南農(nóng) 細(xì)胞生物學(xué) 11

1、第十三章細(xì)胞衰老-5凋亡第一節(jié) 細(xì)胞衰老早期的細(xì)胞衰老研究 關(guān)于細(xì)胞衰老(cellular aging或cell senescence)的研究，在衰老生物學(xué)中占有特殊的地位。大量研究表明，衰老實(shí)際上也是一種細(xì)胞的重要生命活動。然而對這一問題的認(rèn)識過程卻是漫長而曲折的。 大約在100年前，當(dāng)魏斯曼提出種質(zhì)不死而體質(zhì)會衰老和死亡的學(xué)說時，他是將單細(xì)胞生物，特別是原生動物排除在外的。確實(shí)，當(dāng)時觀察到原生動物的某些無性系可以長期保持很高的分裂速度，因此關(guān)于原生動物不死的說法曾經(jīng)廣為流行。但以后的研究卻發(fā)現(xiàn)原生動物的細(xì)胞分裂不是均等的，新細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分并不是完全更新的，新細(xì)胞中也存在著老化的結(jié)構(gòu)成分；少

2、數(shù)強(qiáng)壯的無性系的存在并不能否定原生動物細(xì)胞衰老的事實(shí)。因此關(guān)于原生動物細(xì)胞“不死性”的說法就逐漸被廢棄了，代之而起的是關(guān)于某些無性系的穩(wěn)定性的觀點(diǎn)。 然而，當(dāng)Carrel和Ebeling宣布他們培養(yǎng)的雞心臟細(xì)胞可以無限制地生長和分裂(直到他們報告時，已連續(xù)培養(yǎng)了34年)時，細(xì)胞“不死性”的觀點(diǎn)不但卷土重來，而且?guī)缀跞〉昧藳Q定性的勝利。后來他們還報告說，雞胚成纖維細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下的生長速度與培養(yǎng)基中加入的雞血漿供體年齡呈負(fù)相關(guān)，似乎表明年老動物的血漿中存在有衰老因子。他們認(rèn)為細(xì)胞本身不會衰老，衰老是由于環(huán)境的影響。20世紀(jì)4050年代L系小鼠細(xì)胞和HeLa細(xì)胞系的建立，又使細(xì)胞“不死性”的觀

3、點(diǎn)的統(tǒng)治地位更加鞏固了。根據(jù)這種觀點(diǎn)，細(xì)胞本身沒有衰老和死亡，衰老只是一種多細(xì)胞現(xiàn)象，多細(xì)胞生物體內(nèi)觀察到的細(xì)胞衰老，起因不在細(xì)胞本身，而是由于體內(nèi)、體外環(huán)境的影響。這種觀點(diǎn)在60年代初，主要由于Hayflick等人的工作而受到猛烈的沖擊，并從根本上動搖了。 二、Hayflkk界限 1961年，Hayflick和Moorhead報告說，培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的衰老、退化和死亡的過程。若以1：2的比率連續(xù)進(jìn)行傳代(群體倍增)，則平均只能傳代4060次，此后細(xì)胞就逐漸解體并死亡。Hayflick等的發(fā)現(xiàn)很快就得到許多研究者的證實(shí)。他們的工作表明，細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定

4、的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是有名的Hayflick界限(HayflickLimitation)。Hayflick等的工作是對Carrel等人堅(jiān)持的關(guān)于細(xì)胞“不死性”的學(xué)說的徹底否定。此外，運(yùn)用現(xiàn)代的培養(yǎng)技術(shù)并不能重復(fù)出Carrel所觀察到的培養(yǎng)細(xì)胞無限生長的現(xiàn)象。Hayflick認(rèn)為Carrel每次向培養(yǎng)基中加入的雞胚提取物可能混雜人了新鮮的細(xì)胞。而不死的HeLa細(xì)胞和 L系小鼠細(xì)胞已被證明是不正常的細(xì)胞，它們的染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞了。此外，Hayflick等還發(fā)現(xiàn)，從胎兒肺得到的成纖維細(xì)胞可在體外條件下傳代50次，而從成人肺得到的成纖維細(xì)胞只能傳

5、代20次，可見細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)。這一現(xiàn)象也為許多研究者所證實(shí)。Goldstein選用了早老癥(Hayflick-Guilford綜合癥)及Werner氏綜合癥患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。這兩種病的患者表現(xiàn)出極其明顯的衰老特征，例如9歲的早老癥患者組織中已經(jīng)有老年色素的沉積，外貌看起來就像70多歲的人那樣老，通常在20歲前死去。從這種病人身上得到的成纖維細(xì)胞在體外只能傳代24次，其DNA合成亦較少，且細(xì)胞表面不具有正常成纖維細(xì)胞所具有的HLA抗原標(biāo)記。Wern er氏綜合癥患者的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的行為亦大體相同。這些研究有力地說明，體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞的增殖能力反映了它們在體

6、內(nèi)的衰老狀況。 Hayfiick還比較了取自壽命長度不同的生物的胚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的傳代數(shù)和壽命，發(fā)現(xiàn)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著確定的相關(guān)關(guān)系，例如Galapagos龜平均最高壽命最長，達(dá)175歲，其培養(yǎng)細(xì)胞的傳代數(shù)亦最多，達(dá) 90125次；小鼠平均最高壽命為35年，其培養(yǎng)細(xì)胞的傳代次數(shù)亦少，僅14 28次。 為了確定培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞的衰老是細(xì)胞本身決定的還是由于培養(yǎng)環(huán)境的惡化(例如培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，細(xì)菌的污染或有毒物質(zhì)的積累)， Hayflick設(shè)計(jì)了巧妙的實(shí)驗(yàn)：他以間期有無巴氏小體作為供體細(xì)胞的標(biāo)記，將取自老年男性個體的細(xì)胞(間期無巴氏小體)和取自年輕女性個體的細(xì)胞

7、(間期可見巴氏小體)進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)其倍增次數(shù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)中的兩類細(xì)胞的倍增次數(shù)與各自單獨(dú)培養(yǎng)時相同，即在同一培養(yǎng)基中，當(dāng)年輕細(xì)胞旺盛增殖的同時，年老細(xì)胞就停止生長了。這一結(jié)果有力地說明，決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不在外部環(huán)境。為了進(jìn)一步探求體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞衰老表達(dá)的控制機(jī)理，Wright和Hayflick用細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞，然后離心以除去細(xì)胞核，得到胞質(zhì)體(cytoplast)，再用胞質(zhì)體與完整細(xì)胞進(jìn)行雜交，觀察雜 種細(xì)胞衰老的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年輕的細(xì)胞胞質(zhì)體與年老的完整細(xì)胞融合時，得到的雜種細(xì)胞不能分裂；而年老的細(xì)胞胞質(zhì)體與年輕的完整細(xì)胞融合時，雜種細(xì)胞的分

