第五章器官培養(yǎng)

1、第五章第五章 器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)葉的培養(yǎng)根的培養(yǎng)莖尖、莖段的培養(yǎng)花藥的培養(yǎng)一、概念：一、概念：J植物離體組織（器官）的快速繁殖植物離體組織（器官）的快速繁殖（in vitro tissue or organ rapid propa-gationin vitro tissue or organ rapid propa-gation ） 是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，通過無菌操作，將植物是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，通過無菌操作，將植物離體組織（器官）（離體組織（器官）（in vitro tissue or organ in vitro tissue or organ ）接種在）接種在人工控制的營養(yǎng)和環(huán)境條

2、件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生成人工控制的營養(yǎng)和環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生成完整的植株而進(jìn)行的快速繁殖方法。完整的植株而進(jìn)行的快速繁殖方法。J離體繁殖離體繁殖（in vitro propagationin vitro propagation）J微繁殖微繁殖（MicropropagationMicropropagation）J離體營養(yǎng)繁殖離體營養(yǎng)繁殖（in vitro vegetative propagation in vitro vegetative propagation ）J離體無性（系）繁殖離體無性（系）繁殖（in vitro asexual propagation in vitro asex

3、ual propagation ）第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、器官培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)二、器官培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)F小型高效F可實(shí)行工廠化生產(chǎn)F加速繁育優(yōu)良品種一般選育一個(gè)新品種，用傳統(tǒng)方法需810年，用微繁殖方法只需2年左右的時(shí)間。F保持優(yōu)良品種的特性F體細(xì)胞無性系變異材是育種好資源F有利于物質(zhì)保存三、離體快速繁殖發(fā)展情況三、離體快速繁殖發(fā)展情況F 19521952年年MorelMorel和和MartinMartin首次證實(shí)通過莖尖組織離體培養(yǎng)，可以從已受病毒浸染首次證實(shí)通過莖尖組織離體培養(yǎng)，可以從已受病毒浸染的大麗花中獲得無毒植株。的大麗花中獲得無毒植株。F 19571957年年SkoogSkoog和和Mil

4、lerMiller提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對(duì)細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對(duì)細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)F 19581958年年WicksonWickson和和ThimannThimann指出，利用外源細(xì)胞分裂素可促成在頂芽存在的情指出，利用外源細(xì)胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長。況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長。F 19581958年德國年德國ReinertReinert和美國和美國StewardSteward分別報(bào)道在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體分別

5、報(bào)道在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細(xì)胞胚細(xì)胞胚(somatic embryo)(somatic embryo)。F 19621962年，年，MurashigeMurashige和和SkoogSkoog開發(fā)了化學(xué)成分完備的適于煙草愈傷組織快速繁開發(fā)了化學(xué)成分完備的適于煙草愈傷組織快速繁殖的改良培養(yǎng)基（殖的改良培養(yǎng)基（Murashige and SkoogMurashige and Skoog Medium Medium，MSMS培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）F 19601960年年MorelMorel發(fā)現(xiàn)對(duì)蘭花（發(fā)現(xiàn)對(duì)蘭花（CymbidiumCymbidium）的離體莖尖進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，莖尖形成）的離體莖尖進(jìn)行培

6、養(yǎng)時(shí)，莖尖形成扁球狀的原球莖，他們?cè)谛螒B(tài)上與種子萌發(fā)時(shí)由胚形成的原球莖相似。扁球狀的原球莖，他們?cè)谛螒B(tài)上與種子萌發(fā)時(shí)由胚形成的原球莖相似。F 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界進(jìn)行快速繁殖研究的植物已有據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界進(jìn)行快速繁殖研究的植物已有130130屬屬10001000種種，其中最主，其中最主要的是要的是，約，約8080屬，屬，450450種。但是用工廠化的大規(guī)模生產(chǎn)主要有種。但是用工廠化的大規(guī)模生產(chǎn)主要有花卉（如薔薇屬、菊屬、石竹屬、蘭屬），果樹（如桃、柑橘、蘋果、香蕉、花卉（如薔薇屬、菊屬、石竹屬、蘭屬），果樹（如桃、柑橘、蘋果、香蕉、甘蔗、草莓），蔬菜作物（如馬鈴薯、大蒜），樹木（如桉樹），

