，如圖15.10（a），在分離開(kāi)始時(shí)，B的體積百分含量迅速增加，使各組分譜帶以較低的平均容量因子k值洗脫，并且最終譜帶的k值也較低，使開(kāi)始被洗脫的色譜峰形尖銳，且分離度減小；而在分離的后期，B

34、的體積百分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)減慢，使后被洗脫的色譜峰譜帶加寬，分離度增大。若呈“指數(shù)形式”的凹形洗脫，則如圖15.10（c）所看到的譜圖變化與圖15.10（a）恰好相反。即開(kāi)始被洗脫的色譜峰譜帶較寬，分離度較好，而后洗脫的色譜峰譜帶較尖銳，分離度減小。 圖15.9 梯度洗脫形狀 圖15.10 梯度洗脫的形狀及對(duì)分離的影響（4）影響梯度洗脫的因素 進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，選定溶劑A、B之后，設(shè)定梯度速度和梯度時(shí)間，確定梯度曲線形狀，要以最經(jīng)濟(jì)的梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：溶劑的純度要高，否則會(huì)使梯度洗脫的重現(xiàn)性變壞；梯度混合的溶劑互溶性要好，應(yīng)防止不互溶的溶劑進(jìn)入色譜柱、應(yīng)當(dāng)注意溶劑的

35、粘度和相對(duì)密度對(duì)混合流動(dòng)相組成的影響；梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如折光指數(shù)檢測(cè)器）。15.2.3進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置是將分析樣品引入色譜柱的裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)色譜柱壓力、流量波動(dòng)小，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。高效液相色譜中的進(jìn)樣方式可分為隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣等。15.2.3.1隔膜進(jìn)樣用微量注射器針頭穿過(guò)橡皮隔膜進(jìn)樣，這是最簡(jiǎn)便的一種進(jìn)樣方式。而且由于可以把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，所以往往可獲得最好的柱效。但是由于這種進(jìn)樣方式不能在高壓

36、下使用（如10MPa以上），重復(fù)性較差（包括柱效和定量結(jié)果），加之能耐各種溶劑的橡皮材料不易找到，因而常規(guī)分析使用受到局限。15.2.3.2閥進(jìn)樣這是目前高效液相色譜普遍采用的一種進(jìn)樣方式。雖然由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率稍低于注射器隔膜進(jìn)樣，但因耐高壓，重復(fù)性良好，操作方便，因而深受色譜工作者的歡迎。其中，圖15.11所示的六通進(jìn)樣閥最為常用。此閥的閥體用不銹鋼材料，旋轉(zhuǎn)密封部分由堅(jiān)硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能又好。當(dāng)進(jìn)樣閥手柄置取樣位置（a），用特制的平頭注射器吸取比定量管體積（5µL或10µL）稍多的樣品從注入口處進(jìn)入定量管，多余的樣品從出口排出。

37、再將進(jìn)樣閥手柄置進(jìn)樣位置（b），流動(dòng)相將樣品攜帶進(jìn)入色譜柱。此種進(jìn)樣直觀性好，能耐20MPa的高壓。 圖15.11 六通閥進(jìn)樣示意圖（a）取樣位置 （b）進(jìn)樣位置15.2.3.3自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器是由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制定量閥，按預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上，然后取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、樣品管路清洗等全部按預(yù)定程序自動(dòng)運(yùn)行，一次可進(jìn)行幾十個(gè)或上百個(gè)樣品的分析。自動(dòng)進(jìn)樣的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)、進(jìn)樣重復(fù)性高，適合作大量樣品分析，節(jié)省人力，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。15.2.4色譜柱色譜柱被稱(chēng)為高效液相色譜儀的“心臟”，因?yàn)樯V的核心問(wèn)題分離是在色譜柱中完成的，色譜柱的

