第三章作物基因工程

1、第三章第三章 作物基因工程作物基因工程 第一節(jié) 基因工程與轉(zhuǎn)基因作物 第二節(jié) 無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物獲得技術(shù) 第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特性第一節(jié) 基因工程與轉(zhuǎn)基因作物1.1 基因工程18651972 - Paul BergProduces first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sitesPlasmid DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant

2、 DNA18651973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycl

3、ineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies載體結(jié)構(gòu)的三大要素：載體結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記（耐藥性，選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZLacZ） 獨(dú)立的復(fù)制單位獨(dú)立的復(fù)制單位種類：種類： 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC） 反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體 表達(dá)載體表達(dá)載體1.2 轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因的作用轉(zhuǎn)基因作物在全球分布1996年至年至2008年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積：工業(yè)化國(guó)家與發(fā)展中國(guó)家（單位：百萬公頃）年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積：工業(yè)化國(guó)家與發(fā)展中國(guó)家

4、（單位：百萬公頃）資料來源：資料來源： Clive James，2008四大轉(zhuǎn)基因作物種植面積得益于采用得益于采用復(fù)合性狀復(fù)合性狀并拓展具有農(nóng)藝、并拓展具有農(nóng)藝、優(yōu)質(zhì)優(yōu)質(zhì)及其他特性的作物，再加上及其他特性的作物，再加上約約3年后將年后將應(yīng)用應(yīng)用的耐旱特性的耐旱特性，美國(guó)、加拿大和澳大利亞的轉(zhuǎn)基因作物會(huì)繼，美國(guó)、加拿大和澳大利亞的轉(zhuǎn)基因作物會(huì)繼續(xù)保持增長(zhǎng)續(xù)保持增長(zhǎng) 。 高昂的高昂的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因作物的種植價(jià)格會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因作物的種植第一個(gè)十年（第一個(gè)十年（1996年年-2005年）屬于美洲年）屬于美洲，在第二個(gè)十年中，以印度、中，在第二個(gè)十年中，以印度、中國(guó)和越南國(guó)和越南等新興國(guó)家為

5、首的等新興國(guó)家為首的亞洲很可能亞洲很可能出現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)增長(zhǎng)出現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)增長(zhǎng) 巴西巴西擁有巨大潛力，擁有巨大潛力，有可能引領(lǐng)拉美的增長(zhǎng)有可能引領(lǐng)拉美的增長(zhǎng)非洲非洲 種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家數(shù)量會(huì)略有增長(zhǎng)，其中以北非的種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家數(shù)量會(huì)略有增長(zhǎng)，其中以北非的埃及埃及、西、西非的非的布基納法索布基納法索和東非的和東非的肯尼亞肯尼亞為最為最 歐盟會(huì)保持緩慢到中度的增長(zhǎng)步伐，歐盟會(huì)保持緩慢到中度的增長(zhǎng)步伐，東歐東歐潛力巨大潛力巨大以以美國(guó)、巴西美國(guó)、巴西以及許多其他國(guó)家為首將以及許多其他國(guó)家為首將轉(zhuǎn)基因作物用作轉(zhuǎn)基因作物用作生物燃料生物燃料 乙醇和乙醇和生物柴油生物柴油 ，將成為一種，將成為一種重要的新發(fā)展重

6、要的新發(fā)展。 整理人：整理人： Clive James，2008第二節(jié) 無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物獲得技術(shù)PCR analysis for target gene第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特性 3.1 外源DNA的整合特性 整合位點(diǎn)是隨機(jī)的，但多發(fā)生在同源序列區(qū)和高度重復(fù)序列區(qū)。 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法整合外源基因拷貝數(shù)較少，往往是單拷貝；基因槍轉(zhuǎn)化法整合外源基因拷貝數(shù)較多，往往多單拷貝；采用強(qiáng)啟動(dòng)子整合外源基因拷貝數(shù)較多。3.2 位點(diǎn)特異性重組 重組只發(fā)生在具有特定DNA序列的位置上，由特定的酶來識(shí)別該特定序列并產(chǎn)生作用，從而使DNA重組，也稱定位重組。 目前發(fā)現(xiàn)的有4個(gè)定位重組系統(tǒng)： Cre/lox，F(xiàn)LP/F

7、RT，R/RS，Gin/gix定位重組系統(tǒng)重組系統(tǒng)Cre/loxFLP/FRTR/RSGin/gix來源噬菌體P1釀酒酵母2u質(zhì)粒結(jié)合酵母pSR1噬菌體Mu天然功能整合進(jìn)入宿主基因組，環(huán)化維持質(zhì)粒高拷貝數(shù)維持質(zhì)粒高拷貝數(shù)及反向重復(fù)序列的精確同源控制宿主范圍的專一性重組酶Cre:38.5kDaFLP : 48kDaR : 56kDaGin :21.7kDa家族整合酶整合酶整合酶轉(zhuǎn)化酶識(shí)別位點(diǎn)loxP: 34bp FRT: 34bp RS: 58bpgix: 34bp反向重復(fù)13bp13bp12bp12bp不對(duì)稱間隔8bp8bp7bp2bp切割位點(diǎn)間隔區(qū)邊緣 間隔區(qū)邊緣 間隔區(qū)邊緣 間隔區(qū)邊緣Cr

8、e/lox定位重組系統(tǒng)的工作方式CreloxPloxPA：B：C：缺失倒位插入，即位點(diǎn)特異性重組+質(zhì)粒質(zhì)粒loxP基因座的序列和結(jié)構(gòu)ATAACTTCGTATATATTGAAGCATATTATACGAAGTTATATATGCTTCAATAATGTATGCTACATACG3.3 外源基因的表達(dá) 3.3.1 瞬時(shí)表達(dá) 短時(shí)間內(nèi)的外源基因表達(dá)。 瞬時(shí)表達(dá)是未整合的外源基因的表達(dá)，是一種正常的表達(dá)方式。 常被用來進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測(cè)，基因表達(dá)調(diào)控研究，基因功能初步驗(yàn)證。3.3.2 穩(wěn)定表達(dá) 1 組成型表達(dá)及其啟動(dòng)子 特點(diǎn)：上游存在6聚體花紋序列TGACTG，其往往以重復(fù)形式出現(xiàn)并被6-8bp隔開。 nos 和 ocs啟動(dòng)子(后者對(duì)禾本科無啟動(dòng)能力) 雙向啟動(dòng)子：479bp CaMV 35S啟動(dòng)子2 組織特異性表達(dá)及啟動(dòng)子 馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子：只在塊莖中表達(dá)，莖稈和根系偶爾表達(dá)，但不在葉片中表達(dá)。 小麥胚乳特異表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動(dòng)子；番茄果實(shí)成熟特異性表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶基因啟動(dòng)子；花粉特異表達(dá)基因（lat52）啟動(dòng)子。3 誘導(dǎo)型表達(dá)及啟動(dòng)子 光誘導(dǎo)啟動(dòng)子：SSrbc和LHCPa/b 熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子：熱激蛋白啟動(dòng)子 損