7、珍稀植物甘蔗、草莓），蔬菜作物（如馬鈴薯、大蒜），樹木（如桉樹），珍稀植物（如安徽黃里子石榴、太和櫻桃）等。（如安徽黃里子石榴、太和櫻桃）等。四、應(yīng)用的前景四、應(yīng)用的前景1 1、用來加速繁殖、用來加速繁殖用種子繁殖較用種子繁殖較難的植物或繁殖速度較慢的植難的植物或繁殖速度較慢的植物物，如一些名貴花卉（蘭花、，如一些名貴花卉（蘭花、君子蘭等）。君子蘭等）。2 2、加速繁殖、加速繁殖珍稀瀕危植物珍稀瀕危植物紅花木蓮 3 3、利用脫毒技術(shù)繁殖主要靠營養(yǎng)繁殖的一些、利用脫毒技術(shù)繁殖主要靠營養(yǎng)繁殖的一些易易感病毒感病毒的花卉、作物、果樹等（如香石竹、百的花卉、作物、果樹等（如香石竹、百合、草莓、馬鈴薯）

8、。合、草莓、馬鈴薯）。4 4、一些、一些基因型雜合的園藝作物基因型雜合的園藝作物，如非洲菊、花，如非洲菊、花燭等，沒有很好的常規(guī)營養(yǎng)繁殖方法，而種子燭等，沒有很好的常規(guī)營養(yǎng)繁殖方法，而種子繁殖因基因重組會(huì)導(dǎo)致性狀的變異，喪失一些繁殖因基因重組會(huì)導(dǎo)致性狀的變異，喪失一些優(yōu)良性狀。優(yōu)良性狀。5 5、用于需要加速繁殖的、用于需要加速繁殖的特殊基因型特殊基因型。新品種；國外引入的少量植物材料；新品種；國外引入的少量植物材料；果樹中的優(yōu)良芽變品種和木本植物的優(yōu)選單株；果樹中的優(yōu)良芽變品種和木本植物的優(yōu)選單株；雌雄異株的植物中有良好經(jīng)濟(jì)性狀的加速繁殖。雌雄異株的植物中有良好經(jīng)濟(jì)性狀的加速繁殖。一、離體根的

9、培養(yǎng)一、離體根的培養(yǎng) 第一節(jié)第一節(jié) 根的培養(yǎng)根的培養(yǎng) （一）（一）意義：是進(jìn)行根系生理代謝研究的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)體系。研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系。建立快速生長的根無性系。對(duì)根細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行誘變處理，可篩選突變體。 （二）（二）培養(yǎng)方法： 一般方法： 無菌種子萌發(fā)-根離體培養(yǎng)（多采用液體培養(yǎng)）-側(cè)根-擴(kuò)大繁殖。 （三）培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基 低鹽培養(yǎng)基：低鹽培養(yǎng)基：WHITEWHITE，其它培養(yǎng)基，其它培養(yǎng)基2/3MS2/3MS，1/2MS1/2MS，B B5 5 激素：研究較多的是研究較多的是生長素生長素。影響可以分以下幾種情況：。影響可以分以下幾種情況：抑制離體根生長：如櫻桃、番茄、紅花槭。抑制離

