核醫(yī)學(xué)-第五章--體外分析技術(shù)

1、核醫(yī)學(xué)第五章 體外分析技術(shù)l1 綜述3l2 放射免疫分析 6l3 放射免疫分析法的建立和基本試劑14l4 分離方法和數(shù)據(jù)處理25l5 質(zhì)量控制29l6 免疫放射分析法35l7 非放射性免疫標(biāo)記分析技術(shù)42l8 放免檢測(cè)的臨床應(yīng)用46 體外分析技術(shù)l 核醫(yī)學(xué)體外分析技術(shù)主要是利用放射免疫分析技術(shù)或其派生的相關(guān)技術(shù)，以特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，在體外進(jìn)行，對(duì)機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行的分析測(cè)定。l美國學(xué)者Berson和Yalowl1953-1956 使用放射性碘標(biāo)記胰島素l1958 創(chuàng)建放射免疫分析法l優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，成本低 l1977 兩人共同獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)l 以放射

2、免疫分析法為基礎(chǔ)發(fā)展出三大類分析方法l1 競(jìng)爭(zhēng)性受體（蛋白）結(jié)合分析法,用體內(nèi)天然存在的特異結(jié)合體代替抗原-抗體。l2 熒光，酶，化學(xué)發(fā)光，稀土元素等標(biāo) 記的免疫分析法l3 放射性非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析法放射免疫分析放射免疫分析 （radioimmunoassay,RIA)radioimmunoassay,RIA)l三個(gè)名詞：三個(gè)名詞：l1 非標(biāo)記抗原（待測(cè)物）l2 標(biāo)記抗原l3 抗體l放射免疫分析（RIA）的基本原理：l 定量的放射性核素標(biāo)記的抗原(radionuclide labeled antigen)和未知量的非標(biāo)記抗原(unlabeled antigen)（標(biāo)準(zhǔn)抗原或被測(cè)抗原）同時(shí)與限量的特

3、異性抗體(specific antibody)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)(competitive immune binding reaction)由于標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合量與非標(biāo)記抗原的含量之間，存在競(jìng)爭(zhēng)抑制的函數(shù)關(guān)系，可依據(jù)反映這一函數(shù)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測(cè)抗原的含量。lRIA的必備條件：l1.標(biāo)記的抗原 2.特異性抗體 3.標(biāo)準(zhǔn)品 4.分離技術(shù) 5.放射性測(cè)量?jī)x反應(yīng)式l Ag + Ab（限量） Ag-Ab + Agl + l *Ag（限量）l l *Ag + *Ag-Ab l式中：*Ag為標(biāo)記抗原，Ag為非標(biāo)記抗原，Ab為特異性抗體，*Ag-Ab為標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，Ag-Ab為非標(biāo)記抗原抗

4、體復(fù)合物。l 由于*Ag與Ag的免疫活性完全相同，對(duì)Ab具有同樣的親和力，當(dāng)*Ag和Ab為恒定量，Ag和*Ag的總量大于Ab上的有效結(jié)合點(diǎn)時(shí)，*Ag-Ab的形成是隨著Ag量的增加而減少，剩下來的未結(jié)合或游離的*Ag則隨著Ag量的增加而增加，稱為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)(competitive binding reaction)，因此測(cè)定*Ag-Ab或*Ag即可推出被測(cè)的Ag量。如下圖:l 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制一系列已知梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測(cè)定*Ag-Ab的放射性B或游離*Ag的放射性F，計(jì)算出結(jié)合率B% B /（

5、B+F） 100%或其他指標(biāo)，如B/B0%（B0表示不含非標(biāo)記抗原管的最大結(jié)合放射性）。以B%或B/B0%為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫座標(biāo)，繪制曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard curve)。RIARIA法的建立和基本試劑法的建立和基本試劑l （一）特異性抗體要求l1 親和力：抗原和抗體的結(jié)合能力l2 特異性：抗體識(shí)別抗原的能力l3 滴度：抗體實(shí)際應(yīng)用時(shí)的稀釋倍數(shù)（二）標(biāo)記抗原要求：一般用125I來標(biāo)記l1 不改變標(biāo)記抗原的生物活性l2 標(biāo)記物半衰期不能太短，125I半衰期60天l3 比活度和放化純度要高，以保證靈敏度l（三）標(biāo)準(zhǔn)品要求l1 標(biāo)準(zhǔn)品(standard)與被測(cè)物應(yīng)屬同一種物質(zhì)l