8、裂能力與年輕細(xì)胞幾乎相同。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明，是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老的表達(dá)。至此，Hayflick界限，即關(guān)于細(xì)胞的增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)，為廣大的研究者所接受，認(rèn)為適用于很多類型的細(xì)胞；對于這些細(xì)胞來說，衰老是不可避免的，衰老的原因在于細(xì)胞本身。三、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老 實(shí)際上，在生活有機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生。例如蝌蚪發(fā)育時尾和鰓的消失就是通過細(xì)胞的死亡而實(shí)現(xiàn)的。但體內(nèi)細(xì)胞類型不同，其增殖狀況各異。神經(jīng)元及心肌細(xì)胞在發(fā)育的早期即已停止分裂，成為固定的有絲分裂后細(xì)胞，爾后它們逐漸衰老和死亡。人腦在衰老時神經(jīng)元的不斷喪失即是一個明證。

9、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞屬于回復(fù)性分裂后細(xì)胞，它們通常不分裂，但終身保持分裂能力，例如部分切除肝細(xì)胞后，剩余的肝細(xì)胞即能進(jìn)行旺盛的同步分裂。引起人們最大興趣的要算那些在正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞，上皮細(xì)胞等。它們的分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降?它們會不會衰老?這些問題引起了研究者們極大的興趣。 以往曾有人研究過不同年齡BCF，小鼠小腸腺窩上皮細(xì)胞的周期長度，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增高，細(xì)胞周期長度明顯延長。2月齡小鼠細(xì)胞周期總長度為 101h，而27月齡者竟達(dá)152h，延長50?？梢娝ダ蟿游矬w內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G，期明顯延長，S期的長度變化不大。其他研究者的工作亦得

10、到大體相同的結(jié)論。然而細(xì)胞周期的延長，亦即細(xì)胞分裂能力的下降的原因是什么?是由于細(xì)胞本身的衰老，還是由于體內(nèi)環(huán)境的惡化?為了解答這個問題，研究者們采用了組織移植技術(shù)。Krohn用近交系小鼠進(jìn)行皮膚移植實(shí)驗(yàn)。他將小鼠的皮膚移植到其F，后代身上，當(dāng)F1變老時，又移植到F2身上，這樣他進(jìn)行了系列移植，結(jié)果移植的皮膚細(xì)胞可生活78年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來供體的壽命，這表明引起小鼠皮膚細(xì)胞在體內(nèi)衰老的主要是體內(nèi)環(huán)境。Daniel用小鼠乳腺上皮進(jìn)行了系列移植實(shí)驗(yàn)，如果兩次移植的間隔時間為1年，則可存活6年，也明顯長于小鼠的壽命，說明衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了上皮細(xì)胞的增殖和衰老。 研究得最為充分的要算骨髓干細(xì)胞

11、的移植。骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生淋巴細(xì)胞、紅血細(xì)胞、粒細(xì)胞及血小板的前體細(xì)胞。Hirokawa等將老年動物進(jìn)行強(qiáng)輻射處理，破壞其免疫干細(xì)胞，然后移植人年輕動物的骨髓和新生小鼠的胸腺，結(jié)果觀察到年老受體動物細(xì)胞免疫功能復(fù)壯。這似乎表明免疫功能的復(fù)壯是由于年輕動物的干細(xì)胞取代了原來老化了的干細(xì)胞。Astle和Hirokawa(1984)重復(fù)并證實(shí)了Hirokawa等的實(shí)驗(yàn)，他們還發(fā)現(xiàn)，如果移植的骨髓干細(xì)胞是來自年老的動物，那么免疫反應(yīng)就仍然保持在較低的水平上，不會復(fù)壯。他們認(rèn)為免疫反應(yīng)是 否復(fù)壯，關(guān)鍵在于供體與受體的年齡組合。他們的結(jié)論是，老年動物干細(xì)胞的免疫缺陷只是在老年受體中才表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明老年

12、動物體內(nèi)似乎存在有阻抑細(xì)胞或阻抑因子，抑制了免疫反應(yīng)。 總之，根據(jù)以上的研究，雖然不能認(rèn)為骨髓干細(xì)胞沒有衰老，但可以說，它們的衰老至少是比較緩慢的。揭示干細(xì)胞衰老緩慢的機(jī)理，對于了解衰老的本質(zhì)，無疑是十分重要的。四、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化 細(xì)胞在衰老過程中，其結(jié)構(gòu)會發(fā)生深刻的變化。 (一)細(xì)胞核的變化 在體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核的大小是倍增次數(shù)的函數(shù)，即隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，核不斷增大。 細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的衰老變化中最明顯的是核膜的內(nèi)折(inva畫na“。n)，這在培養(yǎng)的人肺成纖維細(xì)胞中比較明顯。在體內(nèi)細(xì)胞中也可觀察到核膜不同程度的內(nèi)折，神經(jīng)細(xì)胞尤為明顯，這種內(nèi)折與年齡俱增。核膜內(nèi)折在老年小

13、鼠的普肯耶細(xì)胞、海馬、垂體前葉及肝細(xì)胞中均可觀察到。染色質(zhì)固縮化是衰老細(xì)胞核中的另一個重要變化。體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，晚代細(xì)胞的核里可明顯看到染色質(zhì)的固縮化，而早代細(xì)胞的核只有輕微的固縮作用。除了培養(yǎng)細(xì)胞外，體內(nèi)細(xì)胞，如老年果蠅的細(xì)胞，老年靈長類的垂體細(xì)胞及大鼠頜下腺的腺泡細(xì)胞中，都可觀察到染色質(zhì)的固縮化。染色質(zhì)固縮作用與染色質(zhì)蛋白的二硫鍵有關(guān)。此外，在酵母 Sgsl突變體衰老細(xì)胞中還觀察到核仁裂解為小體的現(xiàn)象。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化 Hasan和Glees比較了不同年齡大鼠海馬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)年輕動物的細(xì)胞中，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育良好，排列有序；而在年老動物中，這種有序的排列已不復(fù)存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分

