體內(nèi)藥物分析第七章 免疫分析法

1、1 1、熟悉免疫分析法的基礎知識、熟悉免疫分析法的基礎知識2 2、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法第一節(jié)：概第一節(jié)：概 述述基本原理基本原理基本條件基本條件方法分類方法分類 B B代表結(jié)合的標記抗原；代表結(jié)合的標記抗原；F F代表游離的標記抗原；代表游離的標記抗原；T T代表總的標記抗原。代表總的標記抗原。B/F-AgB/(B+F)100%-Ag抗原決定簇抗原決定簇(Cluster)的數(shù)的數(shù)量、性質(zhì)及立體構型。量、性質(zhì)及立體構型?？乖Y(jié)合段抗原結(jié)合段(fragment of antigen

2、 binding，IgFab)與相應抗原決定簇的結(jié)合能力與相應抗原決定簇的結(jié)合能力。 分子分子結(jié)構及立體構型相互吻合結(jié)構及立體構型相互吻合 標記抗原、未標記抗原和特異抗體標記抗原、未標記抗原和特異抗體免疫原性和抗原特異性免疫原性和抗原特異性 全抗原全抗原半抗原半抗原人工完全抗原人工完全抗原載體的本質(zhì)是蛋白質(zhì)動物血清蛋白最常用。載體的本質(zhì)是蛋白質(zhì)動物血清蛋白最常用。牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)、 兔血清白蛋白兔血清白蛋白(RSA)、人血清、人血清白蛋白白蛋白(HSA)鑒定的目的：測定人工抗原（藥物）與蛋鑒定的目的：測定人工抗原（藥物）與蛋白質(zhì)的結(jié)合比白質(zhì)的結(jié)合比光譜分析法光譜分析法化學分析

3、法化學分析法放射性同位素法放射性同位素法(1)(1)光譜分析法光譜分析法(2)(2)化學分析法化學分析法三硝基苯磺酸鈉或二硝基酚三硝基苯磺酸鈉或二硝基酚(3)(3)放射性同位素標記法放射性同位素標記法1特異抗體特異抗體(Specific Antibody)抗體：單克隆抗體和多克隆抗體抗體：單克隆抗體和多克隆抗體( (抗血清抗血清) )兩大類兩大類水劑：水劑：福氏完全佐劑福氏完全佐劑( (Freunds Complete Adjuvant) )福氏不完全佐劑福氏不完全佐劑 家兔家兔羊、豚鼠羊、豚鼠 無菌操作無菌操作羊羊家兔家兔(1)(1)滴度滴度(Titer)(Titer)效價或工作稀釋度效價或

4、工作稀釋度抗血清抗血清標記抗原法標記抗原法設放射性強度為設放射性強度為T T沉淀的放射性強度沉淀的放射性強度(B)(B)標記藥物的結(jié)合百分率標記藥物的結(jié)合百分率(B/T(B/T) )過量抗體結(jié)合率過量抗體結(jié)合率ABABC C點點D D點點1 1按標記物的種類分按標記物的種類分(1)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)(1)均相免疫分析均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)(2)非均相免疫分析非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)放射性

5、同位素標記抗原放射性同位素標記抗原F F與與B B的分離技術的分離技術放射免疫測定儀放射免疫測定儀標準曲線的制備與樣品測定步驟標準曲線的制備與樣品測定步驟方法評價方法評價應用舉例應用舉例特點：特點： 。mci g-1或或mciml-1 標標記抗原的純度決定記抗原的純度決定RIARIA的特異性的特異性而標記而標記抗原的放射性比度則決定抗原的放射性比度則決定RIARIA的靈敏度的靈敏度125I的特點是：的特點是：3 3H H的特點是：的特點是：1125I標記抗原的制備標記抗原的制備氧化法氧化法H H2 2O O2 2及氯胺及氯胺T T等，目前應用最多的是氯胺等，目前應用最多的是氯胺T T定位標記和