10、體根生長：如櫻桃、番茄、紅花槭。促進(jìn)離體根生長：歐洲赤松、白羽扇豆、矮豌豆、玉米、小促進(jìn)離體根生長：歐洲赤松、白羽扇豆、矮豌豆、玉米、小麥。麥。 生長依賴于生長素：黑麥、小麥的一些變種。生長依賴于生長素：黑麥、小麥的一些變種。 激動(dòng)素則能增加根分生組織的活性，有抗老化的作用。激動(dòng)素則能增加根分生組織的活性，有抗老化的作用。（四）影響離體根因素：（四）影響離體根因素： 1 1基因型基因型 無限繼代生長：番茄、煙草、馬鈴薯、小麥無限繼代生長：番茄、煙草、馬鈴薯、小麥 有限繼代生長：胡蘿卜、向日葵、豌豆、蕎麥有限繼代生長：胡蘿卜、向日葵、豌豆、蕎麥 2 2營養(yǎng)條件：營養(yǎng)條件：離體根培養(yǎng)可利用唯一氮源

11、。離體根培養(yǎng)可利用唯一氮源。 VB1VB1是番茄離體培養(yǎng)不可缺少的。適宜的濃度范圍內(nèi)，對(duì)生長是番茄離體培養(yǎng)不可缺少的。適宜的濃度范圍內(nèi)，對(duì)生長的促進(jìn)作用與濃度成正比。的促進(jìn)作用與濃度成正比。一、概念和意義一、概念和意義 第二節(jié)第二節(jié) 莖尖的培養(yǎng)莖尖的培養(yǎng)2 2、概念、概念J莖尖分生組織培養(yǎng)：莖尖分生組織培養(yǎng)：主要是指對(duì)莖尖長度不超過主要是指對(duì)莖尖長度不超過0.lmm0.lmm的莖的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)可獲得無病毒植株。最大直徑為尖進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)可獲得無病毒植株。最大直徑為100100微微米，最大長度為米，最大長度為250250微米，最小的只有幾十微米。微米，最小的只有幾十微米。 J普通莖

12、尖培養(yǎng)：普通莖尖培養(yǎng)：是指對(duì)是指對(duì)幾毫米乃至幾十毫米幾毫米乃至幾十毫米長的莖尖、芽尖長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)。及側(cè)芽的培養(yǎng)。1、分類、分類莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)和取材大小根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)和取材大小莖尖分生組織培養(yǎng)莖尖分生組織培養(yǎng)普通莖尖培養(yǎng)普通莖尖培養(yǎng)二、莖尖培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作二、莖尖培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作（一）外植體材料的準(zhǔn)備（一）外植體材料的準(zhǔn)備1 1、外植體材料的選擇、外植體材料的選擇J植物的種類：植物的種類：一般來說，木本植物莖尖再生能力比草本植物相對(duì)差一點(diǎn)，增殖率一般來說，木本植物莖尖再生能力比草本植物相對(duì)差一點(diǎn)，增殖率低一點(diǎn)；雙子葉植物通常比單子葉植物容易獲得再生植株，而裸子植物則相當(dāng)有限

13、（除低一點(diǎn)；雙子葉植物通常比單子葉植物容易獲得再生植株，而裸子植物則相當(dāng)有限（除非在幼齡階段）。非在幼齡階段）。 J植物的年齡、生理狀態(tài)和取材部位：植物的年齡、生理狀態(tài)和取材部位：J選用幼齡植株選用幼齡植株 J一般認(rèn)為，處于植物一般認(rèn)為，處于植物營養(yǎng)生長狀態(tài)營養(yǎng)生長狀態(tài)的外植體比生殖生長時(shí)具有更的外植體比生殖生長時(shí)具有更強(qiáng)的再生能力（除少數(shù)例外）。強(qiáng)的再生能力（除少數(shù)例外）。 J在對(duì)根狀莖植物如草莓進(jìn)行微繁時(shí)，通常是使用匍匐枝的莖尖。在對(duì)根狀莖植物如草莓進(jìn)行微繁時(shí)，通常是使用匍匐枝的莖尖。對(duì)胡椒莖尖培養(yǎng)，只能采取莖的頂芽的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，才能保持對(duì)胡椒莖尖培養(yǎng)，只能采取莖的頂芽的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，才