14、彌散性地分散于核周胞質(zhì)中。在衰老大鼠的側(cè)前庭核及小腦普肯耶細(xì)胞中，均觀察到糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體的趨勢。在光學(xué)顯微鏡下用堿性染料染色，可以觀察到小鼠和人的大腦及小腦某些神經(jīng)元中尼氏物質(zhì)的含量隨年齡增長而下降，而尼氏小體實(shí)際上代表了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體群。觀察體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)26次倍增以前的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔膨脹擴(kuò)大，含有不定形的致密物質(zhì)，且為核糖體所覆蓋；而40次倍增以后的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔未見膨脹，所含不定形致密物質(zhì)亦少，且具無核糖體覆蓋區(qū)段?？偟恼f來，衰老細(xì)胞中糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了。 (三)線粒體的變化 多數(shù)研究者的工作表明，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨年齡增大而減少，而其體積則隨年齡增大而增大

15、。例如在衰老小鼠的神經(jīng)肌肉連接的前突觸終末中可以觀察到線粒體數(shù)量隨年齡增大而減少。同時許多報告表明，在小鼠、大鼠及人肝的衰老細(xì)胞中，線粒體發(fā)生膨大。膨大的線粒體中有時可見到清晰的嵴，偶爾亦會 觀察到線粒體內(nèi)容物呈現(xiàn)網(wǎng)狀化并形成多囊體，以及外膜破壞，多囊體釋出的情況。 在培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞中，還觀察到兩種不同類型的線粒體：I型固縮緊密，型大而稀疏，通常每個細(xì)胞只含一種類型的線粒體；隨著倍增次數(shù)的增加， I型線粒體越來越多。 (四)致密體的生成 致密體(densebodies)是衰老細(xì)胞中常見的一種結(jié)構(gòu)，絕大多數(shù)動物細(xì)胞在衰老時都會有致密體的積累。除了致密體外，這種細(xì)胞成分還有許多不同的名稱，如脂

16、褐質(zhì)(Upofuscin)、老年色素(ageOrsenilepigment)、血褐質(zhì)(hemofuscin)、脂色素(1ipochrome)、黃色素(yellowpigment)、透明蠟體(hyaloceroid)及殘體 (residualbodies)等等。致密體的發(fā)現(xiàn)可上溯至19世紀(jì)，但只是近年來才逐漸弄清了它們的起源。較近的研究提供了大量證據(jù)，表明致密體是由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來。多數(shù)致密體具單層膜且有陽性的磷酸酶反應(yīng)，這和溶酶體是一致的。少數(shù)致密體顯然是由線粒體轉(zhuǎn)化而來，因?yàn)榭梢钥吹诫p層膜結(jié)構(gòu)，有時嵴的結(jié)構(gòu)也依稀可見。脂褐質(zhì)通常產(chǎn)生自發(fā)熒光，它是自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物。 (五

17、)膜系統(tǒng)的變化 年輕的功能健全的細(xì)胞的膜相是典型的液晶相，這種膜的脂雙層比較柔韌，脂肪酸鏈能自由移動，每個脂質(zhì)分子與其相鄰分子之間的位置交換極其頻繁，埋藏于其中的蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出最大的生物學(xué)活性。衰老的或有缺陷的膜通常處于凝膠相或固相，這時磷脂的脂肪酸尾被“凍結(jié)”了，完全不能自由移動，而膜就變?yōu)閯傂缘牧?，因此埋藏于其中的蛋白質(zhì)也就不能再運(yùn)動了；在機(jī)械刺激或壓迫等條件下，膜就會出現(xiàn)裂隙，其選擇透性及其他功能均受到損害。 此外，細(xì)胞衰老時，細(xì)胞間間隙連接及膜內(nèi)顆粒的分布也發(fā)生變化。間隙連接在細(xì)胞間離子和小分子代謝物的交換上起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的 IMR90晚代細(xì)胞的間隙連接明顯減少，組成

18、間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。為了觀察間隙連接的變化對細(xì)胞間的代謝聯(lián)系產(chǎn)生的影響，研究者們還用放射自顯影技術(shù)來研究重建間隙連接的年輕或年老細(xì)胞間3H脲嘧啶核苷酸的交換。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重新集聚4 h后，70的年輕細(xì)胞從共同培養(yǎng)的年輕供體細(xì)胞得到3H脲嘧啶，而只有30的年老細(xì)胞從共同培養(yǎng)的年老供體細(xì)胞中得到了這種物質(zhì)。這表明，衰老時間隙連接的減少，使細(xì)胞間代謝協(xié)作減少了。 用冷凍斷裂法可以看到細(xì)胞膜P面的膜內(nèi)顆粒在年老細(xì)胞中明顯減少，而正面顆粒相對增加，但總顆粒數(shù)的變化不顯著。這種變化反映了衰老細(xì)胞中膜內(nèi)顆粒在膜平面上進(jìn)行側(cè)向運(yùn)動能力的喪失。五、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制 20世紀(jì)90年代以來，關(guān)于細(xì)胞衰老的

19、分子機(jī)制的研究有了重大進(jìn)展，最突 出的成果有：單基因的突變導(dǎo)致壽命的顯著延長，對這些基因的克隆及其產(chǎn)物特性和功能的研究，使我們對細(xì)胞衰老的分子機(jī)制的認(rèn)識大大加深了；端粒和端粒酶與細(xì)胞衰老關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，提供了控制細(xì)胞衰老的新途徑，除此以外，在其他一些有關(guān)衰老機(jī)制的研究上，也取得了不同程度的進(jìn)展。 (一)氧化性損傷學(xué)說的發(fā)展 早在20世紀(jì)50年代，Harman就已提出衰老的自由基理論，以后又不斷有所發(fā)展。這一理論認(rèn)為，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子(reactiveoxygen species，ROS)引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。細(xì)胞從外界吸收的氧中約有23變成了ROS，ROS主要有三種

