分子診斷技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

1、關(guān)于分子診斷技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展第一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月主要內(nèi)容分子診斷概念的演變分子診斷技術(shù)的分類基于雜交基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用基于擴(kuò)增基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用基于測序基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用分子診斷應(yīng)用前景展望第二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase: DNA聚合酶 第三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”改變世界核裂變鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月分子診斷概念的變化分子診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或

2、表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個(gè)體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。基因診斷：又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對疾病做出判斷。分子生物學(xué)：從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月分子診斷技術(shù)的分類根據(jù)目的基因是

3、否被放大分類 可分為雜交法和擴(kuò)增法 根據(jù)被測基因的核酸類型分類 Southern印跡用于檢測DNA；Northern印跡用于檢測RNA；斑點(diǎn)印跡或稱斑點(diǎn)雜交，既可檢測DNA也可檢測RNA。 根據(jù)診斷目的或要求 分為定性診斷、定量診斷和半定量診斷，以及序列分析等 根據(jù)分子之間的作用形式 雜交、擴(kuò)增、測序第六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應(yīng)用基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應(yīng)用基于分子雜交的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交（mole

4、cular hybridization）。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交（southern Blot和northern Blot）到實(shí)時(shí)PCR（real time PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。而且在理論上可以特異性相互作用的兩個(gè)不同分子，例如核酸與核酸之間（A-G、G-C）、蛋白與蛋白之間（抗原和抗體）甚至核酸和蛋白之間（適體與多肽）的相互作用都可以視為分子雜交的不同表現(xiàn)模式。因此，廣義的分子雜交技術(shù)是指以核酸、蛋白、糖基以及細(xì)胞、代謝物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前臨床應(yīng)用的以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)繁多，

5、缺乏統(tǒng)一的分類方法，但是可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的差異分為主要的兩種類型，一類是通過特異性的標(biāo)記探針檢測檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)，而另一類是通過探針檢測從細(xì)胞內(nèi)提取的核酸、蛋白等物質(zhì)，前者以原位雜交及其衍生的技術(shù)為主，后者以生物芯片及其衍生的技術(shù)為主。第七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交（FISH）原位雜交應(yīng)用特異性的探針檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸需要標(biāo)記分子顯示雜交信號，1960s年代的檢測技術(shù)是放射性核素標(biāo)記，但是信號檢測程序復(fù)雜并且可能存在放射性物質(zhì)的污染，而熒光物質(zhì)標(biāo)記可以通過顯微鏡直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)（Fluorescent in situ hybridizt

6、ion，F(xiàn)ISH）一經(jīng)出現(xiàn)立刻取代了放射性標(biāo)記的技術(shù)，成為應(yīng)用最廣泛的分子雜交技術(shù)。FISH技術(shù)通過熒光標(biāo)記探針，可以可視化的檢測人類細(xì)胞或組織中特定基因的數(shù)量及其定位，是分子雜交與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合。IFSH技術(shù)的分析過程分為四個(gè)步驟，核酸變性、探針變性、雜交及信號檢測。因此，針對探針標(biāo)記、染料開發(fā)和圖像分析的技術(shù)的更新是FISH分析技術(shù)發(fā)展的主要路徑。第八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交衍生技術(shù)首先是熒光染料的應(yīng)用，從最初的單色FITC應(yīng)用，發(fā)展到使用多種熒光染料的多色FISH技術(shù)，既多元熒光原位雜交和光譜核型分析技術(shù)，使用五種染料（Rhodamine, Texas

7、-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）標(biāo)記的探針可以在一次試驗(yàn)中定位多種不同的基因以及使用不同的顏色標(biāo)記顯示24條不同的染色體。其次，在探針方面，染色體臂、著絲粒、端粒特異的探針被先后開發(fā)應(yīng)用，而且應(yīng)用微切割技術(shù)切割技術(shù)制備亞區(qū)域探針（microFISH），使FISH的基因定位和分辯率大大提高6。同時(shí)，探針標(biāo)記對象和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展不斷衍生出新的FISH技術(shù)，例如比較基因組雜交、引物原位標(biāo)記技術(shù)、肽核酸探針原位雜交、物種交叉熒光原位雜交、纖維原位雜交等。在圖像與信號分析方面，應(yīng)用高分辨率CCD攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)獲得廣泛應(yīng)用，而SKY結(jié)合傅立葉頻譜技術(shù)，同時(shí)計(jì)量可見光和