38、設(shè)計(jì)（包括柱型、結(jié)構(gòu)、填料和裝填方法）或稱(chēng)柱技術(shù)（Column technology）對(duì)現(xiàn)代液相色譜的發(fā)展起著關(guān)鍵性作用。為了適應(yīng)不同的分離分析要求，色譜柱有不同的柱型，不同的柱材料及規(guī)格。15.2.4.1柱材料常用內(nèi)壁經(jīng)過(guò)精密加工拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。不銹鋼管耐溶劑、水和緩沖溶液的腐蝕，使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3對(duì)柱內(nèi)壁作鈍化處理。鈍化時(shí)使HNO3在柱管內(nèi)至少滯留10min，以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。此外也有使用氟塑料、玻璃和玻璃襯里材料作色譜柱的，主要從抗腐蝕和易加工兩方面來(lái)考慮。15.2.4.2柱結(jié)構(gòu)一套完整的色譜柱，除柱管外，還應(yīng)

39、有柱頭及配套的連接管。一般色譜柱是由柱管，末端接頭，卡套（又稱(chēng)密封環(huán)）和過(guò)濾篩板等組成的。圖15.12是目前較為流行的典型分析型高效液相色譜柱的結(jié)構(gòu)。圖15.12 高效液相色譜柱結(jié)構(gòu)示意圖15.2.4.3柱規(guī)格般采用直形柱管，標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長(zhǎng)1050cm，填料粒度510µm時(shí)，柱效達(dá)500010000塊·m-1理論塔板數(shù)。使用35µm填料，柱長(zhǎng)可減至510cm。當(dāng)使用內(nèi)徑在0.51.0 mm的微孔填充柱或內(nèi)徑為3050µm的毛細(xì)管柱時(shí)，柱長(zhǎng)為1550cm。當(dāng)使用粗內(nèi)徑短柱或細(xì)內(nèi)徑長(zhǎng)柱時(shí)，應(yīng)注意由于柱內(nèi)體積減小，由柱外效應(yīng)（是

40、指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的成因，主要由進(jìn)樣裝置、檢測(cè)池及它們與柱之間的連接管路所產(chǎn)生）引起的峰形擴(kuò)展。此時(shí)應(yīng)對(duì)進(jìn)樣器、檢測(cè)器和連接接頭作特殊設(shè)計(jì)以減少柱外死體積。15.2.4.4柱連接方式柱接頭通過(guò)過(guò)濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的上下兩端要安裝過(guò)濾片，過(guò)濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料制成，此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑，可阻擋流動(dòng)相中的極小的機(jī)械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱，但流動(dòng)相可順利通過(guò)。柱入口、出口的連接管的死體積愈小愈好，一般常用窄孔（內(nèi)徑0.13mm）的厚壁（1.52.0mm）不銹鋼管，以減少柱外死體積。15.2.4.5柱溫控制高效液相色譜在以下幾種情況須精確控制柱溫：在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析

41、方法中，要求保留時(shí)間具有再現(xiàn)性；必須通過(guò)改變柱溫來(lái)提高分離效率；對(duì)高分子化合物或粘度大的樣品，分析時(shí)柱溫必須高于室溫；對(duì)一些具有生物活性的生物分子，要求分析時(shí)柱溫應(yīng)低于室溫，防止活性成分失活；對(duì)某些組成復(fù)雜的樣品，在單一色譜柱不能實(shí)現(xiàn)完全分離，需要使用二維色譜技術(shù)；利用柱切換，使兩根色譜柱在不同柱溫下操作，以實(shí)現(xiàn)多組分的完全分離。一個(gè)理想的HPLC柱溫控制系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)從低于室溫10 至80 柱溫的精確控制。對(duì)凝膠滲透色譜儀，其柱溫可從室溫至150實(shí)現(xiàn)精確控溫。15.2.5檢測(cè)器檢測(cè)器是高效液相色譜儀中的三大關(guān)鍵部件（高壓輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器）之一，主要用于監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，

42、被稱(chēng)為色譜儀的“眼睛”，檢測(cè)器的性能直接關(guān)系著定性定量分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。一個(gè)理想的液相色譜檢測(cè)器應(yīng)具備以下特征：靈敏度高、對(duì)所有的溶質(zhì)都有快速響應(yīng)、響應(yīng)對(duì)流動(dòng)相流量和溫度變化都不敏感、不引起柱外譜帶擴(kuò)展、線性范圍寬、適用的范圍廣等，但沒(méi)有一種檢測(cè)器能完全具備這些特征。在高效液相色譜技術(shù)發(fā)展中，檢測(cè)器至今仍是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，它沒(méi)有相當(dāng)于氣相色譜中使用的熱導(dǎo)檢測(cè)器和氫火焰離子化檢測(cè)器那樣既通用又靈敏的檢測(cè)器。但近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）有望成為高效液相色譜全新的、通用靈敏的質(zhì)量檢測(cè)器。目前常用的檢測(cè)器有紫外吸收檢測(cè)器（UVD）、折光指數(shù)檢測(cè)器（RID）、和熒光檢測(cè)器（FD）。1