20、類型：·02，即超氧自由基；·OH，即羥自由基；H202。它們的高度活性，引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷乃至破壞。例如ROS可以氧化不飽和脂肪酸，并產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)，后者進(jìn)一步分解，產(chǎn)生小分子醛類物質(zhì)，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)等大分子的交聯(lián)。根據(jù)衰老的自由基理論，清除ROS，就可以延長壽命。事實(shí)也確實(shí)如此。近年來發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)CuZnSOD和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)基因果蠅壽命比野生型長34；而將人SODl的基因轉(zhuǎn)入成年果蠅的運(yùn)動神經(jīng)元中，使果蠅壽命延長40。差不多同時，有人在線蟲中發(fā)現(xiàn)了一個ageI突變體，其壽命為野生型的兩倍，且其SOD及過氧化氫酶活性及對ROS

21、的抵抗力均比野生型高。那末，age 5和SOD的基因有什么關(guān)系?它們是否是同一個基因呢?研究者克隆了線蟲SOD的基因，發(fā)現(xiàn)其位置在tra 2和UTIC。4兩個位點(diǎn)之間，這和當(dāng)時推定的ageJ基因的位置重疊，從而燃起了人們的希望。如果這二者是同一基因，那末age 5突變體的長壽應(yīng)歸因于SOD的抗氧化功能了。然而，很快就發(fā)現(xiàn)，這兩個基因在位置上有一定的距離，從而否定了當(dāng)初的猜想?，F(xiàn)在我們知道，ageI基因編碼磷脂酰肌醇3激酶的p110催化亞基，其產(chǎn)物介導(dǎo)磷脂酰肌醇的信號傳遞路線，而和抗氧化作用無關(guān)。 進(jìn)一步的研究更使人們對SOD這一類抗氧化因子對衰老的影響提出了疑問，有人將小鼠的谷胱甘肽過氧化物酶

22、基因及SODl、SOD2和SOD3基因中的一種剔除，并未引起衰老的加速。 除了age 5基因外，近年來還在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一種和壽命的延長有關(guān)的基因，即clkJ基因。這個基因是酵母中參與CoQ合成的Cat5基因的同類物。確實(shí)線蟲的clk I突變體中CoQ含量也較低。CoQ是線粒體呼吸鏈的成員， CoQ的缺乏，使電子傳遞減慢，ROS的形成減少，代謝變慢，這可能是cigJ突變體壽命較長的原因。 (二)端粒與衰老 端粒(telomere)是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，其DNA由簡單的串聯(lián)重復(fù)序列組成。它們在細(xì)胞分裂過程中不能為DNA聚合酶完全復(fù)制，因而隨著細(xì)胞分裂的不斷進(jìn)行而逐漸變短，除非有端粒酶(te

23、lomerase)的存在。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反轉(zhuǎn)錄酶亞基(在人細(xì)胞中為hTRT)則催化端粒DNA的合成。 合成的端粒重復(fù)序列加在染色體的末端。人的染色體端粒由TTAGGG CCCTAA重復(fù)序列組成。在生殖細(xì)胞中，由于存在端粒酶的活性，端粒保持約 15 kb的長度，而在人的體細(xì)胞中，由于不存在端粒酶的活性，端粒要短得多。 1990年Harley等人用人工合成的(TTAGGG)，作為探針，對胎兒、新生兒、青年人及老年人的成纖維細(xì)胞的端粒長度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)端粒長度隨年齡增長下降。在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，端粒長度則隨著分裂次

24、數(shù)的增加而下降。在這些研究的基礎(chǔ)上，提出了細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為，隨著細(xì)胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當(dāng)端粒長度縮短達(dá)到一個閾值時，細(xì)胞就進(jìn)人衰老。到了1998年，Wright等人提出了更加令人信服的證據(jù)。他們將人的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶亞基(hTRT)基因通過轉(zhuǎn)染，引入正常的人二倍體細(xì)胞(人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和包皮成纖維細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)端粒酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其端粒長度明顯增加，分裂旺盛，作為細(xì)胞衰老指標(biāo)的9半乳糖苷酶活性則明顯降低，與對照細(xì)胞形成極鮮明的反差。此外，表達(dá)端粒酶的細(xì)胞壽命比正常細(xì)胞至少長20代，且其核型正常。這一研究提供的證據(jù)確實(shí)令人信服，說明端粒長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)

25、系。 當(dāng)然也有不少研究報告不支持這一學(xué)說。就在同一年(1998年)，Carman等報告說，二倍體的敘利亞倉鼠胚細(xì)胞在復(fù)制分裂的各階段始終表達(dá)端粒酶，其端粒長度亦保持恒定，然而經(jīng)過2030代分裂后，仍然進(jìn)入衰老。另外，某些小鼠終生保持較長的端粒，但并未因此而獲得較長的壽命；特別是剔除端粒酶基因的小鼠已經(jīng)獲得，但在其前5代中，迄今未觀察到相應(yīng)的表型的變化(如壽命的縮短)?？磥?，衰老的“端粒鐘學(xué)說”還需要經(jīng)受更多的檢驗(yàn)。 (三)rDNA與衰老 這方面的研究主要是在Scerevisiae中進(jìn)行的。這種酵母的細(xì)胞分裂是不對稱的，每次分裂，產(chǎn)生一個大的母細(xì)胞和一個小的子細(xì)胞，母細(xì)胞分裂若干代后就進(jìn)人衰老。

26、經(jīng)過大量的研究，已經(jīng)確定細(xì)胞衰老的步伐是由rDNA的變化所決定的。Scereuisiae中，rDNA以100200份串聯(lián)拷貝的形式存在于第12號染色體上，在酵母達(dá)到生命的“中年”時的某一時刻，通過同源重組產(chǎn)生的第一份環(huán)狀rDNA片段會膨沖而出，成為染色體外rDNA環(huán)(extrachromosomalrDNA circle，ERC)。隨著細(xì)胞分裂的不斷進(jìn)行，ERC不斷復(fù)制增加。當(dāng)積累到500 1 000份拷貝時，細(xì)胞就進(jìn)入衰老(圖131)。用雙向電泳法也證明，年老的細(xì)胞中積累了許多密閉的環(huán)狀rDNA，而年輕細(xì)胞中則以線性的基因組DNA為主，只含有極少量的環(huán)狀rDNA。ERC的積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老，