8、近紅外范圍內(nèi)的所有點(diǎn)的發(fā)射頻譜而一次成像。第九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交結(jié)果Journal of Cell Science 2003；116 （14）第十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月FISH的應(yīng)用在產(chǎn)前診斷方面，F(xiàn)ISH主要用于染色體數(shù)目異常的診斷，與常規(guī)核型分析的一致性可以達(dá)到99.5，但結(jié)果報(bào)告時(shí)間只要24小時(shí)，大大低于核型分析的平均2周左右的報(bào)告時(shí)間，F(xiàn)ISH在多數(shù)的發(fā)達(dá)國家已經(jīng)批準(zhǔn)為常規(guī)產(chǎn)前篩查輔助診斷技術(shù)。在血液腫瘤的診斷方面，F(xiàn)ISH用于染色體異位的融合基因檢測、基因缺失檢測、微小殘留病灶監(jiān)測、骨髓移植監(jiān)測等。在感染性疾病檢測方面，F(xiàn)ISH

9、檢測痰液標(biāo)本中銅綠假單飽菌、流感嗜血桿菌等常見菌的敏感性可以達(dá)到90，特異性1009。對于軍團(tuán)菌、幽門螺旋桿菌和結(jié)核桿菌等較難培養(yǎng)鑒定的細(xì)菌，F(xiàn)ISH在快速診斷上也顯示了很好的應(yīng)用前景。在實(shí)體腫瘤的應(yīng)用中，F(xiàn)ISH可以檢測任何組織類型的染色質(zhì)和基因的異常，廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤的腫瘤的輔助診斷，療效檢測、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷。FISH用于藥物靶向性基因表達(dá)狀態(tài)的檢測。在乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗(赫賽汀)治療有效性患者篩選中，F(xiàn)ISH被認(rèn)為是檢測HER2基因表達(dá)狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。第十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月生物芯片技術(shù)生物芯片（Biochip）是通過微加

10、工技術(shù)和微電子技術(shù)將大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗體，甚至細(xì)胞或組織等生物大分子，按照矩陣方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固項(xiàng)支持物上，或者整合微流體技術(shù)以及微電級、為傳感器等制備的類似于電子行業(yè)的芯片樣產(chǎn)品的檢測技術(shù)。固化的探針分子與熒光標(biāo)記的相應(yīng)樣本進(jìn)行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)掃描分析及計(jì)算機(jī)軟件分析，達(dá)到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技術(shù)可以根據(jù)功能的不同分為微陣列芯片（Microarray chip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實(shí)驗(yàn)室（LAB-on-chip, LOC）。第十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月生物芯片技術(shù)微

11、陣列芯片：早期的微陣列芯片（Microarray）單指基因芯片（gene chip，DNA chip），但隨著蛋白芯片（protein chip）以及糖類芯片（glycan chip）的出現(xiàn)，Microarray逐漸被稱為微陣列芯片，強(qiáng)調(diào)將大量探針有序固化在固相支持物上的檢測方法，而根據(jù)探針種類的不同可以分為基因芯片、蛋白芯片及糖類芯片。生物芯片技術(shù)可以根據(jù)功能的不同分為微陣列芯片（Microarray chip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實(shí)驗(yàn)室（LAB-on-chip, LOC）。微流控芯片：是在幾平方厘米的單晶硅片、石英、玻璃或有機(jī)聚合物等材料上刻制微通道，實(shí)現(xiàn)樣本預(yù)

12、處理、反應(yīng)、分離和檢測的微型檢測平臺，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各種小分子分析和鑒定 芯片實(shí)驗(yàn)室：是在微流控芯片基礎(chǔ)上發(fā)展了更為復(fù)雜的分析系統(tǒng)，將微機(jī)電技術(shù)于微流體技術(shù)相結(jié)合，將所需的反應(yīng)均集中在一塊芯片上，建立微型分析系統(tǒng)（Micro total analytical system，u-TAS） 第十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月微陣列芯片分析流程第十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白芯片技術(shù)第十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月糖組芯片技術(shù)第十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月微流控芯片技術(shù)第十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022

13、年6月AFP-L3流控芯片第十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月芯片技術(shù)的應(yīng)用目前生物芯片可以應(yīng)用的范圍包括：病原體的快速檢測、亞型分析及耐藥性檢測；腫瘤的分類、分期與篩查；遺傳性疾病的診斷于篩查；自身免疫性疾病的診斷等等。國外的生物芯片開發(fā)較早，許多成熟的生物芯片的檢測平臺已逐漸應(yīng)用于臨床，例如美國Osmetch公司的e-SensorCF test（檢測Cystic fibrosis ）和RocheAffymetrix的CYP450芯片（檢測藥物代謝相關(guān)基因CYP2D6和CYP2C19），Agendia公司的Mammaprint芯片（檢測乳腺癌相關(guān)基因），這三種芯片均已獲得美國FD