6、非定位標記定位標記和非定位標記非定位標記非定位標記定位標記定位標記1 1、沉淀法、沉淀法2 2、吸附法、吸附法3 3、固相法、固相法4 4、雙抗體法、雙抗體法( (一一) )沉淀法沉淀法硫酸銨、亞硫酸氫鈉、乙醇、異丙醇硫酸銨、亞硫酸氫鈉、乙醇、異丙醇優(yōu)點：快速、簡便、價廉優(yōu)點：快速、簡便、價廉缺點缺點 分離原理：分離原理：第二抗體第二抗體( (抗一抗體抗一抗體) )標記藥物標記藥物( (抗抗原原- -第一抗體第一抗體- -第二抗體結(jié)合物第二抗體結(jié)合物一類是一類是計數(shù)器計數(shù)器(-Counter)一類是液體閃爍測量儀一類是液體閃爍測量儀(Liquid Scintillation Counter)

7、作用：作用：條件：條件：烷基苯類，甲苯烷基苯類，甲苯、對二甲苯、對二甲苯、1 1，2 2，4 4三甲苯三甲苯醚類，醚類，1 1，4 4二氧六環(huán)二氧六環(huán)作用：作用：要求：要求：對聯(lián)三苯對聯(lián)三苯(TP)、2，5二苯基噁唑二苯基噁唑(PPO)、2苯基苯基5(4聯(lián)苯基聯(lián)苯基)1，3，4噁二噁二唑唑(PBD)計數(shù)瓶計數(shù)瓶( (或稱閃爍杯或稱閃爍杯) )：光電倍增管：光電倍增管： (T)(T)(T)(T)(B)(B)(F)(F)計數(shù)率計數(shù)率標準抗原標準抗原( (待測藥物標準品待測藥物標準品) )的濃度的濃度(B(B) )B B=(B=(BT)T)100100B B=(B=(BB B0 0) )100100

8、酶標記抗原酶標記抗原均相酶免疫分析均相酶免疫分析非均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法評價方法評價應用示例應用示例 ( (一一) )標記酶的選擇標記酶的選擇 特異性強特異性強，酶蛋白分子中應具有足夠的活性基團，以便能，酶蛋白分子中應具有足夠的活性基團，以便能與藥物結(jié)合。與藥物結(jié)合。 活性要高活性要高，即當?shù)孜餄舛鹊蜁r，確有較高的催化反應率。，即當?shù)孜餄舛鹊蜁r，確有較高的催化反應率。 酶的活性不易受樣品中其它成分影響，有較好的穩(wěn)定性。酶的活性不易受樣品中其它成分影響，有較好的穩(wěn)定性。 酶的酶的純度要高純度要高，且生物體液中應無標記酶、底物、抑制劑，且生物體液中應無標記酶、底物、抑制劑及其它干擾物質(zhì)

9、存在。及其它干擾物質(zhì)存在。 酶的酶的活性測量方法活性測量方法應簡單、靈敏、精密和快速。應簡單、靈敏、精密和快速。 酶的來源、純化、供應等應酶的來源、純化、供應等應方便、價廉方便、價廉。1 1辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP):(HRP):約有約有5050的的EIAEIA使用此酶。使用此酶。2 2堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶(AP):AP(AP):AP標記的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其標記的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其活性可用分光光度計或熒光計測量?；钚钥捎梅止夤舛扔嫽驘晒庥嫓y量。3 36-6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD): (G-6-PD): 通常用于均相通常用于均相EIAEIA。4 4- -

10、半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-Gal): (-Gal): 適用于均相適用于均相EIAEIA和非均相和非均相EIAEIA。5 5蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶(MDH): (MDH): 多用于尿樣的均相多用于尿樣的均相EIAEIA。無色、無毒能溶水；無色、無毒能溶水；化學性質(zhì)穩(wěn)定、不受光照的影響；化學性質(zhì)穩(wěn)定、不受光照的影響；轉(zhuǎn)化率高，在酶催化下可產(chǎn)生大量的有色物質(zhì)；轉(zhuǎn)化率高，在酶催化下可產(chǎn)生大量的有色物質(zhì)；顯色產(chǎn)物的量在一定范圍內(nèi)與酶的濃度或活性成顯色產(chǎn)物的量在一定范圍內(nèi)與酶的濃度或活性成正比；正比；應有終止酶反應的試劑。應有終止酶反應的試劑。1 1、辣根過氧化物酶的底物：鄰苯二胺（、辣根過氧化物酶的底物