14、能保持其特性。其特性。 J取材季節(jié)：取材季節(jié)：生長季節(jié)時(shí)取樣。生長季節(jié)時(shí)取樣。J取材大?。喝〔拇笮。呵o尖越小，成活率越低。生產(chǎn)上常采用莖尖越小，成活率越低。生產(chǎn)上常采用5 510mm10mm ，脫毒小于，脫毒小于1mm1mm2 2、外植體材料的滅菌外植體材料的滅菌（1 1）預(yù)處理）預(yù)處理材料修整、自來水沖洗、材料修整、自來水沖洗、 洗滌劑刷洗（可加數(shù)洗滌劑刷洗（可加數(shù)滴滴0.080.080.12%0.12%吐溫（吐溫（TweenTween）2020或或8080增溶劑）增溶劑）（2 2）選擇消毒劑：）選擇消毒劑：見下頁見下頁（3 3）具體操作技術(shù)：）具體操作技術(shù)：常規(guī)的消毒方法常規(guī)的消毒方法70

15、%70%酒精，數(shù)秒至酒精，數(shù)秒至3030秒秒 2 210%NaClO10%NaClO溶液，溶液，10103030分鐘；或者分鐘；或者0.1%0.1%汞液汞液消毒消毒5 515 15 分鐘分鐘數(shù)滴數(shù)滴0.080.080.12%0.12%吐溫吐溫2020或或8 8無菌水沖洗無菌水沖洗3 35 5次次消毒劑使用濃度 % 清除難易消毒時(shí)間 min滅菌效果次氯酸鈉次氯酸鈣漂白粉升汞酒精過氧化氫溴水硝酸銀抗菌素2910飽和溶液0.1170751012121450mgL-1易易易較難易最易易較難中5305305302100.225152105303060很好很好很好最好好好很好好較好（二）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備（二）

16、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備1. 1.選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基（1 1）植物材料基因型的專一性）植物材料基因型的專一性（2 2）培養(yǎng)基的總離子濃度（）培養(yǎng)基的總離子濃度（Total ionic stregthTotal ionic stregth）（3 3）培養(yǎng)基的總氮水平、苗芽培養(yǎng)中的鈣缺乏和氯化）培養(yǎng)基的總氮水平、苗芽培養(yǎng)中的鈣缺乏和氯化物敏感性等物敏感性等2.2.選擇培養(yǎng)基的方法：選擇培養(yǎng)基的方法：“廣譜實(shí)驗(yàn)廣譜實(shí)驗(yàn)”等。等。3.3.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌（1 1）高壓蒸汽滅菌、）高壓蒸汽滅菌、（2）過濾滅菌）過濾滅菌0.45m（三）接種工具、用具、接種室的（三）接種工具、用具、接種室的準(zhǔn)備準(zhǔn)備1. 1.

17、接種工具、用具、的準(zhǔn)備及滅菌接種工具、用具、的準(zhǔn)備及滅菌高溫高壓蒸汽滅菌鍋滅菌、時(shí)間高溫高壓蒸汽滅菌鍋滅菌、時(shí)間3030分鐘分鐘 2.2.接種室的滅菌接種室的滅菌甲醛熏蒸法滅菌（按甲醛熏蒸法滅菌（按3 3份甲醛：份甲醛：1 1份高錳酸鉀）份高錳酸鉀）用用2 2新潔爾滅液或新潔爾滅液或7070酒精擦洗室內(nèi)墻壁、地酒精擦洗室內(nèi)墻壁、地板及設(shè)備。板及設(shè)備。接種前，提前接種前，提前1 1小時(shí)，開紫外線燈消毒小時(shí)，開紫外線燈消毒20203030分分鐘。鐘。 三、莖尖培養(yǎng)的程序和技術(shù)三、莖尖培養(yǎng)的程序和技術(shù)1 1、初代培養(yǎng)：、初代培養(yǎng)：是指將外植體接種到培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)形成芽，或脫分化形成是指將外植體接種