27、并伴隨著核仁的裂解。 ERC積累引起細(xì)胞衰老的機(jī)制是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，一般認(rèn)為它適用于哺乳類中由分裂細(xì)胞組成的組織。但關(guān)于哺乳類動物細(xì)胞中環(huán)狀DNA隨年齡積累的報導(dǎo)并不多見，而且已知的環(huán)狀DNA不包括rDNA。這方面還需要進(jìn)一步的研究。 OOOO (四)沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物與衰老 沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物(silencinginformationregulatorcomplex，SirCom plex)，簡稱S汀復(fù)合物，包括S汀1、S讓2、S汀3、Sid，通常存在于異染色質(zhì)中。它們一方面與RAPl和組蛋白H3114結(jié)合，一方面附在核基質(zhì)上。S汀復(fù)合物的功能是阻止它們所在位點(diǎn)的DNA的轉(zhuǎn)錄。在酵母

28、中，S讓復(fù)合物通常存在于端粒及與性別決定有關(guān)的HML和HMR位點(diǎn)上。核糖體DNA重復(fù)序列 1DNA'7 1票薯稱分離 ， 掃蕩必需 的細(xì)胞因子 死亡 圖131 酵母中ERC生成示意圖酵母rDNA由多份重復(fù)序列組成，同源重組往往發(fā)生在相鄰重復(fù)序列的某 DNA損傷點(diǎn)上；SGSl基因和SIR基因減緩ERC積累的速率 1994年Kennedy等發(fā)現(xiàn)，在一種被稱為SIR442的酵母突變體中，Sir3蛋白和Sir4蛋白發(fā)生重新分布的現(xiàn)象，即由端粒等處向核仁轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移伴隨著壽命的延長。這一研究表明，核仁的沉默化與壽命的延長有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)，從這個突變體中得到的Sir4蛋白，其羧基末端的121個氨基

29、酸殘基被除去。這個區(qū)域本是Sir4蛋白與端粒和HM處的RAPl蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。這一區(qū)域的去除，使Sir復(fù)合物得以自由定位，從端粒和HM位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至核仁，使核仁的rDNA處于沉默狀態(tài)，抑制了復(fù)制，同源重組及ERC的生成和積累，從而延長了壽命。 (五)SGSl基因、WRN基因與衰老 在酵母中發(fā)現(xiàn)了一種sgsl突變體，其壽命明顯短于野生型。野生型平均分裂245代，最高分裂代數(shù)為40代；而sgsl突變體平均分裂95代，最高分裂代數(shù)為18。這表明SGSl基因的缺陷或喪失明顯影響了壽命。研究者進(jìn)一步克隆了SGSi基因并分析它所編碼的蛋白，發(fā)現(xiàn)它屬于RecQ亞族的DNA解旋酶。 對sgsl突變細(xì)胞的觀察

30、，發(fā)現(xiàn)其核仁結(jié)構(gòu)在年輕細(xì)胞中正常，而在年老細(xì)胞中，核仁裂解為小體。應(yīng)用免疫熒光法發(fā)現(xiàn)了SGSl蛋白在細(xì)胞中的定位。超過90的細(xì)胞中，SGSl蛋白集中在核仁。核仁如果缺少SGSl蛋白就會裂解。同時，在sgsl突變細(xì)胞衰老時，可觀察到SIR蛋白向核仁的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至核仁的SIR蛋白有阻止核仁裂解和細(xì)胞衰老的作用。當(dāng)比較正常酵母(SGSl SIR3)和(sgsllsir3)突變體時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)12次分裂后，前者核仁裂解率為6，而后者達(dá)19，說明SIR蛋白向核仁的轉(zhuǎn)移，抑制了核仁的裂解，延長了壽命。 另一方面，近年來人們也以Werner綜合癥(WS)為對象，進(jìn)行衰老機(jī)制的研究。Werner綜合癥是一種引發(fā)早

31、老的疾病。WS病人出生后10歲前基本正常； 1020歲時，缺少正常的青春期快速生長過程；20多歲時，出現(xiàn)雙眼白內(nèi)障、白發(fā)、脫發(fā)等正常人老年時才會出現(xiàn)的現(xiàn)象；30多歲時，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，型糖尿病，動脈粥樣硬化，腫瘤等；40歲以后，心血管病、腫瘤發(fā)生頻率大大增加。取自 WS病人的細(xì)胞在體外條件下培養(yǎng)，分裂代數(shù)比正常人的細(xì)胞少得多；其細(xì)胞中發(fā)生染色體重排，刪除突變頻率大大增加，所以WRN基因是保證正常壽命所必需的。WRN基因與SGSl基因同源。WRN蛋白含1 432個氨基酸殘基，具有 7個DNA解旋酶所特有的標(biāo)志性序列。對WS病人的WRN蛋白的分析表明，不同病人的WRN蛋白發(fā)生了不同的突變，影響其正常

32、功能，造成DNA復(fù)制的嚴(yán)重障礙。用免疫熒光法也證明，正常人的成纖維細(xì)胞中，WRN蛋白位于核仁中，而來自WS病人的皮膚成纖維細(xì)胞中，觀察不到典型的WRN蛋白。這些結(jié)果表明，編碼DNA解旋酶的人WRN基因和酵母SGSl基因是保證細(xì)胞正常生命周期所必需的，如果發(fā)生突變，就會引起衰老的提前發(fā)生和壽命的縮短。 (六)發(fā)育程序與衰老 近年來，用線蟲進(jìn)行的發(fā)育程序與衰老關(guān)系的研究取得了重要的進(jìn)展，線蟲 (Canorhabaitiselegans)的幼蟲期持續(xù)約4天，然后達(dá)到性成熟并進(jìn)入成蟲期。 成蟲期延續(xù)數(shù)周，隨即衰老死亡。當(dāng)線蟲幼蟲在發(fā)育過程中遇到不良環(huán)境(如蟲口過密、食物短缺或高溫)，引起性外激素濃度的

33、變化，結(jié)果幼蟲就進(jìn)入一種特殊的稱為dauer幼蟲的階段，可以延續(xù)6個月之久。dauer幼蟲全身被以厚的角質(zhì)層，口緊閉，處于休眠狀態(tài)。如果環(huán)境條件改善，dauer幼蟲又可發(fā)育為成蟲，經(jīng)過數(shù)周，完成其生活史。線蟲的這種特殊的發(fā)育模式引起了研究者的強(qiáng)烈興趣，因?yàn)檫@牽涉到發(fā)育方向的決定和壽命的延長。遺傳分析表明，存在著兩類有關(guān) dauer幼蟲形成(dauer formation)的基因，稱為d。廠基因。第一類為do撐和 agel基因，第二類為ddJ6基因。do口編碼類胰島素受體，agel編碼磷脂酰肌醇3激酶(PI3激酶)的p110催化亞基，dd16編碼一種轉(zhuǎn)錄活化劑。野生型線蟲若處于正常條件下，dd口