14、A的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室 第十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月sFDA注冊主要分子診斷產(chǎn)品（國內(nèi)企業(yè)）第二十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于擴(kuò)增基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RAN技術(shù)的發(fā)展。在之后的20多年里，擴(kuò)增DNA的技術(shù)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。目前缺乏統(tǒng)一的核酸擴(kuò)增技術(shù)的分類，但根據(jù)DNA被擴(kuò)增的過程中是變溫還是恒溫方式，可以將核酸擴(kuò)增技術(shù)分為兩類，溫度循環(huán)式的擴(kuò)增

15、技術(shù)，以常規(guī)（conventional PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR，RT-PCR）為主，等溫方式的擴(kuò)增技術(shù)，以核酸序列擴(kuò)增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（Transcription-mediated amplification，TMA），環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技術(shù)為主。 第二十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月溫度循環(huán)式的擴(kuò)增技術(shù)常規(guī)PCR：在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物進(jìn)行電泳或雜交等方式的分析，因此

16、與其他技術(shù)的結(jié)合衍生出多種分析方法，例如PCR結(jié)合限制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）、PCR結(jié)合特異性寡合苷酸探針斑點(diǎn)雜交（PCR-ASO）、PCR結(jié)合變性梯度凝膠（PCR-DGGE）、PCR結(jié)合的單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）等分析技術(shù)。 RT-PCR：病原體的多重PCR（Multiplex PCR），提高敏感性和特異性的巢式PCR（nested PCR），研究基因表達(dá)的原位PCR（in situ PCR），分析RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以及錨定PCR、不對稱PCR、膜結(jié)合PCR等等。 第二十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月不同方式的PCR技術(shù)名稱主要用途簡并

17、引物擴(kuò)增法擴(kuò)增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變多重PCR同時(shí)檢測多個(gè)突變或病原反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴(kuò)增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴(kuò)增未知cDNA原位PCR研究基因表達(dá)錨定PCR分析具備不同末端的序列第二十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月加熱變性冷卻粘合擴(kuò)增連接酶融合冷卻聚合酶+dNTP連接酶點(diǎn)突變的研究、微生物病原體的檢測及定向誘變、單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷、微生物種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究連接酶鏈反應(yīng)第二十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月等溫方式的擴(kuò)增技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增

18、技術(shù)主要包括，核酸序列擴(kuò)增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（Transcription-mediated amplification，TMA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈置換擴(kuò)增法（strand displacement amplification，SDA）、滾環(huán)擴(kuò)增法（Rolling Crile Amplification，RCA）、復(fù)制酶擴(kuò)增QB等。 第二十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月等溫方式的擴(kuò)增技術(shù)NASA

19、B：通過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RnaseH三種酶的協(xié)同作用為核酸擴(kuò)增提供動(dòng)力，逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，生成的RNA-DNA，產(chǎn)物被RnaseH分解為單鏈DNA，引物2結(jié)合DNA，再在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成雙鏈DNA，雙鏈DNA上引物攜帶的T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA又可以生成DNA，使反應(yīng)循環(huán)發(fā)生；TMA：使用逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶，在反應(yīng)中同時(shí)利用逆轉(zhuǎn)錄酶酶的逆轉(zhuǎn)錄活性和Rnase活性，反應(yīng)動(dòng)力的維系與NASBA類似：LAMP：技術(shù)是利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)動(dòng)力；SDA：是應(yīng)用DNA聚合酶的53核酸外切酶活性從雙鏈DNA上的缺

20、口處開始合成新鏈，剝離舊鏈，當(dāng)缺口重復(fù)產(chǎn)生時(shí)，切割延伸鏈置換的過程循環(huán)進(jìn)行，目的片段被擴(kuò)增；RCA：利用環(huán)狀DNA與強(qiáng)鏈置換活性的29DNA聚合酶為DNA延伸提供動(dòng)力 第二十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月NSAB操作簡便不需特殊儀器不需溫度循環(huán)循環(huán)次數(shù)少忠實(shí)性高特異性好擴(kuò)增效率高于標(biāo)準(zhǔn)PCR第二十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月TMA第二十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月以擴(kuò)增為基礎(chǔ)的方法的臨床應(yīng)用DNA或RNA的擴(kuò)增技術(shù)，最直接的優(yōu)勢是在較短的時(shí)間內(nèi)將目的基因的拷貝數(shù)大量擴(kuò)增，具有很高的靈敏度，同時(shí)特異性的引物保證了較高的特異性。因此，在分子診斷技術(shù)中基