18、到培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)形成芽，或脫分化形成愈傷組織的過程。愈傷組織的過程。 2 2、繼代培養(yǎng)：、繼代培養(yǎng)：外植體接種后，一般經(jīng)培養(yǎng)外植體接種后，一般經(jīng)培養(yǎng)30304040天后，將外植體轉(zhuǎn)接種到新的培養(yǎng)天后，將外植體轉(zhuǎn)接種到新的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)其分化增殖，以獲得更多的芽苗。增殖培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)其分化增殖，以獲得更多的芽苗。增殖培養(yǎng)3 3、生根壯苗培養(yǎng)：、生根壯苗培養(yǎng)： 試管內(nèi)生根試管內(nèi)生根（in vitro rootingin vitro rooting）：指繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的芽苗、嫩梢，當(dāng)增殖）：指繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的芽苗、嫩梢，當(dāng)增殖到一定數(shù)量并長出葉片時(shí)，將伸長的芽苗、嫩梢從基部切割分離開并

19、轉(zhuǎn)接入到一定數(shù)量并長出葉片時(shí)，將伸長的芽苗、嫩梢從基部切割分離開并轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，促進(jìn)其生根。生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，促進(jìn)其生根。 試管外生根：試管外生根：是指將試管內(nèi)繁殖的嫩枝當(dāng)作微型插條，直接插入基質(zhì)，讓插是指將試管內(nèi)繁殖的嫩枝當(dāng)作微型插條，直接插入基質(zhì)，讓插條生根馴化（條生根馴化（habituationhabituation）。）。4 4、煉苗與移栽、煉苗與移栽J 煉苗：煉苗：為了提高植株的適應(yīng)能力，提高移栽的成活率，生產(chǎn)上，必須盡可為了提高植株的適應(yīng)能力，提高移栽的成活率，生產(chǎn)上，必須盡可能地創(chuàng)造一個(gè)適宜于試管苗過渡、鍛煉和適應(yīng)的過程，這一工作叫馴化或能地創(chuàng)造一個(gè)適宜于試管苗過渡、鍛煉和

20、適應(yīng)的過程，這一工作叫馴化或煉苗（煉苗（AcclimationAcclimation）。）。J 試管苗移栽：試管苗移栽：把完整的再生植株移至大田種植這一過程。把完整的再生植株移至大田種植這一過程。 濾濾紙紙橋橋瓶瓶外外 生生根根四、影響莖尖培養(yǎng)微繁殖的因素四、影響莖尖培養(yǎng)微繁殖的因素 1 1基因型基因型 2 2外值體的大小外值體的大小 3 3供試植株的生理狀態(tài)供試植株的生理狀態(tài) 4 4芽在植株上的部位芽在植株上的部位 5 5供試植株的年齡供試植株的年齡 6. 6. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 7. 7. 褐變褐變8. 8. 玻璃化玻璃化 9. 9. 極性極性1010后生變化后生變化 1111中間繁殖體的形態(tài)

21、發(fā)生能力中間繁殖體的形態(tài)發(fā)生能力 1212遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 第三節(jié)第三節(jié) 莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng)一、概念和意義一、概念和意義1 1、概念：、概念：莖段培養(yǎng)是指對(duì)去除莖尖后帶有側(cè)芽（腋芽）或葉柄、長約莖段培養(yǎng)是指對(duì)去除莖尖后帶有側(cè)芽（腋芽）或葉柄、長約2 23 3厘米厘米的莖段的離體培養(yǎng)。的莖段的離體培養(yǎng)。2 2、意義：、意義：外植體來源廣、技術(shù)簡單、操作方便、成活率高，成苗時(shí)間短。外植體來源廣、技術(shù)簡單、操作方便、成活率高，成苗時(shí)間短。莖段培養(yǎng)，其表現(xiàn)型和母株的基因型一致，遺傳性穩(wěn)定。莖段培養(yǎng)，其表現(xiàn)型和母株的基因型一致，遺傳性穩(wěn)定。莖段培養(yǎng)同莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)結(jié)合起來，可以有效地解決脫毒苗的

