提取RNA原理及其常遇到的問(wèn)題

1、RNA提取一般步驟總結(jié)- E/ a% A-RNA提取原理：通過(guò)變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過(guò)沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無(wú)處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。- M: d9 I3 8 YRNA提取的一般步驟4 e$ s" p+ 6 l6 m* b所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制酶活性。RNA的提

2、取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。0 i2 O) 7 e1 S& P4 K8 l$ ?4 |實(shí)驗(yàn)步驟：: ?1 i1 U& % N% A! z     破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA。' Q8 E+ S9 a+ v1 m7 i+ / S  V1、 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP

3、-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入-ME可以抑制RNA酶活性。. |# j$ w) s- q5 r5 W2、 分離RNA一般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過(guò)此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開(kāi)。8 l2 T) " |" L. a# n3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。; o: T, R7 d7 E4 ?& e. 5 d6 u4、 洗滌RNA使用70乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過(guò)于干燥，否則不易溶解。8 f+ V4 g# V% ?0 c7 g* u5

4、、 融解RNA一般使用TE。5 , O6 L7 w) C2 L- ?) 5 r6、 保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺

5、中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。3 f: E# T6 C  o9 j9 ' G* i% g5   氯化鋰法提取總RNA：( x; L/ z+ 9 R/ _4 j1        本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。試驗(yàn)試劑： 1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126

6、g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過(guò)濾滅菌】: _* I/ t  M+ w8 a# - K' N+ c/ a3 C2、 懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】% c5 L+ z& ?2 b! y3 z+   t試驗(yàn)步驟：, E0 y8 , ?" W1、 對(duì)于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入510ml氯化鋰尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對(duì)于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppe

7、ndof管中。2 Y  x: p+ S& t" S- A' 2、 勻槳液在04放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘。  L0 O. B7 K' x; g- N& - R3、 取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復(fù)步驟2。- k# S& m' j3 ) ?3 q( q4、 沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置1530分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘。% K+ / m/ a3 F8 f* 5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙

8、酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20放置1小時(shí)，5000g離心。) h9 y, V4 a4 V0 i8 q: K+ k4 X( c6、 70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。' % h, j/ D! z; W  ( R# 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于70保存。9 K2 J+ j3 M1 植物RNA提取過(guò)程中難點(diǎn)的相應(yīng)對(duì)策! e-酚類化合物的干擾及對(duì)策：$ h6 Y2 j0 c* D- k  l許多植物組織特別是植物的果實(shí)（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹(shù)木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)而增加。因而從幼嫩的植物

9、材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來(lái)，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無(wú)相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，

10、然后再將其與RNA分開(kāi)。6 g1 R7 c) ( f& U( k% X防止酚類化合物被氧化的方法：9 r3 W. Z3 J) T6 h5 a1、 還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來(lái)防止酚類物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過(guò)夜沉淀RNA時(shí)加入(-巰基乙醇（終濃度1）可以防止在此過(guò)程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。# A& B5 x4 Q. V) n(

11、2、 螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CON基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會(huì)迅速降低11。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無(wú)法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。& l4 k- j8 ( * B7 M, R- _4

12、V# h3、 Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以Lpez-Gmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過(guò)高（0.2M）則會(huì)影響RNA的回收率。9 O  W( V+ A' P* Y  e: - E9 O' B2 F$ M4、 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)

13、會(huì)，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會(huì)更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。. g2 D# o& D  |; Z) z0 S; A/ 5、 丙酮法：Schneiderbauer等用-70的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹(shù)、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。% i2 v1 Y4 _; T/ f' 酚類化合物的去除 ：通過(guò)Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過(guò)離心去除掉，

14、或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50）來(lái)沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無(wú)需再用NaBH4來(lái)處理。! w- P$ 6 P! W. i9 o1 i多糖的干擾及對(duì)策：+   t; r- l8 Q/ v- z3 ?' b: |) |多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問(wèn)題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開(kāi)。在去除多糖的同時(shí)R

15、NA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過(guò)SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過(guò)LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過(guò)這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來(lái)解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問(wèn)題。  l$ B1 U' j

16、0; W用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無(wú)水乙醇至終濃度1030，可以使多糖沉淀下來(lái)，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30乙醇來(lái)沉淀多糖的，進(jìn)一步純化了RNA樣品。- h3 6 W3 ) R& L8 F另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液