34、和agel正常表達(dá)，DAF2受體蛋白及其下游的PI3激酶進(jìn)行正常的信號傳導(dǎo)，決定了正常的成蟲發(fā)育。在饑餓或蟲口過密的條件下，d。J6基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄活化因子DAFl6的活性明顯增強(qiáng)，使線蟲朝dauer幼蟲的方向發(fā)育。在某些dd口或agel突變體中，dd口或agel基因部分得到表達(dá)。這樣，部分活化的DAF2AGEl信號傳導(dǎo)導(dǎo)致決定成蟲發(fā)育和 dauer幼蟲特異的防御機(jī)制的同時表達(dá)，其結(jié)果是完成正常的成蟲發(fā)育，而又獲得壽命的延長(延長24倍)。這些工作為衰老機(jī)制的探索提供了有意義的信息。高等哺乳動物，包括人類的發(fā)育程序要遠(yuǎn)為復(fù)雜，要真正揭示衰老的機(jī)制需要深入持久的努力。 (七)線粒體DNA與衰老 2

35、0世紀(jì)80年代，Cummings等人曾經(jīng)提出，線粒體DNA中存在著衰老 DNA(SenDNA)。近十年來，這方面未見突破性的進(jìn)展。線粒體DNA的高突變速率引起研究者的重視是毫不奇怪的。近年來，應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)一步證明，隨著年齡的增長，線粒體DNA的突變是相當(dāng)顯著的。衰老的骨骼肌細(xì)胞中 165 kb的線粒體DNA產(chǎn)生了許多隨機(jī)的各不相同的刪除突變。由于線粒體 DNA參與電子傳遞鏈中某些成員的編碼，因而線粒體DNA的突變可能導(dǎo)致電子傳遞鏈不能執(zhí)行其正常功能。例如某種刪除突變引起細(xì)胞色素氧化酶的缺失，從而干擾了電子傳遞。結(jié)果引起ATP水平和NADNADH比率的下降，促進(jìn)了ROS的生成，反過來又引

36、起線粒體DNA產(chǎn)生更多的突變。 雖然線粒體DNA突變的積累對細(xì)胞衰老產(chǎn)生一定的影響，然而這可能不是引起衰老的初始原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，線蟲的agel基因的突變引起壽命的延長，同時也明顯減緩了線粒體DNA丟失突變的積累。這表明線粒體DNA的突變可能處于受agel突變直接影響的其他衰老事件的下游。 總的來說，細(xì)胞衰老機(jī)制的研究在近十年中確有不少建樹，但謎底的真正揭曉，還要走相當(dāng)長的路。 第二節(jié) 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義 細(xì)胞凋亡一詞，即apoptosis(apo-ptosis)，源自古希臘語，意指花瓣或樹葉的脫落、凋零。選用這一名詞，是強(qiáng)調(diào)這一過程是一種自然的生理學(xué)過程。細(xì)胞凋亡是一

37、個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。由于細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以也常常被稱為細(xì)胞編程性死亡(pro grammedcelldeath，PCD)。PCD最初是發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，其含義是發(fā)育過程中(例如幼蟲發(fā)育為成蟲)發(fā)生的某類細(xì)胞(例如肌肉細(xì)胞)的大量死亡，而這種細(xì)胞死亡要求一定的基因表達(dá)。 在生物的生長發(fā)育過程中，細(xì)胞有絲分裂固然是十分重要的事件，但細(xì)胞凋亡也是不可或缺的另一個重要方面。細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。通過細(xì)胞凋亡，有機(jī)體得以清除不再需要的細(xì)胞，而不引起炎癥反應(yīng)。在發(fā)

38、育過程中，幼體器官的縮小和退化如蝌蚪尾的消失等，都是通過細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。在成熟個體的組織中，細(xì)胞的自然更新，被病原體感染細(xì)胞的清除也是通過 PCD來完成的。在發(fā)育過程中和成熟組織中細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量是驚人的。健康的成人體內(nèi)，在骨髓和腸中，每小時約有10億個細(xì)胞凋亡。脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，約有50的細(xì)胞凋亡，通過細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，使之與需要神經(jīng)支配的靶細(xì)胞的數(shù)量相適應(yīng)。胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生了過量的神經(jīng)細(xì)胞，它們競爭靶細(xì)胞所分泌的生存因子。只有接受了足夠量的生存因子的神經(jīng)細(xì)胞才能存活，其他的細(xì)胞則發(fā)生凋亡。實(shí)際上，發(fā)育過程中手和足的成形過程就伴隨著細(xì)胞的凋亡。胚胎時期，它們呈

39、鏟狀，以后指或趾之間的細(xì)胞凋亡，才逐漸發(fā)育為成形的手和足(圖132)。淋巴細(xì)胞的克隆選擇過程中，細(xì)胞凋亡更是起著關(guān)鍵的作用。此外，各種殺手免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊并引起其死亡，也是基于細(xì)胞凋亡。另一方面，細(xì)胞凋亡的失調(diào)包括不恰當(dāng)?shù)募せ罨蛞种茣?dǎo)致疾病，例如Alzheimer氏病、各種腫瘤、艾滋病以及自身免疫病等。 細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象最早是Kerr在1965年觀察到的。他發(fā)現(xiàn)大鼠肝細(xì)胞，在局部缺血條件下連續(xù)不斷地轉(zhuǎn)化為小的圓形的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)，這些細(xì)胞質(zhì)團(tuán)是由膜包裹的細(xì)胞碎片(包括細(xì)胞器和染色質(zhì))組成。當(dāng)時他稱這種現(xiàn)象為“皺縮型壞死”。但后來，他覺得這一名稱并不恰當(dāng)，因?yàn)檫@些圓形細(xì)胞質(zhì)團(tuán)是在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生的