43、5.2.5.1檢測(cè)器的分類(lèi)和響應(yīng)特征高效液相色譜儀的檢測(cè)器很多，分類(lèi)方法也很多。（1）按照用途分類(lèi)，可分為通用型和選擇性兩類(lèi)。屬于通用型的有示差折光（有時(shí)也稱(chēng)為折射指數(shù)，RI）、火焰離子化、電容等。它對(duì)大多數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)相差不大幾乎適用于所有物質(zhì)。但它的靈敏度低，受溫度影響波動(dòng)大，使用時(shí)有一定局限性。屬于選擇性檢測(cè)器的有紫外吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、安培、光導(dǎo)、極譜等。它們對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)有特異性，而對(duì)流動(dòng)相則沒(méi)有響應(yīng)或響應(yīng)很小，因此靈敏度很高，受操作條件變化和外界環(huán)境影響很小，可用作梯度淋洗。（2）按測(cè)量性質(zhì)分類(lèi)，可分為濃度型和質(zhì)量型。前者與溶質(zhì)在溶液中的濃度有關(guān)，是總體性質(zhì)的檢測(cè)器。紫外吸收、

44、示差折光、熒光等屬于此類(lèi)。后者與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)，氫火焰、庫(kù)侖、同位素及質(zhì)譜中的總離子流等屬于質(zhì)量型。按測(cè)量原理又可分為光學(xué)檢測(cè)器和電學(xué)檢測(cè)器，此外還有利用熱學(xué)原理檢測(cè)的吸附熱檢測(cè)器。UVD、RID、FD三種檢測(cè)器皆屬于非破壞性檢測(cè)器，樣品流出檢測(cè)器后可進(jìn)行餾分收集，并可與其它檢測(cè)器串聯(lián)使用。對(duì)熒光檢測(cè)器因測(cè)定中加入熒光試劑會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生污染，當(dāng)串聯(lián)性用時(shí)應(yīng)將它放在最后檢測(cè)。15.2.5.2紫外吸收檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器（u1traviolet absorption detector，UVD）是高效液相色譜儀中使用最廣泛的一種檢測(cè)器，幾乎所有的高效液相色譜儀都配有紫外吸收檢測(cè)器。它的靈敏度較高，線

45、性范圍寬，對(duì)流速和溫度的變化不敏感，適用梯度洗脫，屬于溶質(zhì)性質(zhì)的檢測(cè)器，只能用于檢測(cè)能吸收紫外光的物質(zhì)，溶劑要選用無(wú)紫外吸收特性的物質(zhì)。（1）工作原理 紫外檢測(cè)器是吸收光譜分析類(lèi)型的儀器，無(wú)論是何種設(shè)計(jì)方法，其工作原理都是基于朗伯-比耳定律。對(duì)于給定的檢測(cè)池，在固定的波長(zhǎng)下（為定值），紫外檢測(cè)器應(yīng)輸出一個(gè)與樣品濃度（c）成正比的光吸收信號(hào)吸光度（A）。而檢測(cè)器光電元件的輸出信號(hào)與透過(guò)率成正比，所以為了定量計(jì)算方便，在儀器采用對(duì)數(shù)放大器，將透過(guò)率轉(zhuǎn)換成吸光度，使儀器輸出信號(hào)與樣品濃度成直線關(guān)系。因此紫外檢測(cè)器屬于濃度敏感型檢測(cè)器。（2）儀器結(jié)構(gòu) 紫外檢測(cè)器的基本結(jié)構(gòu)與一般紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是相同