11、：鄰苯二胺（OPDOPD）、）、5-5-氨基水氨基水楊酸（楊酸（5-ASA5-ASA）、四甲基聯(lián)苯胺及其硫酸鹽（）、四甲基聯(lián)苯胺及其硫酸鹽（TMB/TMBSTMB/TMBS）2 2、堿性磷酸酶底物：對硝基酚磷酸鹽溶液（、堿性磷酸酶底物：對硝基酚磷酸鹽溶液（p-NPPp-NPP）、）、4-4-甲基傘酮基甲基傘酮基- -磷酸鹽（磷酸鹽（4-MUP4-MUP）3 3、-D-半乳糖苷酶底物：鄰硝基苯半乳糖苷酶底物：鄰硝基苯-D-半乳糖吡喃苷半乳糖吡喃苷（o-NPG）、氯酚紅）、氯酚紅-D-半乳糖吡喃苷（半乳糖吡喃苷（CPRG）、試鹵）、試鹵靈靈-D-半乳糖吡喃苷（半乳糖吡喃苷（RG）4、葡萄糖氧化酶底

12、物：與辣根過氧化物酶底物相同、葡萄糖氧化酶底物：與辣根過氧化物酶底物相同（三）：酶標記藥物的制備（三）：酶標記藥物的制備 酶標藥物的酶標藥物的酶活性酶活性和和免疫活性免疫活性決定了酶免疫測決定了酶免疫測定法的靈敏度，因此酶標藥物成為定法的靈敏度，因此酶標藥物成為EIAEIA的關鍵。的關鍵。 選擇制備方法應注意以下原則：選擇制備方法應注意以下原則： （1 1）對酶和抗體的活性沒有影響）對酶和抗體的活性沒有影響 （2 2）生成的結(jié)合物是可溶的、穩(wěn)定的）生成的結(jié)合物是可溶的、穩(wěn)定的 （3 3）反應條件易控制）反應條件易控制 （4 4）制備方法簡單、能重現(xiàn)）制備方法簡單、能重現(xiàn)均相酶免疫分析均相酶免疫

13、分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)(Homogeneous Enzyme Immunoassay) 是指酶標抗原是指酶標抗原(Ag(AgE E) )同抗體同抗體(Ab)(Ab)結(jié)合后，所形成的結(jié)合后，所形成的酶標抗原一抗體結(jié)合物酶標抗原一抗體結(jié)合物(Ag(AgE EAb)Ab)可使酶的活性發(fā)生可使酶的活性發(fā)生改變改變( (增強或減弱增強或減弱) )，且不需將游離的酶標藥物，且不需將游離的酶標藥物(Ag(AgE E) )與結(jié)合的與結(jié)合的(Ag(AgE E一一Ab)Ab)酶標藥物分開，就可直接通過測酶標藥物分開，就可直接通過測定酶活性的變化，求出樣品含量的方法。定

14、酶活性的變化，求出樣品含量的方法。 酶增強酶增強( (放大放大) )免疫測定技術免疫測定技術(Enzyme Multiplied (Enzyme Multiplied ImnunoassayImnunoassay、techniquetechnique，EMIT)EMIT)，或稱，或稱“結(jié)合酶免結(jié)合酶免疫分析法疫分析法” EMITEMIT法通常使用法通常使用6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-(G-6-PD)PD)作標記酶，其原理是標記在待測藥物上的作標記酶，其原理是標記在待測藥物上的G-G-6-PD6-PD在輔酶在輔酶I I參與下能將底物參與下能將底物6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖

15、(G-(G-6-P)6-P)氧化成氧化成6-6-磷酸葡萄糖酸，而輔酶磷酸葡萄糖酸，而輔酶I I本身則被本身則被還原成還原型輔酶還原成還原型輔酶I(NADH)I(NADH)。 在該反應過程中，輔酶在該反應過程中，輔酶I I的結(jié)構發(fā)生了變化，的結(jié)構發(fā)生了變化，導致導致NADNAD與與NADHNADH的紫外吸收光譜形狀不同，還原的紫外吸收光譜形狀不同，還原型輔酶型輔酶I I在在340nm340nm處有最大吸收，而輔酶處有最大吸收，而輔酶I I在此波在此波長處則吸收甚小長處則吸收甚小。 未標記藥物未標記藥物(Ag)(Ag)抗體輔酶抗體輔酶I(NAD)I(NAD)底物底物(G-6-P)(G-6-P)抗原