40、。經(jīng)過深思熟慮后，他于1972年將這一現(xiàn)象重新定名為細(xì)胞凋亡。此后，細(xì)胞凋亡很快就受到各國科學(xué)家的重視，進(jìn)行了深入的研究，進(jìn)入20世紀(jì) 90年代，有關(guān)細(xì)胞凋亡的研究更是蓬勃發(fā)展，每隔數(shù)周就有重要的突破性的報告發(fā)表，進(jìn)展之快，不是一般的生物學(xué)領(lǐng)域能夠望其項(xiàng)背的?，F(xiàn)在我們對細(xì)胞凋 亡的機(jī)制已經(jīng)有了比較清晰的了解，當(dāng)然不少細(xì)節(jié)仍需進(jìn)一步闡明；細(xì)胞凋亡與疾病關(guān)系的研究也已取得長足的進(jìn)展。有理由相信，細(xì)胞凋亡的研究成果，將為人類某些重大疾病的治療和控制提供有力的武器。 圖132 小鼠趾間經(jīng)特異性染色所觀察到的凋亡形態(tài)細(xì)胞凋亡過程中的小鼠趾；B：一天后的小鼠趾(引自MDJacobson e(。)細(xì)胞凋亡的

41、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征 (一)細(xì)胞凋亡與壞死 細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)是兩種截然不同的細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象。如前所述，細(xì)胞凋亡是一種主動的由基因決定的細(xì)胞自我破壞的過程，而壞死則是極端的物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激引起的細(xì)胞損傷和死亡。二者的主要區(qū)別是：細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體(apoptoticbodies)，凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬，整個過程中，細(xì)胞膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)；相反，在細(xì)胞壞死時，細(xì)胞膜發(fā)生滲漏，細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到

42、胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)(圖133)。我們在下面將會講到，細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其調(diào)控是極其復(fù)雜的，在長期的進(jìn)化過程中形成的這種復(fù)雜的機(jī)制對于維持生物體的正常功能是極其重要的。 (二)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程，在形態(tài)學(xué)上可分為三個階段：凋亡的起始。這一階段的形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整，未失去選擇透性；細(xì)胞質(zhì)中，線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。這一階段經(jīng)歷數(shù)分鐘，然后進(jìn)人第二階段；凋亡小體的形成。首先，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些

43、細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍。從外觀上看，細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起(圖134)。以后，逐漸分隔，形成單個的凋亡小體；凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞所吞噬并消化。從細(xì)胞凋亡開始，到凋亡小體的出現(xiàn)才數(shù)分鐘，而整個細(xì)胞凋亡過程可能延續(xù)49 h。 圖133 細(xì)胞凋亡與壞死的比較 1正常細(xì)胞；2細(xì)胞凋亡的起始，染色質(zhì)固縮、分離并沿核膜分布，細(xì)胞質(zhì)亦發(fā)生固縮；3凋亡中的細(xì)胞，細(xì)胞膜反折，包圍細(xì)胞碎片，如染色質(zhì)片斷和細(xì)胞器，形成芽狀突起，以后逐漸分隔，形成凋亡小體；4凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬；5壞死的早期階段，染色體形成串狀片段，細(xì)胞器膨脹，線粒體基質(zhì)呈絮狀；6壞死的最后階段，細(xì)胞膜破裂，細(xì)

44、胞解體內(nèi)容物散逸 (三)細(xì)胞凋亡的生化特征 在caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的關(guān)鍵作用(見后)發(fā)現(xiàn)以前，人們所認(rèn)識到的細(xì)胞凋亡的最主要特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結(jié)果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時，形成了特征性的梯狀條帶(DNAladders)，其大小為180200bp的整數(shù)倍。到目前為止，梯狀條帶仍然是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法。催化DNA降解的是依賴于CMg”的核酸內(nèi)切酶，而Zn2則抑制其活性。 凋亡細(xì)胞的另一個重要特征是tTG(組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶dssuetransglutami- nase)的積累并達(dá)到較高的水平。tTG催化某些蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，主

45、要是通過建立谷氨酰胺和賴氨酸之間的交聯(lián)以及多胺摻人蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的，其結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合。這類蛋白聚合物不溶于水，不為溶酶體的酶所降解，它們進(jìn)入凋 亡小體，有助于保持凋亡小體暫時的完整性，防止有害物質(zhì)的逸出。tTG只在不再分裂的、已完成分化的細(xì)胞中處于活性狀態(tài)。tTG是依賴于Ca2的酶，在生活的正常細(xì)胞中，由于Ca2濃度較低(<1Pm。lL)，tTG的活性很低；當(dāng)?shù)蛲銎鹗紩r，Ca2濃度上升，從而使tTG活化。 圖134 正常與凋亡細(xì)胞形態(tài)比較 A：正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(掃描電鏡)；B：凋亡T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(掃描電鏡) C：膜出泡抑制劑處理的凋亡細(xì)胞(透射電鏡) (四)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子 誘

46、導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子大致可分為兩大類： (1)物理性因子：包括射線(如紫外線、丁射線等)，較溫和的溫度刺激(如熱激、冷激)等。 (2)化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子(如超氧自由基、羥自由基、 H202)、鈣離子載體、VK3、視黃酸、細(xì)胞毒素(如fumonisins和AAL毒素)。DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑(如環(huán)己亞胺)、正常生理因子(如激素、細(xì)胞生長因子等)的失調(diào)，腫瘤壞死因子。(TNFa)，抗FasApo1CD95抗體等。 (五)細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞凋亡的檢測是基于凋亡細(xì)胞所形成的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，特別是 DNA的斷裂。 1形態(tài)學(xué)觀測 應(yīng)用各種染色法可觀察到凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)特征，有

47、些染料如臺盼藍(lán) (trypanblue)為活細(xì)胞排斥，但可使死細(xì)胞著色。DAPI是常用的一種與DNA結(jié)合的熒光染料。借助DAPI染色，可以觀察到細(xì)胞核的形態(tài)變化。Giemsa染色法可以觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體的形成等形態(tài)。此外，使用透視和掃描電鏡則可觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化如染色質(zhì)固縮、凋亡小體的形成、細(xì)胞發(fā)泡等現(xiàn)象。 有時也有用兩種染料進(jìn)行復(fù)染，以便更可靠地確定細(xì)胞凋亡的變化。例如用吖啶橙(AO)和溴乙錠(EB)進(jìn)行復(fù)染，AO只進(jìn)入活細(xì)胞，正常的細(xì)胞核及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色；EB只能進(jìn)入死細(xì)胞，將死細(xì)胞及凋亡晚期細(xì)胞的核染成橙紅色。 2DNA電泳 細(xì)胞發(fā)生凋亡時，DNA