46、的，均包括光源、分光系統(tǒng)、樣品池和檢測(cè)系統(tǒng)四大部分。隨高效液相色譜法的發(fā)展，紫外檢測(cè)器也發(fā)展為多種類(lèi)型，用于滿足不同分析任務(wù)及各種紫外吸收物質(zhì)檢測(cè)的需求。紫外檢測(cè)器按波長(zhǎng)來(lái)分，有固定波長(zhǎng)和可變波長(zhǎng)兩類(lèi)。固定波長(zhǎng)檢測(cè)器又有單波長(zhǎng)式和多波長(zhǎng)式兩種；可變波長(zhǎng)檢測(cè)器可以按照對(duì)可見(jiàn)光的檢測(cè)與否分為紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器和紫外分光檢測(cè)器，按波長(zhǎng)掃描的不同又有不自動(dòng)掃描、自動(dòng)掃描和多波長(zhǎng)快速掃描等。其中屬于多波長(zhǎng)快速掃描的光電二極管陣列檢測(cè)器具有很多優(yōu)點(diǎn)，是高效液相色譜最有發(fā)展前途的檢測(cè)器。 固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器（fixed wavelength UV detctor）顧名思義，是指光源發(fā)射不連續(xù)可調(diào)，只選

47、擇固定的單一光源波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。這種檢測(cè)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，應(yīng)用范圍較寬，購(gòu)買(mǎi)的液相色譜儀均配套有該檢測(cè)器。由低壓汞燈提供固定波長(zhǎng)254nm（或280nm）的紫外光，其結(jié)構(gòu)如圖15.15所示。由低壓汞燈發(fā)出的紫外光經(jīng)入射石英棱鏡準(zhǔn)直、再經(jīng)遮光板分為一對(duì)平行光束分別進(jìn)入流通池的測(cè)量臂和參比臂。經(jīng)流通池吸收后的出射光，經(jīng)過(guò)遮光板、出射石英棱鏡及紫外濾光片，只讓254nm的紫外光被雙光電池接收。雙光電池檢測(cè)的光強(qiáng)度經(jīng)對(duì)數(shù)放大器轉(zhuǎn)化成吸光度后，經(jīng)放大器輸送至記錄儀。圖15.15 紫外光度檢測(cè)器光路圖為減少死體積，流通池的體積很小，僅為5l0µL，光路約510mm，結(jié)構(gòu)常采用H形。此檢測(cè)器

48、結(jié)構(gòu)緊湊、造價(jià)低、操作維修方便、靈敏度高，適于梯度洗脫。 可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器 是一種應(yīng)用非常廣泛的檢測(cè)器，雖然固定波長(zhǎng)檢測(cè)器可以提供多種光源波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，但可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的波長(zhǎng)選擇是任意可調(diào)的，因此與固定波長(zhǎng)檢測(cè)器相比，有以下優(yōu)點(diǎn)：可以選擇樣品的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，提高檢測(cè)靈敏度；可以選擇樣品有強(qiáng)吸收而干擾無(wú)吸收的波長(zhǎng)進(jìn)行分析，提高分析的選擇性；可以選擇在梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相改變，而其吸光度不變的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，有利于梯度洗脫?？勺儾ㄩL(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器，由于可選擇的波長(zhǎng)范圍很大，既提高了檢測(cè)器的選擇性，又可選用組分的最靈敏吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。它還有停流掃描功能，可繪

49、出組分的光吸收譜圖，以進(jìn)行吸收波長(zhǎng)的選擇。 光電二極管陣列檢測(cè)器 圖15.16 可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器光學(xué)系統(tǒng)圖1.氘燈 2.透鏡 3.濾光片 4.狹縫 5.反射鏡 6.光柵7.分束器 8.參比光電二極管 9.流通池 10.樣品光電二極管光電二極管陣列檢測(cè)器，又稱(chēng)光電二極管列陣檢測(cè)器或光電二極管矩陣檢測(cè)器，表示為PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode array detector）或DAD（diode array detector）。此外，還有的商家稱(chēng)之為多通道快速紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（multichannel rapid scanning UV-VIS