6、2 在與抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，應(yīng)與被測(cè)物具有相等的活性和親和力l3 高度純化l4 定量精確操作過程操作過程 1 平衡加樣法：減短操作時(shí)間的分析方法標(biāo)準(zhǔn)(待測(cè))Ag+Ab+標(biāo)記Ag溫育分離 測(cè)定數(shù)據(jù)處理 2 順序加樣法：提高靈敏度的分析方法標(biāo)準(zhǔn)(待測(cè))Ag+Ab溫育 +標(biāo)記Ag 溫育 分離測(cè)定數(shù)據(jù)處理 分離方法分離方法l對(duì)分離技術(shù)的要求對(duì)分離技術(shù)的要求 l1 B與F的分離既完全又快速，非特異結(jié)合低l2 B與F的分離不易受外界因素的干擾l3 分離試劑廉價(jià)易得，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。l分離方法分離方法: :非特異分離方法和特異分離方法非特異分離方法 1 吸附法 分離劑：葡聚糖凝膠包被活性炭(DCC) F被吸

7、附沉淀，重復(fù)性差 2 沉淀法 分離劑：聚乙二醇(PEG) B被沉淀，分離迅速，非特異結(jié)合率高 3 抽濾法 常用濾膜：玻璃纖維濾膜、微孔濾膜 B與F的分子量差別明顯時(shí)分離效果好特異性分離方法 1 雙抗體法 分離劑：第二抗體(抗抗體， Ab2) 分離時(shí)間長(zhǎng)，非特異結(jié)合率低 2 雙抗體+PEG法 分離迅速，非特異結(jié)合率低 3 固相分離法 固相材料上包被Ab1、Ab2 固相材料：纖維素(包被珠) 試管(包被管) 磁化顆粒 4 葡萄球菌A蛋白(SPA)分離法 類似Ab2數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 1 B% D 曲線 2 B% LogD 半對(duì)數(shù) 反“S”曲線 3 B/B0% LogD 半對(duì)數(shù) 反“S”曲線 4 Lo

8、git B/B0 LogD 全對(duì)數(shù) 直線 5 四參數(shù)或五參數(shù)Logistic模型 曲線 6 四參數(shù)單位點(diǎn)質(zhì)量作用模型 曲線質(zhì)量控制質(zhì)量控制 l目的：l 放射免疫分析是高靈敏度、高特異性的超微量分析方法，需進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。才能得到準(zhǔn)確，可靠的結(jié)果。 l 質(zhì)量控制（quality control，QC）包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制與實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制又包括批內(nèi)質(zhì)控與批間質(zhì)控l 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)控l（1）最高結(jié)合率l即零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%），指不加非標(biāo)記抗原時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，一般要求在30%50%，該指標(biāo)主要用來反映標(biāo)記物與抗體的質(zhì)量。l（2）非特異性結(jié)合率 l非特異性結(jié)合率（

9、NSB%）指不加抗體時(shí)標(biāo)記抗原與非特異物質(zhì)的結(jié)合率，一般要求5%10%。l(3)最低溶度管與最高溶度管的結(jié)合率之差應(yīng)大于30%l（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸的參數(shù) l包括截距a、斜率b和相關(guān)系數(shù)r，要求a、b值穩(wěn)定，r 0.99。l（5）ED25、ED50與 ED75 l指標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)合率在25%、50%和75%時(shí)對(duì)應(yīng)的抗原濃度值，它反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性，有助于批間結(jié)果的比較。（6）質(zhì)控圖 1）三種質(zhì)控血清中有一個(gè)測(cè)定值大于3SD 2）三種質(zhì)控血清中有二個(gè)測(cè)定值在同一方向上大于2SD 3）三種質(zhì)控血清中有三個(gè)測(cè)定值在同一方向上大于1SD 以上三種情況只要出現(xiàn)一種，WHO要求應(yīng)予以舍棄！2放射免疫分析

