項目三青霉素的生產(chǎn) 第四組

1、青霉素的生產(chǎn) 第四組 組員:張南 程敏 李萍 張潔 武文先 姜彬 郭業(yè)新 目錄 1.霉菌的識別與青霉素菌種活化、擴大培養(yǎng) 2.青霉素發(fā)酵與過程監(jiān)控 3.青霉素發(fā)酵產(chǎn)物初步分離 4.青霉素發(fā)酵液效價測定 青霉素 青霉素是抗菌素的一種，是指分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是由青霉菌中提煉出的抗生素。 霉菌的識別 霉菌形成分枝菌絲的真菌的統(tǒng)稱。菌落質(zhì)地一般比放線菌疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或緊或松的蛛網(wǎng)狀、絨毛狀或棉絮狀；菌落與培養(yǎng)基的連接緊密，不易挑??；菌落正反面的顏色和邊緣與中心的顏色常不一致。專性寄生霉菌如銹菌、霜霉菌和白粉菌等產(chǎn)生的菌絲變態(tài)，

2、它們是從菌絲上產(chǎn)生出來的旁枝，侵入細胞內(nèi)分化成根狀、指狀、球狀和佛手狀等青霉菌菌種活化、擴大培養(yǎng) 菌種的擴大培養(yǎng)就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過扁瓶或藥瓶和種子罐，逐級擴大培養(yǎng)后達到一定的數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種子。 種子的制備過程 種子制備的過程大致可分為實驗室種子制備階段和生產(chǎn)車間種子制備階段。實驗室種子制備階段是指瓊脂斜面至固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)（如茄子瓶斜面培養(yǎng)）或液體搖瓶培養(yǎng)；生產(chǎn)車間種子制備階段是種子罐擴大培養(yǎng)。 實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式：固體孢子培養(yǎng)法和液體種子培養(yǎng)法。對于產(chǎn)孢子能力

3、強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌；對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。 霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基，培養(yǎng)的溫度一般為2528C，培養(yǎng)時間一般為414天。 液體種子制備好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。試管三角瓶搖床種子罐 。青霉菌，需要三級發(fā)酵，即孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）二級種子罐（27C,1

4、024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐。 發(fā)酵工藝過程（1）生產(chǎn)孢子的制備將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化。最適生長溫度在2526 ，培養(yǎng)68天，得單菌落，再傳斜面，培養(yǎng)7天，得斜面孢子。 移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。 （2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富的易利用的碳源和有機氮源。青霉素采用三級發(fā)酵 一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米漿，碳酸鈣，

5、玉米油，消沫劑等。通無菌空氣，空氣流量1：3（體積比）；充分攪拌300350r/min；4050小時；pH自然，溫度271。二級發(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，251；014h。 三級發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀熧|(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，CaCO3等。接種量為1215%。青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，偏大，通氣比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率攪拌，100 m3的發(fā)酵罐攪拌功率在200300 Kw，罐壓控制0.040.05 MPa，于2526 下培養(yǎng)

6、，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h為26，以后24。 發(fā)酵過程控制 反復(fù)分批式發(fā)酵，100m3發(fā)酵罐，裝料80m3，帶放610次，間隔24h。帶放量10，發(fā)酵時間204h。發(fā)酵過程需連續(xù)流加補入葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關(guān)鍵的控制指標，不同時期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，讓培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長，而在40h后，靠低速連續(xù)補加葡萄糖和氮源等，使菌半饑餓，延長青霉素的合成期，大大提高了產(chǎn)量。所需營養(yǎng)物限量的補加常用來控制營養(yǎng)缺陷型突變菌種，使代謝產(chǎn)物積累到最大。 青霉素發(fā)酵產(chǎn)物初步分離 1.預(yù)處理及過濾 發(fā)酵

7、液放罐后需冷卻至10后，經(jīng)鼓式真空過濾機過濾。從鼓式真空過濾機得到青霉素濾液在pH6.2-7.2，蛋白質(zhì)含量一般在0.05-0.2。這些蛋白質(zhì)的存在對后面的提取有很大的影響，必須加以除去。除去蛋白質(zhì)通常采用10的硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.05（質(zhì)量濃度）左右絮凝劑的方法，同時再加入0.7硅藻土作助濾劑，再通過板框過濾機過濾，經(jīng)過第二次過濾的濾液一般澄清透明，可進行萃取。 2.提取 結(jié)合青霉素在各種pH下的穩(wěn)定性，一般從發(fā)酵液中提取到醋酸丁酯時，pH選擇在1.8-2.2范圍內(nèi)，從丁酯相反萃取到水相時，pH選擇在6.8-7.4范圍內(nèi)對提取有利，生產(chǎn)上一般將發(fā)酵濾液酸化至pH等于2.0，加1/3體積的醋酸丁酯（簡稱BA）混合后以臥式離心機分離的一次BA萃取液，然后以NaHCO3在pH6.8-7.4條件下將青霉素從BA中萃取到緩沖液中，在用10H2SO4調(diào)節(jié)pH等于2.0，將青霉素從緩沖液中再次轉(zhuǎn)入BA中，得第二次BA萃取液。 3.脫色 在二次BA萃取液中加入活性炭150-350/10億單位，進行脫色，石棉過濾