16、抗原- -抗抗體結(jié)合物體結(jié)合物Ag-AbAg-Ab酶標藥物酶標藥物(Ag(AgE E) )。酶標藥物與未標記藥物互相競爭。酶標藥物與未標記藥物互相競爭有限量的抗體有限量的抗體(Ab)(Ab)，當這種競爭結(jié)合反應達到平衡之后，則有部分，當這種競爭結(jié)合反應達到平衡之后，則有部分酶標藥物與抗體相結(jié)合，從而使結(jié)合酶標藥物酶標藥物與抗體相結(jié)合，從而使結(jié)合酶標藥物(Ag(AgE E-Ab)-Ab)上的酶活性上的酶活性受到抑制，不能再同底物發(fā)生作用，而只有游離酶標藥物受到抑制，不能再同底物發(fā)生作用，而只有游離酶標藥物(AgE)(AgE)上上的酶才有活性，能作用于底物產(chǎn)生測定信號。如果樣品中待測藥物的酶才有活

17、性，能作用于底物產(chǎn)生測定信號。如果樣品中待測藥物的濃度越高，則競爭抑制的結(jié)果使游離酶標藥物的量增多，亦即酶的濃度越高，則競爭抑制的結(jié)果使游離酶標藥物的量增多，亦即酶的活性隨著待測藥物濃度的增加而增強，故有的活性隨著待測藥物濃度的增加而增強，故有“酶增強免疫技術酶增強免疫技術”之稱。之稱。 由于游離酶標藥物量的增多，能使更多的由于游離酶標藥物量的增多，能使更多的NADNAD參與氧化反應，參與氧化反應，生成更多的酶反應產(chǎn)物生成更多的酶反應產(chǎn)物NADHNADH。根據(jù)。根據(jù)NADHNADH在在340nm340nm處有紫外吸收的原處有紫外吸收的原理，便可用分光光度計測定吸收度，求出待測藥物的含量。理，便

18、可用分光光度計測定吸收度，求出待測藥物的含量。 非均相免疫分析：指酶標抗原非均相免疫分析：指酶標抗原(Ag(AgE E) )同抗體同抗體(Ab)(Ab)結(jié)合結(jié)合后，形成的酶標抗原后，形成的酶標抗原- -抗體結(jié)合物抗體結(jié)合物(Ag(AgE E-Ab)-Ab)與游離的酶與游離的酶標抗原標抗原(A(AE E) )一樣，其標記酶都具酶活性。因此必須將一樣，其標記酶都具酶活性。因此必須將AgAgE EAbAb與游離的與游離的AgAgE E分開后，再測定酶活性的變化，以分開后，再測定酶活性的變化，以求出待測藥物的含量。求出待測藥物的含量。 酶聯(lián)免疫吸附測定酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Im

19、munosorbent (Enzyme Linked Immunosorbent AssayAssay，ELISA)ELISA)：將一種反應物固定在固相載體上，當：將一種反應物固定在固相載體上，當另一種反應物與其結(jié)合后，可通過洗滌、離心等方法將另一種反應物與其結(jié)合后，可通過洗滌、離心等方法將液相中未結(jié)合的其它物質(zhì)傾去，然后測定結(jié)合在固相上液相中未結(jié)合的其它物質(zhì)傾去，然后測定結(jié)合在固相上的酶活性。的酶活性。 競爭法是將抗體直接吸附在有小孔的反應板孔內(nèi)，競爭法是將抗體直接吸附在有小孔的反應板孔內(nèi)，然后將待測樣品和定量的酶標藥物加入孔內(nèi)并混勻。然后將待測樣品和定量的酶標藥物加入孔內(nèi)并混勻。將反應板置

20、于適宜溫度下溫育一定時間，待酶標藥物將反應板置于適宜溫度下溫育一定時間，待酶標藥物與未標記藥物的競爭結(jié)合反應達到平衡后，洗去未同與未標記藥物的競爭結(jié)合反應達到平衡后，洗去未同抗體結(jié)合的游離藥物，而與抗體結(jié)合的酶標藥物和未抗體結(jié)合的游離藥物，而與抗體結(jié)合的酶標藥物和未標記藥物標記藥物( (固相載體沉淀部分固相載體沉淀部分) )則保留在孔內(nèi)。然后將則保留在孔內(nèi)。然后將底物加入孔內(nèi)，結(jié)合在抗體上的酶標藥物能催化底物，底物加入孔內(nèi)，結(jié)合在抗體上的酶標藥物能催化底物，發(fā)生水解、氧化或還原等化學反應，從而產(chǎn)生可測信發(fā)生水解、氧化或還原等化學反應，從而產(chǎn)生可測信號。測定時以空白試驗號。測定時以空白試驗( (