10、藥盒質(zhì)量評(píng)價(jià)l（1）精密度(precision):同一樣品重復(fù)測(cè)定的值的離散度。通常以復(fù)管的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù) （CV）表示。要求CV批內(nèi)小于5%，批間小于5%-10%l標(biāo)準(zhǔn)差 （SD）= |X1- X2|/ 2l變異系數(shù) （CV）=SD/ Xl（2）靈敏度（sensitivity） l指測(cè)定方法的最小可檢出量，即從生物樣品中能夠檢出某物質(zhì)的最小濃度。 l（3）準(zhǔn)確度 l準(zhǔn)確度(accuracy)指測(cè)定值與已知真實(shí)值的符合程度。以質(zhì)量控制樣品，測(cè)定實(shí)際樣品外加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率和健全性來表示。質(zhì)量控制樣品為臨床檢驗(yàn)中最簡(jiǎn)便，最有效的質(zhì)控方法。6 6 免疫放射分析法免疫放射分析法（immuno

11、radiometric assay, IRMA）l基本原理：將過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，分離結(jié)合的標(biāo)記抗體與未結(jié)合的多余的標(biāo)記抗體，測(cè)定復(fù)合物的放射性。其活度與待測(cè)抗原的量呈正相關(guān)。是非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，是全量反應(yīng)。l免疫放射分析法有以下特點(diǎn)：l1以標(biāo)記抗體作為示蹤劑l2反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：因標(biāo)記抗體是過量的，且反應(yīng)是非競(jìng)爭(zhēng)性的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA快。l3靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的10100倍。l4標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬。l5特異性高。l6穩(wěn)定性好。 lIRMA反應(yīng)式 夾心法 SP-Ab1 + Ag SP-Ab1-Ag *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab

12、2 SP：表示固相物 IRMA劑量反應(yīng)曲線l基本方法l雙抗體夾心法 1 SP-Ab1 + Ag SP-Ab1-Ag *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 2 Ag + *Ab2 Ag-*Ab2 + *Ab2 SP-Ab1 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 3 SP-Ab1+Ag+*Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2l標(biāo)記第三抗體 SP-Ab1 + Ag + Ab2 SP-Ab1-Ag-Ab2 *Ab3 SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3 *Ab3：第三抗體，即抗抗體，又稱通用性標(biāo)記抗體 l RIA與IRMA原理比較 RIA IRMA 競(jìng)爭(zhēng)性 非競(jìng)爭(zhēng)性 *

13、Ag *Ab *Ag、Ag、Ab Ag、*Ab Ab限量 Ab過量 B-D呈負(fù)相關(guān) B-D呈正相關(guān) 反應(yīng)達(dá)平衡慢 反應(yīng)達(dá)平衡快 NSB影響高劑量區(qū) NSB影響低劑量區(qū)7 7 非放射性免疫標(biāo)記分析技術(shù)非放射性免疫標(biāo)記分析技術(shù)l 由于用放射性核素作標(biāo)記物有其致命的缺陷如：放射性核素半衰期，放射性污染等。因此近年來非放射性免疫標(biāo)記分析技術(shù)得到快速發(fā)展。多種技術(shù)互相滲透，自動(dòng)化程度大為提高。1 1、酶標(biāo)記的免疫分析法、酶標(biāo)記的免疫分析法 l酶標(biāo)記的免疫分析法（enzyme immunoassay, EIA）是以酶標(biāo)記抗體或抗原的免疫檢測(cè)方法。它將抗原抗體結(jié)合的高特異性與酶促反應(yīng)的高靈敏度有機(jī)結(jié)合起來，

14、用酶（如辣根過氧化物、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等）標(biāo)記抗體（抗原），檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中未知抗原（抗體），當(dāng)相應(yīng)的抗原抗體特異性結(jié)合后，加入相應(yīng)的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色有無和深淺，可以判斷待測(cè)標(biāo)本中有無特異性抗原（抗體）以及量的多少。2 2、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法l化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemical luminescent immunoassay，CLIA）是以發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記示蹤物，標(biāo)記抗原或抗體，如是標(biāo)記抗原，則待測(cè)抗原與熒光標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量抗體，反應(yīng)達(dá)到平衡后，將游離標(biāo)記抗原與發(fā)光標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物分離，然后處理復(fù)合物，使其發(fā)光物質(zhì)發(fā)光，其中發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)。非競(jìng)爭(zhēng)法中，用發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗體，與IRMA法原理相似。3 3 、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法l使前兩者技術(shù)互相融合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，使本法的可靠性和靈敏度大為提高。4 4、時(shí)間分辨熒光分析法、時(shí)間分辨熒光分析法l時(shí)間分辨熒光分析法（time resolved fluorescence, TRF）是以稀土元素，常用的是能發(fā)射長(zhǎng)壽命離子熒光的銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）四種元素，標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，稀土元素在紫外光