50、detector），三維檢測(cè)器（three dimensional detector）等。光電二極管陣列檢測(cè)器目前已在高效液相色譜分析中大量使用，一般認(rèn)為是液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測(cè)器（見(jiàn)圖15.17）。圖15.17 二極管陣列檢測(cè)器光路示意圖光學(xué)多通道檢測(cè)技術(shù)不僅僅可以采用光電二極管陣列作為光電檢測(cè)元件。硅光導(dǎo)攝像管是首先被應(yīng)用到液相色譜陣列檢測(cè)器的光電檢測(cè)元件，但由于紫外響應(yīng)弱，成本比光電二極管陣列高，響應(yīng)慢等缺點(diǎn)而較少應(yīng)用。電荷耦合陣列檢測(cè)器（charge-coupied device array detector，CCD檢測(cè)器）具有很多優(yōu)異的性能，如光譜范圍寬、量子效率高、暗電流小、

51、噪聲低、線性范圍寬等。但CCD檢測(cè)器的紫外響應(yīng)弱，信號(hào)收率低，有礙它的進(jìn)一步發(fā)展。其它的光電檢測(cè)元件同樣具有以上這些缺點(diǎn)，因此光電二極管成為目前最主要、最常用的光學(xué)多通道檢測(cè)技術(shù)的光電檢測(cè)元件。15.2.5.3折光指數(shù)檢測(cè)器折光指數(shù)檢測(cè)器（refractive index detector，RID）又稱(chēng)示差折光檢測(cè)器（DRD），是1942年由Tiselius和Claesson首次提出的，是最早的在線液相色譜檢測(cè)器之一和最早的液相色譜商品檢測(cè)器。它是通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來(lái)測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。由于每種物質(zhì)都具有與其他物質(zhì)不相同的折射率，因而RID是一種通用型檢測(cè)器。 溶液

52、的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分?jǐn)?shù)的乘積之和。當(dāng)樣品濃度低時(shí)，由樣品在流動(dòng)相中流經(jīng)測(cè)量池時(shí)的折射率與純流動(dòng)相流經(jīng)參比池時(shí)的折射率之差，指示出樣品在流動(dòng)相中的濃度。此類(lèi)檢測(cè)器一般不能于梯度洗脫，因?yàn)樗鼘?duì)流動(dòng)相組成的任何變化都有明顯的響應(yīng)，會(huì)干擾被測(cè)樣品的監(jiān)測(cè)。示差折光檢測(cè)器一般可按檢測(cè)原理可分為反射式和偏轉(zhuǎn)式兩類(lèi)。它們的共同特點(diǎn)是檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)反映了樣品流通池和參比池之間的折射率之差。圖15.18是偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測(cè)器的光路圖。圖15.18 偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測(cè)器的光路圖15.2.5.4熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)D）是利用某些溶

53、質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見(jiàn)光（熒光）的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。它是一種具有高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)器，對(duì)不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可使其與熒光試劑反應(yīng)，制成可發(fā)生熒光的衍生物再進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)化合物發(fā)生熒光的條件和對(duì)化合物熒光強(qiáng)度檢測(cè)的要求，熒光檢測(cè)器包括以下基本部件：激發(fā)光源；選擇激發(fā)波長(zhǎng)用的單色器；流通池；選擇發(fā)射波長(zhǎng)用的單色器及用于檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的光電檢測(cè)器。由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)光單色器后，得到所需要的激發(fā)光波長(zhǎng)。激發(fā)光通過(guò)樣品流通池，一部分光線被熒光物質(zhì)吸收，熒光物質(zhì)激發(fā)后，向四面八方發(fā)射熒光。為了消除入射光與散射光的影響，一般取與激發(fā)光成直角的方向測(cè)量熒光（直角光路）。熒光至發(fā)射光單色器分光后，

54、單一波長(zhǎng)的發(fā)射光由光電檢測(cè)器接收。熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外吸收檢測(cè)器高100倍，可用于梯度洗脫，當(dāng)要對(duì)痕量組分進(jìn)行選擇性檢測(cè)時(shí)，它是一種有力的檢測(cè)工具。但它的線性范圍較窄，不宜作為一般的檢測(cè)器來(lái)使用。測(cè)定中不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動(dòng)相。對(duì)不能直接產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，要使用色譜柱后衍生技術(shù)，操作比較復(fù)雜。此檢測(cè)器現(xiàn)已在生物化工、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)中獲得廣泛的應(yīng)用。15.2.5.6蒸發(fā)光散射檢測(cè)器在高效液相色譜分析中，人們一直希望能有一臺(tái)像FID那樣的通用型質(zhì)量檢測(cè)器，它能對(duì)各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，它的檢測(cè)不依賴(lài)于樣品分子中的官能團(tuán)，且可用于梯度洗脫。目前最