48、發(fā)生特征性的核小體間的斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是180200 bp的整數(shù)倍。凋亡細(xì)胞中提取的DNA在進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴乙錠進(jìn)行染色時，這些大小不同的DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶。絕大多數(shù)凋亡細(xì)胞中DNA的斷裂都表現(xiàn)出這種特征(圖135)。 圖135 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖(引自趙允、翟中和) 1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h；2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h；3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h；4細(xì)胞色素 c誘導(dǎo)3 h；5細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4 h；6陰性對照；7Marke， 3TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法 TUNEL測定法是terminal deoxynucleotidyl tr

49、ansferase(TdT)mediated dUTPnickendlabeling的縮寫，意指末端脫氧核苷酸移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法。這一方法能對DNA分子中3OH斷裂缺口進(jìn)行原位標(biāo)記。凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3OH末端，可借助一種可觀測的標(biāo)記物，如熒光素進(jìn)行原位標(biāo)記，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。 4彗星電泳法 彗星電泳法(cometassay)的原理是將單個細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中進(jìn)行短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，這是一種快

50、速簡便的凋亡檢測法。 5流式細(xì)胞分析 最常用來分析細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞技術(shù)是根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。三、細(xì)胞凋-ff的分5-機(jī)制 (一)easpase家族與凋亡 1caspase家族 caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點(diǎn)是特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase一詞是從cysteineasparticacicspecific protease的詞頭和詞尾縮寫衍生而來，反映了這個特征，而這種高度的特異性在蛋白酶中是很少見的。

51、由于這種特異性，使caspase能夠高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種切割只發(fā)生在少數(shù)(通常只有1個)位點(diǎn)上，主要是在結(jié)構(gòu)域間的位點(diǎn)上，切割的結(jié)果或是活化某種蛋白，或是使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。 caspase的研究源于線蟲(Celegans)細(xì)胞程序化死亡的研究。線蟲在發(fā)育過程中，有131個細(xì)胞將進(jìn)入程序化死亡；研究發(fā)現(xiàn)有11個基因與PCD有關(guān)，其中ced3和ced4基因是決定細(xì)胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。線蟲細(xì)胞程序化死亡的研究促進(jìn)了其他動物特別是哺乳類動物中細(xì)胞凋亡的研究。人們發(fā)現(xiàn)哺乳類細(xì)胞中存在著Ced3的同源物ICE(interleukin邛converti

52、ng en zyme)，它催化白介素印的活化，即從其前體上將幾印切割下來。在大鼠成纖維細(xì)胞中過量表達(dá)ICE和Ced3都會引起細(xì)胞凋亡，表明了ICE和Ced3在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性；然而剔除ICE的基因的小鼠其表型正常，并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯改變。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，另一個ICE成員，后來被稱為apopain， CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly(ADP ribose)polymerase(PARP)，即聚(ADP核糖)聚合酶的裂解，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，因而認(rèn)為apopain執(zhí)行著與線蟲中的Ced3相同的功能。apopain被稱為是“死亡酶”，而PARP被認(rèn)為是 “死亡底物”。a

53、popainCPP32Yama是在1995年由兩個實(shí)驗(yàn)室分別同時報導(dǎo)，時間上只有兩周之差。Ced4的哺乳類同源物則遲遲未能發(fā)現(xiàn)，直到1997年，才被證明是Apaf 1(即一種細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivating factor)。而Ced 9的哺乳類對應(yīng)物則較早地被證明是BCL2，這一問題將在以后的部分述及。 現(xiàn)已確定至少存在11種caspase(表131)： 表131 caspase超家族成員及其相應(yīng)底物 名稱及其別名 底物 caspase I(1CE) ProILfi；pro-caspase 3，7 caspase 2(Nedd2ICHl) caspa

54、se 3(apopa,nCPP32Yama) PARP；SREBP；DFF；DNA caspase 7(1CELAP3Mch3CMH caspase 8(FLICEMACHMch5) caspase 9(1CELAP6Mch6) caspase 10(Mch4FLICE2) caspase 11(1CH3) Lamin A；keratin 18 PARP；pro-caspase 6；DFF PARP 這些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能還有caspase 4被認(rèn)為不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase 2、cas pase

55、 8、caspase 9和caspase 10參與細(xì)胞凋亡的起始；參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的則是 caspase 3、caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP、DFF45(DNAfragmentationfactor 45)，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解。而caspase 6的底物是laminA和keratin 18，它們的降解導(dǎo)致核纖層和細(xì)胞骨架的崩解。 2caspase的活化 細(xì)胞中合成的caspase以無活性的酶原狀態(tài)存在，以后經(jīng)活化方能執(zhí)行其功官旨。一般的蛋白酶活化時，只是將N端的肽段切除，而caspase的活化

56、則需在兩個亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割，結(jié)果產(chǎn)生了由兩個亞基組成的異二聚體，此即具有活性的酶。通常N端的肽在活化時也被除去，但對于caspase 7是否去除N端肽對活性無影響。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的起始者(caspase 2，8，9和 10)和執(zhí)行者(caspase 3，6和7)之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者。 凋亡起始者(caspase 2，8和10)的活化屬于同性活化(homo activation)。 caspase 8和10含有串聯(lián)重復(fù)的“死亡效應(yīng)子”結(jié)構(gòu)域(death effector domain， DED)，而caspase 2和9則含有不同但類似的caspase募集

57、結(jié)構(gòu)域(caspase re cruitmentdomainCARD)，這兩種結(jié)構(gòu)域是募集caspase 2，8和10所必需的。 caspase 8和10的活化要求下列成員的參與： (1)配體受體對，如FasLFas，TNFTNF受體。 (2)連接器或接頭蛋白FADD(fas-associateddeathdomainprotein)。 (3)修飾子蛋白：當(dāng)?shù)蛲鲂盘栍蒚NFTNF受體途徑傳導(dǎo)時，則要求修飾子蛋白TRADD(TNFreceptorassociateddeathdomainprotein)的參與。 (4)caspase 2，8和10的酶原。 當(dāng)Fas(CD95)或TNF受體為其天然配體FasL或TNF所啟動時，就形成了由Fas或TNF受體、連接器蛋白FADD和caspase 2，8和10的酶原組成的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death-inducing signaling complex，DISC)。受體蛋白通過直接與連接器蛋白FADD作用(有時需要修飾子蛋白的中介)而使caspase 2，8及10的酶原聚集在其附近，即細(xì)胞質(zhì)表面。當(dāng)酶原達(dá)到一定濃度時，它們就進(jìn)行同性活化(h