17、中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lpez-Gmez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無(wú)水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都無(wú)效，只有兩者結(jié)合使用效果最佳。& X1 r4 _( _1 B. BFang等認(rèn)

18、為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹(shù)RNA時(shí)，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過(guò)氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來(lái)沉淀去除多糖。- I) r& z9 _7 g7 c9 b+ A. q蛋白雜質(zhì)的影響及對(duì)策：7 v+ w) p# Y& O蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物

19、材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來(lái)降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來(lái)而能溶于70高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。+ N9 a+ 2 R8 R- Q6 ) j次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

20、及對(duì)策：  n  U* N1 F- F. S+ L2 Z* L& X1 x從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來(lái)而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級(jí)產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒(méi)有什么特殊的方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹(shù)種子、成熟松樹(shù)針葉等植物組織的RNA。+ V" j- f

21、0; Z& " E由于植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對(duì)于其它生物材料來(lái)說(shuō)要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會(huì)有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來(lái)源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對(duì)于某一植物或其組織來(lái)說(shuō)，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過(guò)摸索和實(shí)踐才能確立。7 b# V* i! z$ 5 E隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說(shuō)，在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過(guò)程中還會(huì)出

22、現(xiàn)新的難點(diǎn)，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)工作者們一定會(huì)迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法1 d多酚類植物的RNA提?。? F2 a+ f2 B+ i   蘋果棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來(lái)。這個(gè)方法是驗(yàn)證過(guò)有效的,提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。- I# h8 c& N9 i! ?( 實(shí)驗(yàn)試劑：- U2 t+ J" $ |5 H) V4 b) l7 提取buffer 200ml：NaCl 1.1688g 100mM  Tris 2.42

23、28g 10mM (tris-HCl 8.0)   EDTA 5.8450g 10mM   SDS 2.0000g 1%  NaOH調(diào)至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.7 Y( / X3 0 r; a  a% k8 p4 A試驗(yàn)步驟：/ Q* 9 ' O2 P3 c& Z5 e  v1、 1.5ml離心管用液N2冷凍吼加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min。  v8

24、 C# N  r9 " F7 Y2、 4度12000rpm離心15min, 上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次。$ I/ G( ?" p2 d6 L% Q; Y3、 取600ul異丙醇,-20度沉淀20min.  s# 6 S- A3 i( d( b( t8 w4、 12000rpm離心10min。! y& X+ _3 f" j; k8 N/ a5、 沉淀用70度乙醇洗。2 R' ?+ j& R- V& R7 E6、 8000rpm 5min。; J' _* J. U6 C/ - R)

25、 g7、 沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。+ e2 , D5 n2 M* j0 X& r& H  P# w5 l- m銀杏等木本裸子植物的RNA提取方法：5 c6 d  & t) 銀杏、香機(jī)等木本裸子植物，酚類和多糖等次生物質(zhì)含量較多，對(duì)RNA的分離和純化有很大干擾，嚴(yán)重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，給相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行帶來(lái)阻礙。目前，RNA的提取方法很多，采取常規(guī)的Trizol試劑盒、SDS等方法不能提取銀杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA質(zhì)量也較差，降解也十分嚴(yán)重。對(duì)其提取步驟

26、進(jìn)行改進(jìn)，得到質(zhì)量較高的銀杏RNA樣品。, X7 U7 B5 y/ m9 R, G: h試驗(yàn)試劑：1 k6 c- 1 u1 l& h5 R2 y1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用濃鹽酸調(diào)至Ph8 .0，定容至lOO mL.用滅菌的DEPC水溶解。1 v9 Y8 N2 : z3 Q. A& x2 N4 r2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O加入80m L水中，攪拌溶解，用NaOH調(diào)pH至8.0，定容至100mL。0 " U' I3 e1 f' g3、 10 mol/LLiCL

27、: 42.4 gLiCL, 100mL水溶解即可。- l& b  c2 d* * u9 s4、 提取緩沖液(DEPC水處理):2% CTAB（蛋白質(zhì)變性劑）.2% PVPK 30（去除多酚類物質(zhì)）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金屬鰲合劑）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB, 2 g PVP, 10 mL 1 mol/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到100mL。; a* & r" i. W+ k9 z' V5、 亞精胺(提取時(shí)加

