CE概述、原理-PPT精選課件

1、高效毛細(xì)管電泳技術(shù)概述電泳的發(fā)展歷史 電泳是一種帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的現(xiàn)象。電泳現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)得很早，但將這種現(xiàn)象用于生物化學(xué)領(lǐng)域，尤其是臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域卻是近幾十年的事。20世紀(jì)6070年代，當(dāng)濾紙、聚丙烯酰胺凝膠等介質(zhì)相繼引入電泳以來(lái)，電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。豐富多彩的電泳形式使其應(yīng)用十分廣泛。電泳的發(fā)展歷史 電泳技術(shù)除用于小分子物質(zhì)的分離分析外，最主要用于蛋白質(zhì)、核酸、酶、甚至病毒與細(xì)胞的研究。由于電泳技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、高分辨率及選擇性等優(yōu)點(diǎn)，電泳技術(shù)的種類逐漸增加，手段與儀器日趨完善，以致現(xiàn)在己成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)常規(guī)分析、教學(xué)和科研中不可缺少的“常規(guī)武器”。電泳的發(fā)展歷史 1809年，俄國(guó)物

2、理學(xué)家 Reuss 進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)。他用兩根玻璃管插入一塊濕粘土中，容器灌滿水，管底放一層沙，然后封閉起來(lái)并通電。其結(jié)果是連接陽(yáng)極的管中的水由于膠體粘土顆粒通過(guò)沙層的電泳遷移而變得混濁，而連接陰極的管中的水變得清澈，并且增加了體積，顯示了電滲（electro-osmosis）現(xiàn)象。1909年Michaelis把膠體離子在電場(chǎng)中的遷移定名為“電泳（electrophoresis）”。 電泳的發(fā)展歷史 從19世紀(jì)初到 20世紀(jì)中的 150年中，早期電泳技術(shù)雖然得到了發(fā)展，但由于移界電泳裝置比較昂貴，而且分辨率有限，同時(shí)因?yàn)槿芤菏軣岷蟀l(fā)生密度變化，產(chǎn)生對(duì)流，使區(qū)帶擾亂，故在 20 世紀(jì)

3、50 年代以后又發(fā)展了支持物電泳，如濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、淀粉凝膠電泳、免疫電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)。電泳的發(fā)展歷史 這些方法，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，有很高的分辨率和選擇性，所分離成分的檢出可利用染色、紫外吸收、放射性測(cè)定、生物活性測(cè)定等，有高的靈敏度，特別是20世紀(jì)70年代后一些自動(dòng)化儀器的相繼出現(xiàn)與應(yīng)用，使得電泳技術(shù)在生化研究和臨床生化檢驗(yàn)方面發(fā)揮了巨大作用。電泳的發(fā)展歷史 20世紀(jì)2030年代，電泳技術(shù)的理論與實(shí)踐有了很大發(fā)展。瑞典 Uppsala 大學(xué)的物理化學(xué)教授Svedberg和他的同事利用在長(zhǎng)波紫外光激發(fā)時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)綠色熒光的現(xiàn)象，在電泳過(guò)程中對(duì)卵白蛋白進(jìn)行照相。電泳的

4、發(fā)展歷史 1937年Tiselius教授建立了移界電泳法（moving boundary electrophoresis），并利用其修改的U型電泳槽和電極裝置首先證明了血清是由白蛋白、和球蛋白組成的，為此他于1948年榮獲了諾貝爾獎(jiǎng)。移界電泳技術(shù)的應(yīng)用改變了許多陳舊的觀念，使與蛋白質(zhì)有關(guān)的研究更加深入，極大地促進(jìn)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。 電泳的發(fā)展歷史 以下列出電泳技術(shù)和裝置的發(fā)展簡(jiǎn)史。不難看出電泳技術(shù)和裝置是物理學(xué)家、化學(xué)家、物理化學(xué)家、生理學(xué)家和生化學(xué)家們等經(jīng)過(guò)許多代人的共同努力才得以不斷發(fā)展與成熟。 電泳的發(fā)展歷史1809年Reuss進(jìn)行第一次電泳實(shí)驗(yàn)19231924年Svedber

5、g在電泳時(shí)對(duì)帶熒光的白蛋白照相1937年Tiselius建立移界電泳，并將血清分離成白蛋白和球蛋白， 被稱為“電泳之父”，并于1948年獲諾貝爾獎(jiǎng)1939年Svensson使用圓柱形透鏡系統(tǒng)1939年Konig報(bào)告了用濾紙作介質(zhì)電泳分離蛇毒黃色色素的方法1948年Svensson提出了pH梯度理論1953年Grabar和Williams使用免疫電泳1959年Raymond和Weintraub使用聚丙烯酰胺凝胺作為電泳支持介質(zhì)1961年Svesson提出兩性電解質(zhì)理論基礎(chǔ) 1963年Hjerten進(jìn)行不連續(xù)電泳1963年Fazekas將考馬斯亮藍(lán)用于紙、瓊脂等的染色1965年Meyer將考馬斯亮

