第四章 分子標(biāo)記技術(shù)及其在海洋生物研究中的應(yīng)用

1、第四章PCR技術(shù)在海洋生物研究(ynji)中的應(yīng)用共八十五頁P(yáng)CR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng) 1985年，美國科學(xué)家Kary Mullis經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎。最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高，使該技術(shù)成為遺傳與分子生

2、物學(xué)分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量(dngling)測定；從原先只能擴(kuò)增幾個kb的基因到目前已能擴(kuò)增長達(dá)幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多 共八十五頁P(yáng)CR的基本原理PCR的基本工作(gngzu)原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過不斷重復(fù)這一過程，可以使目的DNA片段得到擴(kuò)增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使DNA的合成量呈指數(shù)型增長。 共八十五頁 P

3、CR技術(shù)(jsh)原理示意圖共八十五頁P(yáng)CR技術(shù)的主要(zhyo)類型 巢式PCR 彩色PCR 多重PCR 原位PCR 不對稱PCR 定量PCR 錨定(mo dn)PCR 差異顯示PCR 反向PCR 重組PCR共八十五頁生物(shngw)樣品DNA片段(pin dun)基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究PCR技術(shù)的應(yīng)用共八十五頁procedurestemplate(DNA or RNA),primers,Taq enzyme,10PCR buffer,Mg+,5mmol/L dNTPspre-denaturation-denature completelyDenaturation

4、annealingElongationcycles:25-30共八十五頁P(yáng)CR optimization變性溫度和時間92-95，富含G和C的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。退火溫度與時間引物中G、C含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55、1-2分鐘。延伸溫度和時間溫度：72，接近Taq酶的最適75時間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)過多(u du)，非特異性產(chǎn)物大量增加共八十五頁分子(fnz)標(biāo)記共八十五頁分子(fnz)標(biāo)記的概念 廣義的分子標(biāo)記(molecular mar

5、ker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一(tngy)基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納： 能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。共八十五頁分子標(biāo)記(bioj)的種類 分子標(biāo)記大多(ddu)以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymo

6、rphism, 簡稱RFLP標(biāo)記）；DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）；原位雜交（in situ hybridization）等；共八十五頁 第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction ,簡稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplification polymorphism DNA, 簡稱RAPD標(biāo)記）；簡單(jindn)序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標(biāo)記）或簡單(jindn)序列長度多態(tài)性（Simple sequence length polymo

7、rphism, 簡稱SSLP標(biāo)記）；擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP標(biāo)記）；序標(biāo)位點(diǎn)（Sequence tagged sites, 簡稱STS標(biāo)記）；序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, 簡稱SCAR標(biāo)記）等；共八十五頁第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如：單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism, 簡稱SNP標(biāo)記）；表達(dá)(biod)序列標(biāo)簽（Expressed sequences tags, 簡稱EST標(biāo)記）等。共八十五頁

8、分子標(biāo)記(bioj)的特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)(jji)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。共八十五頁幾種分子(fnz)標(biāo)記（一）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。 特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限

9、制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入(ch r)和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。共八十五頁EcoR酶切示意圖5 AGGAATTCGAATTCGAATTCCG 33 TCCTTAAGCTTAAGCTTAAGGC 5 AGG AATTCG AATTCG AATTCCG TCCTTAA GCTTAA GCTTAA GGC共八十五頁RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有

10、：（1）遍布于整個基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定(wndng)、可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。共八十五頁（ 二） 隨機(jī)(su j)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)由Williams等于1990年創(chuàng)立。RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個（有時用兩個）隨機(jī)引物（一般8-10個堿基）非定點(diǎn)地擴(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致(dozh)引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致

11、(dozh)PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。 共八十五頁親本中國春小麥、節(jié)節(jié)(ji ji)麥雙倍體和子代的RAPD電泳圖譜 引物為S516: CTCTGCGCGT 泳道1為中國(zhn u)春小麥，泳道2、二者的子代，泳道3為節(jié)節(jié)麥。 共八十五頁RAPD擴(kuò)增克隆魚(B)、供體紅鯉(A)、受體金魚(jny)(D)和雜交魚(C，即AxD)的細(xì)胞核DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，對于不同的引物，克隆魚的擴(kuò)增譜帶均和供體紅鯉的一致，迥異于受體金魚(jny)和雜交魚。共八十五頁RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）不需DNA探針，設(shè)計引物也無須知道序列信息；（2）顯

12、性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及(shj)分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 共八十五頁（三）簡單(jindn)序列重復(fù)標(biāo)記，SSR又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多(ddu)幾十幾百bp，分散在基因組中，大多(ddu)不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個位點(diǎn)。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAG

13、CAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG共八十五頁微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果(ji gu)（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查(jinch)的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。共八十五頁SSR標(biāo)記(bioj)的主要特點(diǎn)（1）數(shù)量(shling)豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。 共八十五頁（四）單核苷酸多態(tài)性(single nu

14、cleotide polymorphism SNP) 單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 不同(b tn)個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。共八十五頁SNP在人類基因組中出現(xiàn)(chxin)的頻率 SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達(dá)1700萬個甚至更多。 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding sNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但