28、少量)（RNA酶抑制劑）- V* H) Y5 |& ?, u* q6、 4%0一疏基乙醇(提取時(shí)加)（去除多酚類物質(zhì)）8 O. C3 o, z6 t& 2 u7、 氯仿異戊醇(24: 1)（抽提蛋白質(zhì)）! m/ w: |# ( h" P7 U7 l8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA）# u0 H1 P% i! g1 Q5 m# G: 9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL  0. 5%SDS  1m MEDTA(PH8.0)  10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL,

29、 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0,定容至50 mL。5 z5 d( 2 B1 q$ U( g, d5 9 U試驗(yàn)準(zhǔn)備：- W" W1 d% x$ f5 1、 研缽和玻璃器皿用錫紙包好，200以上向溫烘烤2小時(shí)以上，或180*C 高溫烘烤4小時(shí)。; w1 n" q( G- F" L9 B2、 塑料制品(槍頭和離心管)最好用新的，并且用報(bào)紙包好，121'C高壓滅菌，滅菌40 min，或連續(xù)兩次121'C高壓滅菌，每次滅菌20 min，然后用烘箱烘千。  

30、X/ b% # 1 b/ ; s3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ濃度為0.1%, 37過(guò)夜，1211C高壓滅菌40 min.(其中Tris因?yàn)椴荒苡肈EPC處理，所以Tris用DEPC處理的水溶液滅菌后配制。)- e; ! t; U2 R' D  G" w試驗(yàn)步驟：" W; E" Y* X8 i2 T【根據(jù)文獻(xiàn)(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改進(jìn)?！?#160; M" z5 S6 a) a, I6 m$ Q3 x1、 將4mL提取液加入到lOmL離心管c卜650C水域加熱

31、。+ d% F! y# A! $ q1 F3 x. F; X2、 用液氮冷卻研缽，在研缽中加入少量的抗氧化劑PVP，取1g低溫冷凍的銀杏葉片，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過(guò)程中葉片融化，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的提取緩沖液中，用手搖功混勻。6 o7 H! z  V+ D1 C/ E% x3、 65，水域1 min后冷卻至室溫。( 8 / * Y# . e% 4、 加入等體積(4mL)的氯仿:異戊X17 (2=L: 1)，混勻，10000rpm, 40C，離心10 min。& V# j. c+ S/ K/ a$ N7 5、 小心吸取上清液，加入等體積(4

32、mL)的仿:異戊醇(24: 1),混勻，10000rpm, 40C,離心10 min。+ k3 & o1 H0 N6、 吸取上清液，加1/4體積的IOMLiCL,混合，4沉淀過(guò)夜，然后10000rpm離心20 min。2 L. j7 q- f5 e! s/ s7、 用槍吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)到1.5m L離心管.加等體積氯仿:異戊醇混勻，10000rpm, 40C，離心10 min。4 6 ) y8 M$ * s# k0 M8 G8、 離心吸取取上清液，加兩倍體積的無(wú)水乙醉，-70沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。& 9 l7 X1 x8 t6

33、 u9、 12000rpm, 40C,離心20 min，去上請(qǐng)用70%的乙醇洗兩次，吹干沉淀。' ' p: r4 9 T: S. D10、 用40 u LDEPC處理的水溶解沉淀，得到RNA樣品。( d- o$ P9 Y' O8 K11、 除用于電泳和紫外檢測(cè)外，其余RNA-70冰箱保存?zhèn)溆谩? Z  p" z, K; 7 T( 3 ?( V+ X& |6 Y) T9 m9 R改良Krapp提取法：) b: 8 0 _9 d& Q6 T- . m# T, Y試驗(yàn)試劑：- O7 J. G7 L4 j' b) ?3 R1

34、、 RNA抽提掖：母液：4mol 異硫氰酸胍 20mmol EDTA  20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME貯存在4條件下備用。! # k, v1 s# o6 w1 Y2、 RNA重懸液：2mol LiCl  10mmol NaAc調(diào)整終體積為250ml，pH 5.2，滅菌后貯存在4條件下備用。6 $ A3 a: ( A5 ; I/ u試驗(yàn)步驟：& 4 j: J9 h0 h% S1、 取新鮮植物材料0.51g，冷凍干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混勻。9

35、k% P1 |, |, g! e6 Q2、 4條件下8000rpm離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4條件下8000rpm離心10min。) V5 W; n# X  O9 b# c; s; X3、 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混勻后，在4條件下8000rpm離心10min.）。" T7 g  u: K4 D  J% * d6 S, P% o! |4、 小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2