22、快速繁莖段培養(yǎng)同莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)結(jié)合起來，可以有效地解決脫毒苗的快速繁殖題。殖題。莖段培養(yǎng)若通過誘導(dǎo)愈傷組織途徑進(jìn)行快繁，往往會(huì)發(fā)生突變，其中一些有利莖段培養(yǎng)若通過誘導(dǎo)愈傷組織途徑進(jìn)行快繁，往往會(huì)發(fā)生突變，其中一些有利突變是育種的材料。突變是育種的材料。利用莖段培養(yǎng)，可以研究植物的器官分化、形態(tài)建成、器官功能和種質(zhì)保存問利用莖段培養(yǎng)，可以研究植物的器官分化、形態(tài)建成、器官功能和種質(zhì)保存問題。題。二、莖段培養(yǎng)的程序二、莖段培養(yǎng)的程序初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)生根壯苗生根壯苗試管苗移栽試管苗移栽 第四節(jié)第四節(jié) 葉的培養(yǎng)葉的培養(yǎng)概念：概念： 離體葉培養(yǎng)離體葉培養(yǎng)是指包括葉原基、葉柄、葉鞘、

23、葉片、子葉等葉組織是指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等葉組織的無菌培養(yǎng)。的無菌培養(yǎng)。意義。意義。 1 1、它是研究葉形態(tài)建成，光合作用，葉綠素形成等理論問題的良好方法、它是研究葉形態(tài)建成，光合作用，葉綠素形成等理論問題的良好方法 2 2、通過葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng)，以證實(shí)葉細(xì)胞的全能性。、通過葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng)，以證實(shí)葉細(xì)胞的全能性。 3 3、通過離體葉組織、細(xì)胞的培養(yǎng)、探索離體葉組織、細(xì)胞培養(yǎng)的條件和、通過離體葉組織、細(xì)胞的培養(yǎng)、探索離體葉組織、細(xì)胞培養(yǎng)的條件和影響因素，為葉片原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合研究提供理論依據(jù)。影響因素，為葉片原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合研究提供理

24、論依據(jù)。 4 4、利用離體葉組織的再生特性，建立植物體細(xì)胞快速無性繁殖系，提高、利用離體葉組織的再生特性，建立植物體細(xì)胞快速無性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系數(shù)。某些不易繁殖植物的繁殖系數(shù)。 5 5、葉細(xì)胞培養(yǎng)物是良好的遺傳誘變系統(tǒng)，經(jīng)過自然變異或者人工誘變處、葉細(xì)胞培養(yǎng)物是良好的遺傳誘變系統(tǒng)，經(jīng)過自然變異或者人工誘變處理可篩選出突變體而應(yīng)用于育種實(shí)踐。理可篩選出突變體而應(yīng)用于育種實(shí)踐。 二、葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng)二、葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng) 一、葉原基培養(yǎng)一、葉原基培養(yǎng) 采用采用休眠期的頂芽休眠期的頂芽，剝?nèi)ヒ徊糠主[片后，在，剝?nèi)ヒ徊糠主[片后，在5 5次氯酸鈉溶次氯酸鈉溶液中

25、浸泡液中浸泡 20min20min，進(jìn)行表面消毒。，進(jìn)行表面消毒。 切取柱狀葉原基進(jìn)行培養(yǎng)。切取柱狀葉原基進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)基采用培養(yǎng)基采用KonpsKonps無機(jī)鹽（部分修改）或無機(jī)鹽（部分修改）或KundsonKundson（19511951）配方，添加配方，添加NitschNitsch配方中的微量元素和配方中的微量元素和2 2蔗糖、蔗糖、8%8%瓊脂。瓊脂。pH5.5pH5.5。 部分實(shí)驗(yàn)中添加維生素、水解酪蛋白等。部分實(shí)驗(yàn)中添加維生素、水解酪蛋白等。 溫度為溫度為2424，人工光照，人工光照24h24h。 一、葉原基培養(yǎng)一、葉原基培養(yǎng) （一）葉組織培養(yǎng)的一般方法（一）葉組織培養(yǎng)的一般方法