15、它在遺傳性疾病研究中卻具有(jyu)重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。共八十五頁日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)(fxin)糖尿病基因的個人SNP差別日本研究人員(rnyun)最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。 共八十五頁（五） AFLP標(biāo)記(bioj)AFLP：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism） AFLP技術(shù)是1992年由荷蘭Keygene公司的科學(xué)家Zabeau Mare和Vos Pieter發(fā)明(fmng)并發(fā)展起來的一種選擇擴(kuò)增限制酶切片段的方法。共八十五頁AFLP

16、的基本原理基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化形成相對分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段(pin dun)，隨后將特定的接頭連接在這些DNA片段(pin dun)兩端，接頭序列和鄰近限制性酶切位點(diǎn)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過PAGE分離擴(kuò)增的特異限制性片段(pin dun)。在不需要DNA序列的情況下，利用一套特定引物可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段(pin dun)。共八十五頁AFLP的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）少量引物可獲得較多標(biāo)記，50-150條帶（2）多為顯性標(biāo)記或共顯性標(biāo)記，受環(huán)境影響小，無復(fù)等位效應(yīng)（3）帶型清晰，具高分別率（4）由于用兩種引物經(jīng)兩步選擇擴(kuò)增，帶型穩(wěn)定，帶紋豐富，靈敏度高，

17、重復(fù)性好（5）不需事先知道DNA序列信息缺點(diǎn)：操作復(fù)雜(fz)，費(fèi)用較高共八十五頁標(biāo)記系統(tǒng)在應(yīng)用(yngyng)時的選擇RFLPRAPDAFLPSSRSNP遺傳特性共顯性顯性顯性/共顯性共顯性顯性/共顯性多態(tài)性低中等高高低檢測基礎(chǔ)分子雜交隨機(jī)PCR專一PCR專一PCR專一PCR檢測基因組部位單/低拷貝整個基因組整個基因組重復(fù)序列區(qū)整個基因組技術(shù)難度難易易易易DNA質(zhì)量高低低低低DNA用量5-10g50ng50ng50ng50ng使用同位素是否是/否否否探針DNA短片段隨機(jī)引物專一引物專一引物專一引物費(fèi)用中等低高高高共八十五頁P(yáng)rimer Premier 5共八十五頁P(yáng)rimer Premier

18、5.0簡介PRIMER PREMIER 是一種用來幫助研究人員設(shè)計最適合引物的應(yīng)用軟件，利用它的高級引物搜索，引物數(shù)據(jù)庫，巢式引物設(shè)計，引物編輯(binj)和分析等功能可以設(shè)計出有高效擴(kuò)增能力的理想引物，也可以設(shè)計出用于擴(kuò)增長達(dá)50kb以上的PCR產(chǎn)物的引物序列共八十五頁P(yáng)rimer Premier5.0簡介該軟件主要由以下五個主要功能板塊組成GeneTank（序列編輯）Primer（引物設(shè)計(shj)）Align （序列比較）Enzyme （酶切分析）Motif （基序分析）共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁共八十五頁凝膠電泳共八十五頁共八十五頁

19、應(yīng)用(yngyng)1共八十五頁材 料 161218182061P02007 P02007 P02001?03003 03014 03019 03027 03034 03157中國對蝦(duxi)家系系譜鑒定16P02007 P02007 P02001?03003 03014 03019 03027 03034 03157共八十五頁1-7, 9-15為03027家系子代(zdi)個體；8為雌性親本EN0033基因座在03027家系的擴(kuò)增結(jié)果結(jié) 果共八十五頁1-2, 5-15為03157家系子代個體(gt)；3，4分別為雌、雄親本RS0622基因座在03157家系的擴(kuò)增結(jié)果共八十五頁基因座P02

20、007P02007 P020010300303014030190302703034030340315703157RS06221/42/53/31/21/51/21/34/51/31/31/3EN0033c/da/eb/fc/ea/da/ca/fa/da/ba/ba/f檢測(jin c)親本基因型共八十五頁基因座基因型頻率等位基因頻率030030301403019030270303403157RS06223(1/1)4(1/4)5(1/1)6(1/1)5(1/4)9(1/1)10.448350.06553(1/2)3(1/5)3(1/2)8(1/3)7(1/5)40(1/3)20.05525(1

21、/3)5(4/5)5(1/3)4(3/3)4(3/4)12(3/3)30.37245(2/3)5(2/3)4(3/5)40.0621EN00334(a/c)2(a/a)2(a/a)7(a/a)6(a/a)13(a/a)a0.4931e0.02413(a/e)7(a/d)8(a/c)4(a/b)5(a/b)16(a/b)b0.1345f0.19315(c/f)3(d/d)2(a/f)5(a/f)9(a/d)20(a/f)c0.07934(e/f)6(c/f)2(b/f)12(b/f)d0.0759檢測(jin c)子代基因型及等位基因頻率共八十五頁基因座03003030140301903027R

