SODPODCAT酶活測(cè)定

1、0.067mol/LpH7.0磷酸緩沖液分子量0.067molPH7.0(1000ml磷酸緩沖液)OOODDDDaHPO.2HO178.05242DaHPO.12HO358.22242KHPO136.0924Da2HPO4.2H2O7.1184g(或D根系活性的測(cè)定7.1184g14.4004g3.6292ga2HPO4.12H2O14.4004g)+KH2PO43.6292g定容到1000ml容量瓶中1、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備1.實(shí)驗(yàn)試劑乙酸乙酯（分析純，次硫酸鈉（Na2S2O4,分析純）,粉末,1%TTC溶液，磷酸緩沖液(1/15mol/L，pH7.0)，1mol/L硫酸。2.儀器設(shè)備小

2、燒杯3個(gè),研缽1個(gè)，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支,刻度試管6支，分光光度計(jì)，電子天平，溫箱，試管架，藥勺，石英砂適量，濾紙。2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容操作步驟2、定量測(cè)定（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取0.4DTTC溶液0.2ml放入大試管中，加9.8ml乙酸乙酯，再加少許Na2S2O4粉末搖勻，則立即產(chǎn)生紅色的TTF。此溶液濃度為每毫升含有TTF80|Jg。分別取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml刻度試管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20pg、40pg、80pg、120pg、160pg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以乙酸乙酯作參照，在485nm

3、波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱取根尖樣品0.5g，放入小燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液（pH7.0）各5ml,使根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37叮暗保溫12h,此后立即加入1mol/L硫酸2ml,以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，37下暗保溫后不加硫酸，其溶液濃度、操作步驟同上）。（3）把根取出，用濾紙吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯34mL,充分研磨，以提出TTF。把紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈?3次，皆移入刻度試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參照測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求

4、出TTC原量。2.計(jì)算結(jié)果根系活力mgTTF/(g.h)=WDhD1000式中：四氮唑還原量,|Jg;W根重，g;h時(shí)間，h。二葉綠素含量測(cè)定：95%乙醇溶液,在665、649、470nm處有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.88D649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245抗氧化酶活性的定：0.05mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）（pH=7.8）溶液的配制：65.5506gNa2HPO412H2O+2.65285gNaH2PO42H2O,定容到4L。（參考陳建勛，王曉峰主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，P134）。取低溫保存的

5、鮮樣，稱2g左右的葉片（或根）放在50ml的離心管，加入20ml濃度為0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.8）（最好是較冷的磷酸緩沖溶液，防止研磨時(shí)溫度過(guò)高使酶失活），研磨（用磨碎機(jī)磨），8000r/min的冷凍離心機(jī)下離心20分鐘，上清液為粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的測(cè)定：20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：稱200g三氯乙酸，用蒸餾水定容到1000ml。（參考陳建勛，王曉峰主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo),P124）；0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：稱5g硫代巴比妥酸（TBA），用20%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（參考陳建勛，王曉峰主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

6、,P124）（先加少量的氫氧化鈉1mol/L溶解）;0.5ml酶液（對(duì)照用0.5ml的0.05mol/LpH=7.8的磷酸緩沖液代替酶液）（做三個(gè)重復(fù)）+3mlTBA振蕩一一沸水浴上反應(yīng)30min冷卻（至少30min）比色（0D600、OD532、OD450）。（參考陳建勛，王曉峰主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定：NBT（400ml）混合反應(yīng)液：392mlPBS（Ph=7.8）,+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸銨+8ml核黃素溶液+0.4mlEDTA-Na溶液（100mlPBS緩沖溶液中含0.01204g核黃素）。（另配）100mlPBS溶液加

7、EDTA-Na3.7224gEDTA-Na測(cè)試時(shí)：取3ml反應(yīng)液+0.05ml（根）或0.02ml（葉）粗酶液，于光照培養(yǎng)箱中6-10分鐘，OD650下測(cè)定吸光度。2.3過(guò)氧化物酶（POD）的測(cè)定：0.05mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）（pH=7.0）溶液的配制：10.9251gNa2HPO412H2O+3.042975gNaH2PO42H2O,定容到1000ml。0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml30%H2O2,用0.05mol/LpH=7.0磷酸緩沖溶液（PBS）定容到250ml。0.2%愈創(chuàng)木酚溶液的配制：稱0.5g愈創(chuàng)木酚，用0.05mol/LpH=7.0磷酸緩沖溶液（PBS）定容到250ml。2ml0.3%H2O2溶液+0.95ml0.2%愈創(chuàng)木酚溶液+1ml0.05mol/LpH=7.0磷酸緩沖溶液（PBS）+0.02ml酶液（原來(lái)為0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（對(duì)照用0.05mol/L磷酸緩沖溶液代替酶液）（做三個(gè)重復(fù)），記錄470nm處OD降低速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)活力單位。（參考陳建勛，王曉峰主編的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)P121）比色時(shí)加酶液，混合后即刻計(jì)時(shí)。2.4過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml30%H2O2，用0.05mo