21、孔內(nèi)不加待測樣品孔內(nèi)不加待測樣品) )作參比。作參比。ElAElA優(yōu)點：優(yōu)點： 避免對人體的放射性傷害、環(huán)境的污染避免對人體的放射性傷害、環(huán)境的污染 酶標記物較穩(wěn)定，半衰期可超過酶標記物較穩(wěn)定，半衰期可超過1 1年。年。 酶免疫反應通常不需要酶免疫反應通常不需要 不需要溫育不需要溫育 不需將與抗體結(jié)合的標記藥物同游離的標記藥物分開，不需將與抗體結(jié)合的標記藥物同游離的標記藥物分開，便可直接測定。便可直接測定。 產(chǎn)生的信號用普通的可見一紫外分光光度計就可測定，產(chǎn)生的信號用普通的可見一紫外分光光度計就可測定，不需昂貴的儀器沒備。不需昂貴的儀器沒備。缺點：缺點： 標記酶不像同位素標記物、熒光標記物那樣

22、能直接標記酶不像同位素標記物、熒光標記物那樣能直接產(chǎn)生信號，而必須要何其它試劑，如酶底物、輔酶的產(chǎn)生信號，而必須要何其它試劑，如酶底物、輔酶的參與，才能完成酶反應，引起吸收光譜等變化后方可參與，才能完成酶反應，引起吸收光譜等變化后方可進行測定。進行測定。血樣中利多卡因的測定血樣中利多卡因的測定1 1藥物與試劑藥物與試劑試劑試劑A A：內(nèi)含抗體：內(nèi)含抗體( (由利多卡因與大分子載體結(jié)合成人由利多卡因與大分子載體結(jié)合成人工抗原后免疫綿羊而得工抗原后免疫綿羊而得) )、底物、底物(G-6-P)(G-6-P)及輔酶及輔酶I(NAD)I(NAD)。保存劑（保存劑（0.05mol/L tris-HCl0.

23、05mol/L tris-HCl緩沖液）。緩沖液）。試劑試劑B B：內(nèi)含酶標藥物：內(nèi)含酶標藥物( (用用G-6-PDG-6-PD標記的利多卡因標記的利多卡因) )及保及保存劑存劑(pH 7.9)(pH 7.9)。其它試劑：其它試劑：標準品和質(zhì)控對照品。標準品和質(zhì)控對照品。0.055mol/L 0.055mol/L tris-HCltris-HCl緩沖液緩沖液2 2樣品測定樣品測定 精密量取血漿或血清樣品精密量取血漿或血清樣品50l50l，于，于2ml2ml小燒杯中，小燒杯中，加入加入TBTB緩沖液緩沖液250l250l，混勻后，吸出，混勻后，吸出5l5l置另一置另一2ml2ml小燒杯中，再加入

24、小燒杯中，再加入TBTB緩沖液緩沖液250l250l，充分混勻。然后，充分混勻。然后加入試劑加入試劑A50lA50l及及TBTB緩沖液緩沖液250l250l，再加入試劑，再加入試劑B B 50l50l及及TBTB緩沖液緩沖液250l250l，混勻，立即將反應液吸入，混勻，立即將反應液吸入分光光度計的樣品池中，在分光光度計的樣品池中，在340nm340nm波長處測吸收度。波長處測吸收度。根據(jù)標準曲線，求出血樣中利多卡因的濃度。根據(jù)標準曲線，求出血樣中利多卡因的濃度。3 3標準曲線的制備標準曲線的制備 將藥盒提供的將藥盒提供的6 6個裝有不同量的利多卡因標準品個裝有不同量的利多卡因標準品小瓶取出，在每瓶中加入小瓶取出，在每瓶中加入1.0ml1.0ml蒸餾水，即得到濃度蒸餾水，即得到濃度分別為分別為0 0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、5.05.0及及12.0mg/L12.0mg/L的標準品的標準品溶液。然后分別吸取不同濃度的標準品溶