22、S06221/34/51/31/3EN0033a/fa/da/fa/b推測(tuc)4家系缺失親本的基因型 共八十五頁各家系間的親緣(qn yun)關(guān)系祖父母代父母代雜交一代自交二代P02007 P02007 0300303019030140303403014030030301903034030140302703157P02001 P02001 03027031570300303019030270315703034共八十五頁應(yīng)用(yngyng)2共八十五頁微衛(wèi)星標(biāo)記(bioj)與WSSV抗性的相關(guān)分析材 料F2家系個體(gt) 163尾共八十五頁口飼感染(gnrn)病毒檢測：巢式PCR連鎖分析

23、同前方 法共八十五頁結(jié) 果攻毒對蝦(duxi)共八十五頁 巢式PCR檢測(jin c)第一次擴(kuò)增條帶 結(jié) 果共八十五頁巢式PCR檢測(jin c)第二次擴(kuò)增條帶 結(jié) 果共八十五頁死亡個體存活時間頻率(pnl)分布 結(jié) 果共八十五頁2，4，5，6，8，9，10，11，12，13，15，19為AA基因型；1，7，14，17，18為AB基因型；3，16為BB基因型EN0033基因座的擴(kuò)增結(jié)果(ji gu) 結(jié) 果共八十五頁1，5，6，8，18為AA基因型；2，3，4，7，10，12，13，14，15，17，19為AB基因型；9，11，16為BB基因型EN0018基因座的擴(kuò)增結(jié)果(ji gu) 結(jié) 果

24、共八十五頁4，9，13，14，16為AA基因型；1，3，5，7，10，12，15，19為AB基因型；2，6，8，11，17，18為BB基因型RS0622基因座的擴(kuò)增結(jié)果(ji gu)結(jié) 果共八十五頁LocusFPEN00330.2920.748RS11010.5770.564RS06760.5360.659FC0120.7420.530EN00181.1820.312RS06225.2330.007RS06830.0740.929FC0290.5100.677FC0150.2140.645FC0300.5110.676FC0310.0130.908FC0080.5350.660FC0211.1

25、590.319FC0270.1030.958IOPC040.2830.754FC0280.6000.551FC0190.7400.480FC0020.2040.653各微衛(wèi)星座位對性狀(xngzhung)影響顯著性檢驗(yàn)共八十五頁基因型數(shù)量平均存活時間BB196.84aAB448.61aAA1710.31b影響(yngxing)顯著的微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型性狀比較共八十五頁RS0683， FC019兩個微衛(wèi)星位點(diǎn)與控制體長、全長、體重的基因(jyn)座位緊密連鎖， RS0622位點(diǎn)與控制WSSV抗性的基因(jyn)座位緊密連鎖共八十五頁應(yīng)用(yngyng)3共八十五頁作圖-群體(qnt) 單倍體群

26、體F1群體回交(hu jio)群體重組近交系F2群體等 共八十五頁作圖-工具(gngj)(1) Linkage (2) Map Manager (3) MAPMAKER/EXP (4) JoinMap (5) MapQTL 共八十五頁RAPD引物篩選(shixun) 共八十五頁連鎖(lin su)圖譜 1共八十五頁P(yáng)1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28AFLP引物C5(AGA+CGA)擴(kuò)增位點(diǎn)在中國(zhn u)對蝦親本及子代中的分離情況 。經(jīng)過2檢驗(yàn)是否(sh fu)符合1

27、:1或3:1分離規(guī)律 共八十五頁連鎖(lin su)圖譜 2共八十五頁應(yīng)用4遺傳(ychun)距離中國(zhn u)對蝦5個家系的遺傳距離和相似性指數(shù)家系Family1#2#3#4#5#1#*0.69870.47670.58490.25902#0.3585*0.58960.64920.50333#0.74090.5283*0.5920.71124#0.53640.43200.5243*0.35645#1.35090.68650.34081.0316*共八十五頁中國(zhn u)對蝦5個家系的UPGMA圖 共八十五頁應(yīng)用(yngyng)5家系識別（2）家系混養(yǎng)，體外注射(zhsh)標(biāo)記傳統(tǒng)選育（

28、1）將個體或家系分池培養(yǎng)共八十五頁缺 點(diǎn)：1. 需要大量養(yǎng)殖池、相關(guān)(xinggun)設(shè)施和勞動力投入。2. 環(huán)境影響，無法保證(bozhng)家系性狀參數(shù)估計。4. 遺傳背景不清，親緣關(guān)系不明，易造成近交3. 幼體階段標(biāo)記難度非常大共八十五頁位點(diǎn)數(shù)目鑒定能力（Z）鑒定能力（L）Excl 1Excl 2Excl 1Excl 2145.0%62.7%44.0%61.7%285.1%94.2%84.0%93.7%391.7%97.8%91.0%97.6%495.3%99.1%94.2%98.9597.1%99.6%96.4%99.5%699.2%99.9%98.5%99.9%799.5%100.0%99.1%100.0%899.8%100.0%99.3%100.0%兩類群體(qnt)模擬結(jié)果比較共八十五