21、于擴(kuò)增的技術(shù)，特別是熒光定量PCR技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用最為廣泛。PCR技術(shù)可以準(zhǔn)確的定量感染性疾病病原體，不論是真菌、細(xì)菌和病毒以及寄生蟲的感染都可以應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)加以檢測，同時(shí)同一種病原體可以買到多種擴(kuò)增原理的商業(yè)化檢測試劑。目前在sFDA注冊的應(yīng)用PCR方法的體外診斷試劑已達(dá)到190余種，成為病原體和基因表達(dá)與突變檢測的最主要的試劑。為提高PCR的檢測通量，新進(jìn)發(fā)展的多重PCR技術(shù)以及多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex ligation-dependent Probe amplification，MLPA）可以一次在同一樣本中同時(shí)檢測多種病原體，最大可同時(shí)擴(kuò)增45個(gè)目的片段。同時(shí)，對

22、PCR產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線分析，為基因分型和突變掃描提供了新的手段?？梢灶A(yù)見PCR技術(shù)仍將主導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室感染性病原體的檢測，細(xì)菌的耐藥基因檢測，腫瘤個(gè)體化治療的主要檢測工具。 第二十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于測序基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用人類基因組計(jì)劃的出現(xiàn),使人們面臨了巨大的經(jīng)費(fèi)問題,因?yàn)閭鹘y(tǒng)的Sanger測序法無論如何優(yōu)化,也無 法大幅度降低測序費(fèi)用;人類以及其它主要模式生物參考序列數(shù)據(jù)庫的建立使得短片段作圖成為可能,這極大地促進(jìn)了短片段測序技術(shù)的發(fā)展;不斷涌現(xiàn)的新型分子生物學(xué)技術(shù)極大地促進(jìn)了分子生物學(xué)的發(fā)展,隨之而來的越來越多的比如基因變異、RNA表達(dá)、蛋白與DN

23、A相互作用以及染色體構(gòu)象等等生物學(xué)現(xiàn)象需要人們用高通量DNA測序手段去解釋,這也極大地促進(jìn)了新型測序技術(shù)的發(fā)展;其它學(xué)科、各項(xiàng)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,例如顯微鏡技術(shù)、表面化學(xué)技術(shù)、核苷生化技術(shù)、聚合酶工程技術(shù)、 計(jì)算機(jī)技術(shù)、數(shù)據(jù)儲存及分析技術(shù)等,為DNA測序技術(shù)提供了極大的支持。測序技術(shù)發(fā)展的動(dòng)力第三十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月新一代測序儀美國Roche Applied Science公司的454基因組測序儀美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀美國Applied Biosystems公司的 SOLiD測序儀Dover/Ha

24、rvard公司的Polonator測序儀美國Helicos公司的HeliScope單分子測序儀第三十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月新一代測序原理新的測序策略循環(huán)芯片測序法(cyclic-array sequencing)循環(huán)芯片測序法,簡言之就是對布滿DNA樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于DNA的聚合酶反應(yīng)(模板變性、 引物退火雜交及延伸)以及熒光序列讀取反應(yīng)與傳統(tǒng) 測序法相比,循環(huán)芯片測序法具有操作更簡易、費(fèi)用更低廉的優(yōu)勢第三十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月新一代測序儀的特點(diǎn)體外構(gòu)建DNA文庫,隨后體外克隆擴(kuò)增待測DNA片段,這就解決了傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)中好幾個(gè)限制 平行測序規(guī)模的瓶頸問題,比如轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及陽性克隆挑選等問題;基于芯片的測序方式能極大地提高平行測序的能力。由于每一個(gè)待測DNA片段克隆的直徑都不到 1m,因此可以在芯片上同時(shí)對上億個(gè)待測DNA片段進(jìn)行測序。因?yàn)槊恳粋€(gè)待測DNA片段克隆都固定在芯片上的固定位置,因此可以一次對芯片上的所有片段進(jìn)行測 序,而只需要使用幾微升的酶等反應(yīng)試劑,這就相當(dāng)于每一個(gè)待測片段只使用了幾皮升(picoliter)或 幾飛升(femtoliter)的反應(yīng)試劑,從而極大降低了測序反應(yīng)的費(fèi)