乙肝病毒核酸檢測實驗操作流程課件

1、乙肝病毒核酸檢測實驗操作流程廣西臨床檢驗中心 唐 娟主要內(nèi)容HBV-DNA的檢測原理HBV-DNA操作流程 HBV-DNA檢測結果分析臨床意義DNA 提取PCR 擴增標本采集檢測原理HBV ： 用一對乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種脫氧核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴增法定量檢測乙型肝炎病毒DNA原理圖每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個熒光信號信號強度與結合探針的DNA分子數(shù)成正比操作流程一、標本采集一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管室溫（

2、2225C）放置3060 分鐘血標本使用水平離心機，4000轉/分離心5分鐘吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管 血清的采集血漿的采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA或枸櫞酸鈉抗凝劑的試管立即輕輕顛倒玻璃管混合510次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻510分鐘后即可分離出血漿，轉移至1.5ml滅菌離心管注意事項盡量吸取血清的上層液，有纖維蛋白的標本應離心去除脂類渾濁標本拒收（離心4000rpm，5min）血清血清不能使用肝素抗凝因為對PCR擴增有抑制作用，且很難在核酸提取過程中完全去除血漿二.HBV-DNA的提取打開HBV-DNA試劑盒取出DNA濃縮液、 DNA提取液（置

3、室溫融解，充分混勻）取已滅菌的1.5ml離心管并按樣本唯一編號加入DNA濃縮液和待測樣本各100ul（振蕩混勻）12000rpm，離心10min去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振蕩混勻） （陰、陽性質(zhì)控品處理方法：各取50ul，分別加入DNA提取液各50ul）100恒溫干浴10min12000rpm離心5min注意事項1.加入等體積的濃縮液后請用震蕩器劇烈震蕩混勻。不能用移液器混勻2.標本12000rpm離心時一定要統(tǒng)一離心管擺放方向。離心后應沿著沉淀存在的對側緩緩吸去上清，槍頭貼管壁順著液面下移，防止帶走不可見的沉淀物。如沉淀不明顯可以保留少量液體，建議將移液器量程調(diào)至190ul一

4、次性吸取。注意事項3.濃縮離心后若出現(xiàn)有“絮狀懸浮物”，去上清時應一并把“絮狀懸浮物”吸除，不影響實驗結果。如不吸取絮狀懸浮物會導致實驗結果偏低。4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混勻),并用震蕩器劇烈震蕩混勻20秒后,瞬時離心。5.裂解溫度要確保有1001，裂解時間10min1三.PCR 擴增步驟取上清液2ul點樣8000rpm離心數(shù)秒按順序放進擴增儀微孔中編輯軟件，設置循環(huán)條件保存文件，運行 注意：吸取上清液中上層2ul進行加樣，不要吸取到沉淀。循環(huán)條件循環(huán)次數(shù)、溫度93 2分鐘 93 45秒55 60秒10個循環(huán)93 30秒55 45秒30個循環(huán)結果分析1.2.結果讀取3.結果報告結果的報告必須簡單清楚定量測定則必須報告量的多少 1、結果高于測定方法線性范圍上限，可報告多少；也可對樣本稀釋后再測，結果乘以稀釋倍數(shù) 2、結果低于方法的測定范圍下限，則報告多少即可，不能報告“0”或陰性臨床意義1、診斷早期乙型肝炎，提高HBV檢測陽性率。2、判斷HBV的傳染性及病毒復制情況，綜合血清學指 標，為臨床提供