26、 1 1葉組織分離與消毒葉組織分離與消毒 用幼嫩葉片進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，選取頂端未充分展開的幼嫩葉片。用幼嫩葉片進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，選取頂端未充分展開的幼嫩葉片。經(jīng)流水沖洗后，用蘸有少量經(jīng)流水沖洗后，用蘸有少量7575乙醇的紗布擦拭葉片表面，乙醇的紗布擦拭葉片表面，0.10.1升汞溶液中消毒升汞溶液中消毒5 58min8min，再用無菌水沖洗，再用無菌水沖洗3 34 4次。次。消毒后的葉片轉(zhuǎn)入到鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。切成消毒后的葉片轉(zhuǎn)入到鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。切成5x5mm5x5mm左右左右的小塊，然后上表皮朝上接在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。的小塊，然后上表皮朝上接在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 二、葉片組織的脫分化和再分

27、化培養(yǎng)二、葉片組織的脫分化和再分化培養(yǎng) 2 2培養(yǎng)基培養(yǎng)基 常用：常用：MSMS、WhiteWhite、N N6 6等培養(yǎng)基。等培養(yǎng)基。蔗糖，濃度為蔗糖，濃度為3 3左右。培養(yǎng)基中附加椰子汁等有機(jī)添加物，有左右。培養(yǎng)基中附加椰子汁等有機(jī)添加物，有利于葉片組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生。利于葉片組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生。激素是影響煙草葉組織脫分化和再分化的主要因素。激素是影響煙草葉組織脫分化和再分化的主要因素。 對(duì)大多數(shù)雙子葉植物來講細(xì)胞分裂素，特別是對(duì)大多數(shù)雙子葉植物來講細(xì)胞分裂素，特別是KTKT和和6-BA6-BA有利有利于芽的形成；于芽的形成；生長素，特別是生長素，特別是NAANAA則抑制芽的形成而有利

28、于根的發(fā)生。則抑制芽的形成而有利于根的發(fā)生。2 2，4-D4-D是一種強(qiáng)生長劑，有利于愈傷組織的形成。是一種強(qiáng)生長劑，有利于愈傷組織的形成。 3 3培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 25252828，光照，光照121214h14h，光照度約為，光照度約為150015002000lx2000lx。 不定芽分化和生長期應(yīng)增加光照度到不定芽分化和生長期應(yīng)增加光照度到300030005000lx5000lx。 4供試植株的發(fā)育時(shí)間和葉齡 （二）影響葉組織培養(yǎng)的因素（二）影響葉組織培養(yǎng)的因素 1 1基因型基因型 2 2細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素 兩種細(xì)胞分裂素對(duì)芽的分化影響，兩種細(xì)胞分裂素對(duì)芽的分化影響，6-BA6-BA的作

29、用好于的作用好于KTKT的作用。但的作用。但6-BA6-BA對(duì)不定芽的進(jìn)一步發(fā)育即莖葉的形成有抑制作用。對(duì)不定芽的進(jìn)一步發(fā)育即莖葉的形成有抑制作用。 3 3細(xì)胞分裂素與生長素的組合細(xì)胞分裂素與生長素的組合 6. 極性 研究表明，煙草成株期，葉組織脫分化和再分化需要的時(shí)間較長。而且葉片膨大體積較大，多在刀口處形成大量的愈傷組織和分生細(xì)胞團(tuán)，芽苗大多發(fā)生在這些細(xì)胞分生團(tuán)和結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織上。幼葉可以直接從不同部位成苗。 個(gè)體發(fā)有早期的幼嫩葉片較成熟期幼嫩葉片分化能力高。 離體葉片本身的位置對(duì)分化也影響很大。同一株煙草不同葉位葉片對(duì)器官分化的影響不同，發(fā)育完全的葉片，葉組織器官分化能力較發(fā)育幼齡葉片組織再分化能力低得多在離體葉片再生中，葉脈的作用也是明顯的。