36、vol冷無(wú)水乙醇，在-80條件下沉淀2小時(shí)。5 / s3 W; E1 w' M6 c5、 在4條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉淀重懸于RNA重懸液中，置于4條件下1小時(shí)。. T" u0 G$ o* E6、 4條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉淀溶于適當(dāng)體積的DEOC處理水中。檢測(cè)后分裝，置于-70條件下保存。一些特殊組織的RNA提取) H- G3 B8 O7 $ e) F' s1、 纖維組織：& n. x! M; e( O' a心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量

37、的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時(shí)適當(dāng)減少溶解RNA的溶液體積。9 t3 |5 q' t9 T  m) 4 K$ d% S2、 蛋白/脂肪含量高的組織：  X* j& c$ e; $ S% y動(dòng)物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來(lái)提取此類樣品中的RNA。在該提取過(guò)程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。使

38、用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時(shí)，使用氯仿抽提后會(huì)分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機(jī)相四層，應(yīng)用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。; L6 u; z* " i6 p3、 核酸/RNase含量高的組織：& - p- 7 F6 r2 p( ( B脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩?氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問(wèn)題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。4 z/ u

39、& G! m3 R8 4、 植物組織和真菌組織：/ W/ _* O/ L1 g% E植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使 RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對(duì)植物或者真菌材料進(jìn)行碾磨。如果降解問(wèn)題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過(guò)程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來(lái)去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。RNA純化& h- ?  H* J7 M&a

40、mp; L& B試驗(yàn)步驟：& 7 U" B' S( d, d0 g/ M用酚氯仿抽提：這兩種有機(jī)溶劑合用，比單獨(dú)用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚，先加入酚后加入氯仿。& X+ e0 X3 r7 D& S, j9 U; s1、 核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿（如有20ul樣品，則加入10ul酚10ul氯仿）。$ U0 S' & b( " 2、 旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀。& T3 W3 M! x2 * a5 M4 D2 6 k3、 12000×g室溫離心

41、15秒。6 7 f: o3 d: : F, z4 2 8 g4、 水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機(jī)相。! C* z+ - L; q: u; T" B0 G5、 重復(fù)步驟14步操作，直至兩相界面上見(jiàn)不到蛋白質(zhì)為止4 d, + R  M2 j$ k( Y/ x6、 按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。' M' d2 t8 h  O7、 28度，離心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）。$ n+ X0 I1 r/ b, F8 V" t8、 上清中

42、加入等量的異丙醇(一般是0.5:1),顛倒5次（用200ul槍加小心），室溫靜置10min。( l  L, t0 b' 9、  2-8度離心，10500rmp/min,10min,棄上清。; I; b. D9 h0 |10、 RNA洗滌：75酒精（這次用的100。未影響）1ml沉淀，輕輕彈其底部（直接放入70度冰箱可以長(zhǎng)期保存，靜置幾秒鐘。7 b1 e+ y6 f; b# J8 T) M11、 28度離心，8500rpm/min,5min ,棄上清。) c9 k& i+ p" L12、 取出濾紙，將EP管敞開(kāi)放在濾紙上，管口向酒

43、精燈（不要完全干燥，不好溶解）。2 C4 K3 U# H9 R0 m, 4 ?13、 ?DEPC水溶解（30ul,可變），分裝,2ul電泳，2ul比色，其余5ul分裝至于手套中凍于20度中。植物組織mRNA提取) u0 : |8 A# U6 B% Y由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。8 ?6 M- k; m$ 4 D實(shí)驗(yàn)步驟：* H2 s. U/ o' b* n. A1

44、、 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 ! n" h) Y5 U1 y1 C+ f2、 將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 0 X. H2 a% w9 _; B3、 用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。, l% |* H3 " y3 o% Z0 n1 p8 s+ Y  W% e( z4、 將提取的RNA液于65溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣

45、，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。$ g/ 2 o  n7 e& j4 J" A5、 測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。* A' g7 a0 l( Z( k# Y6、 測(cè)定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。* O7 a) u0 F6 J9 D' s+ E7、 加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -2030分鐘。) h; s8 _5 W2 V&

46、#39; t6 E/ p) m8、 4下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4下12000g離心5分鐘。* 4 w5 X7 Z& a2 G4 9、 小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。/ F  E9 r) f) B10、 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70）。( B$ + H1 e, d$ x. Z注意事項(xiàng)：9 K' L8 4 e, w& C7 L. i  z1、 mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。* a  

47、;Z1 E, z3 |9 z% m+ m: + d+ O+ x2、 oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。mRNA純化& ?5 H8 U3 G5 K6 MmRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mR