55、能接近滿足這些要求的就是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light scattering Detector，ELSD）。圖15.19為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器工作原理示意圖。色譜柱后流出物在通向檢測(cè)器途中，被高速載氣（N2）噴成霧狀液滴。在受溫度控制的蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，溶質(zhì)形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)由一個(gè)激光光源和一個(gè)光電倍增管構(gòu)成。在散射室中，光被散射的程度取決于散射室中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量。粒子的數(shù)量取決于流動(dòng)相的性質(zhì)及噴霧氣體和流動(dòng)相的流速。當(dāng)流動(dòng)相和噴霧氣體的流速恒定時(shí)，散射光的強(qiáng)度僅取決于溶質(zhì)的濃度。此檢測(cè)器可用于梯度洗脫，且響應(yīng)值僅與光束中

56、溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)的化學(xué)組成無(wú)關(guān)。圖15.19 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器示意圖蒸發(fā)光散射檢測(cè)器與RID和UVD相比，它消除了溶劑的干擾和因溫度變化引起的基線漂移，即使用梯度洗脫也不會(huì)產(chǎn)生基線漂移。它還具有噴霧器、漂移管易于清洗、死體積小、靈敏度高、噴霧氣體消耗少等優(yōu)點(diǎn)。此種檢測(cè)器在今后將會(huì)逐漸獲得廣泛應(yīng)用。15.2.6餾分收集器如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其他波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集，手工操作只適合于少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。餾分收集器比較理想，因?yàn)楸阌谟梦⑻幚頇C(jī)控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時(shí)間，或按色譜

57、峰的起落信號(hào)逐一收集和重復(fù)多次收集。15.2.7色譜數(shù)據(jù)處理裝置現(xiàn)代高效液相色譜儀多用微處理機(jī)控制，這通常是一臺(tái)專(zhuān)用的計(jì)算機(jī)，其功能有二，一是作為數(shù)據(jù)處理機(jī)，例如輸入定量校正因子，按預(yù)先選定的定量方法（歸一化、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法等），將面積積分?jǐn)?shù)換算成實(shí)際的成分分析結(jié)果，或者給出某些色譜參數(shù)；二是作為控制機(jī)，控制整個(gè)儀器的運(yùn)轉(zhuǎn)，例如按預(yù)先編好的程序控制沖洗劑的選擇、梯度淋洗、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理。所有指令和數(shù)據(jù)通過(guò)鍵盤(pán)輸入，結(jié)果在陰極射線管或繪圖打印機(jī)上顯示出來(lái)。更新一代的色譜儀，應(yīng)當(dāng)具有某些人工智能的特點(diǎn)，即能根據(jù)已有的規(guī)律自動(dòng)選擇操作條件，根據(jù)規(guī)律和已知的數(shù)據(jù)、信息，進(jìn)行判斷，給出定性定量結(jié)果。15.3 高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相15.3.1固定相高效液相色譜采用小顆粒、高效能的固定相，從而克服了經(jīng)典液相色譜中傳質(zhì)慢、柱效低的缺點(diǎn)。目前，高效液相色譜采用的固定相可分為以下幾類(lèi)。15.3.1.1按化學(xué)組成分類(lèi)微粒硅膠（無(wú)機(jī)材料）、高分子微球（有機(jī)材料）和微粒多孔碳（有機(jī)/無(wú)機(jī)材料）是幾種主要的類(lèi)型。310µm微粒硅膠和以此為基質(zhì)的各種化學(xué)鍵合固定相是目前高效液相色譜填料中占統(tǒng)治地位的化學(xué)類(lèi)型。這是由于硅膠具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，容易控制的孔結(jié)構(gòu)和表面積