48、NA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。( O- Y. H  D1 e: T/ W2 t寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA：/ C2 / h$ l8 ?3 i: * H, h試劑試劑：) w& l! i/ h! y8 p& L1、 3M醋酸鈉（pH 5.2）3 - $ r0 j% g2 s+ c2、 0.1M NaOH# J0 a7 - E) T3、 1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HC

49、l(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65時(shí)，加入經(jīng)65溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。/ S  z( V% a4 l* x4、 洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS! _4 q; M. u6 G* D5 ' t4 X/ I5、 無(wú)水乙醇、70%乙醇, r% _4 ) F# Z- D7 P6、 DEPC1 z! S3 x, d8 z8 F試驗(yàn)步驟：0 w! q3 f; O& M* G8 O

50、- E1 y1、 將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。9 l6 p9 l) Z% X7 X& 2、 用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈?，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。# f- i9 A- O: A' S$ e7 2 U- v3、 使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。3 N4 L4 k! f, _- C4 o/ C" e% J* g4、 將RNA溶解于DEPC H2O中，在65中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立

51、即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。) , _, A* o* x, L& 8 m5、 將所有流出液于65加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。" g# C" r$ |" n' M6、 用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測(cè)定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無(wú)Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無(wú)吸收。' F4 m2 z  _' a. $ z7

52、、 用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。) D% B2 D' p4 H# 8、 OD260測(cè)定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20放置30min。) L. y& s! $ l( ?( t# H9、 4離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。注意：此時(shí)Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。; Z) 2 . m

53、; q# D# X! i  G" h10、 用適量的DEPC H2O溶解RNA。" U- W1 x2 p. Q) M, t2 V$ q# n" y0 q注意事項(xiàng)：  |# W$ # Z, N& k! R% : C6 w1、 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須防止Rnase的污染。, L$ t5 h1 t7 V! A1 2、 步驟4中將RNA溶液置65中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另

54、一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。' c' A' R" F5 I1 S3、 十二烷基肌氨酸鈉鹽在18以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18最好用LiCl替代NaCl。8 D: 5 h# b( r( T" g4、 寡聚（dT）-纖維素柱可在4貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。3 U5 L$ D! q. e. ; 9 K! P5 j+ f- H5、 一般而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的

55、1%-2%。RNA提取注意事項(xiàng)一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。+ P- Y6 d* b$ y  r  s1、 在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒(méi)有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。2 " X( G+ r5 w4 2、 有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到5060，并

56、將反應(yīng)時(shí)間縮短到1525min，但酶用量必須提高1020倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。/ K* t6 Y8 o, W8 T3、 許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。( Y6 P8 - 6 K( g! r0 J4 J$ z4、 許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會(huì)遇到多糖

57、的污染問(wèn)題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。6 |!   R6 P  e     克服多糖污染可采用以下一些辦法- s1 t4 C- L* W$ * 1) CTAB多次抽提。+ v5 s8 t1 " H8 X2) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。! A  f9 . y% M# 3) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0

58、.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。  D# H4 z* Y# z4 , r- n" f8 v5、 在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會(huì)殘留酚，而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。+ R$ 3 . 3 D$ E7 c%

59、n9 k6、 在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。% d4 h8 * y7 a: _  p4 Q7、 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。% u" d8 h. G* A8、 在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，70下>30min;20過(guò)夜將有助于增加核酸的沉淀量。( M% P% Q" G* c9、 在核酸提取過(guò)程中有

60、機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。: y/ # t& u1 K8 b* P+ o3 X10、 核酸提取后可通過(guò)PCR 、RTPCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫(kù)、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫(kù)扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫(kù)中篩選出完整基因。3 N8 L; 8 V) O7 T5 2 J5 d11、 在抽提過(guò)程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜

61、質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。防止RNA酶污染的措施：4 O7 m2 N- S% S: L1、 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。/ G  u. r2 C6 + L, b/ |4 M% F" d2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。/ # 3、 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。; : y#

62、S% a. a# r6 r6 4、 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過(guò)濾除菌。7 v6 K7 O) E6 F5 E2 5、  操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。( N0 y0 _' r, V8 : H. y* E6 e6、 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。% _( 1 4 W$ B7 a: c7、 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理8 L9   s. X5 $ |8 i& v; Q8 h8、 加樣原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。6 E0 K8 u2 R$ M% V9、 普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)