6、藍(lán)用于聚丙烯酰胺凝膠染色1966年瑞典LKB公司獲得Ampholine專利電泳的發(fā)展歷史1967年Shapiro進(jìn)行SDS電泳1970年Laemm1i進(jìn)行不連續(xù)SDS電泳1970年Helena公司設(shè)計(jì)推出快速掃描密度儀（quick scan densitometer）1972年Laurell進(jìn)行火箭電泳1973年瑞典LKB公司推出水平電泳槽Multiphor I1975年Southern提出Southern Blot （DNA印跡法）1975年Farell提出聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳1979年Towbin提出Western Blot（蛋白質(zhì)印跡法）1979年Merril、Switzer應(yīng)用銀染色

7、法1985年Mocremans應(yīng)用金染色法1986年瑞典Pharmacia公司發(fā)明半干技術(shù)1989年Beckman公司P/ACE高效毛細(xì)管電泳儀誕生1994年Beckman公司P/ACE 5000高效毛細(xì)管電泳儀問(wèn)世2019年Beckman公司P/ACE MDQ系列產(chǎn)品出現(xiàn)高效毛細(xì)管電泳概述 電泳分離是依據(jù)電場(chǎng)中溶質(zhì)不同的遷移速率。在高效毛細(xì)管電泳（HPCE）中，電泳是在細(xì)毛細(xì)管中進(jìn)行，管內(nèi)徑一般在25到75m之間，管內(nèi)通常只充有緩沖液。使用毛細(xì)管有許多優(yōu)點(diǎn)，尤其是考慮到焦耳熱的不利影響。毛細(xì)管的高電阻能夠在使用很高電場(chǎng)（100500V/cm）時(shí)只產(chǎn)生很少的熱量。而且毛細(xì)管很大的表面積/體積比

8、能使產(chǎn)生的熱有效地?cái)U(kuò)散。高效毛細(xì)管電泳概述 采用高電場(chǎng)導(dǎo)致了分析時(shí)間短、效率和分離度高。柱效率常常超過(guò)105理論塔板數(shù)，這部分是由于電滲流的塞狀流型。電滲流是電泳中的一個(gè)現(xiàn)象，它引起溶液在毛細(xì)管內(nèi)的整體流動(dòng)。它也使所有溶質(zhì)不論其帶電情況的同時(shí)分析成為可能。此外HPCE具有不同分離機(jī)制和選擇性的多種分離模式，很少的樣品需要量（110 nl），柱上檢測(cè)，以及定量分析和自動(dòng)化的潛力，所有這些特點(diǎn)使得HPCE正在迅速成為一種極為有力的分離技術(shù)。高效毛細(xì)管電泳概述 HPCE的一個(gè)主要特點(diǎn)是儀器的整體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。簡(jiǎn)言之，一根細(xì)內(nèi)徑彈性石英毛細(xì)管的兩端置于緩沖液瓶中，瓶?jī)?nèi)溶液與管內(nèi)溶液是相同的。兩個(gè)緩沖液瓶中

9、都放置一個(gè)使高壓電源和毛細(xì)管之間產(chǎn)生電接觸的電極。樣品引入到毛細(xì)管里是通過(guò)用一個(gè)樣品瓶替換一個(gè)緩沖液瓶，并施加電場(chǎng)或者外部壓力而實(shí)現(xiàn)的。重新更換回緩沖液瓶后，施加電場(chǎng)，分離便開始進(jìn)行。光學(xué)檢測(cè)可在毛細(xì)管的另一端直接通過(guò)管壁進(jìn)行。本講義將詳細(xì)討論進(jìn)樣，分離、檢測(cè)、定量分析、儀器和自動(dòng)化分析等等方面的理論和實(shí)踐。電泳與色譜 毛細(xì)管電泳的基本原理就是電泳和色譜。電泳和色譜以不同的原理實(shí)現(xiàn)分離，但卻有許多驚人的相似之處，比較它們的相似性，不僅有趣，而且有助于對(duì)毛細(xì)管電泳的理解。 （1）詞義的雙重性 電泳（electrophoresis）亦叫電遷移（electromigration），其宏觀表現(xiàn)是介質(zhì)的

10、導(dǎo)電。電泳一詞原指帶電粒子在一定介質(zhì)中因電場(chǎng)作用而發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)的物理化學(xué)現(xiàn)象，后來(lái)，電遷移現(xiàn)象被用于物質(zhì)的分離，隨之形成了一系列電泳技術(shù)或方法，這些方法通常也被簡(jiǎn)稱為電泳。與此相仿，色譜（chromatography）一詞不但指物質(zhì)因在兩相中分配（廣義）并運(yùn)動(dòng)而發(fā)生分離或?qū)游龅默F(xiàn)象，而且更經(jīng)常地指運(yùn)用這一現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離分析的技術(shù)手段。電泳與色譜 （2）分離過(guò)程相類 電泳和色譜分離都是速差過(guò)程，可用相同的理論如物質(zhì)傳輸理論來(lái)描述。 （3）分離模式相象 以分離后的區(qū)帶特征為根據(jù)，電泳和色譜可分成對(duì)應(yīng)的四類 ，如表1 ( P 2 ) 所示，其中第一類是其他各類的基礎(chǔ)。 （4）儀器構(gòu)成類同 包括進(jìn)樣

11、，分離，檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理等部分。 （5）分離通道的形狀相類 有薄層、柱子、毛細(xì)管等。電泳與色譜 正是因?yàn)槿绱?，電泳特別是毛細(xì)管電泳通常采用色譜中的一些概念或名詞，比如分離效率（N），理論塔板，保留時(shí)間（tR）等等。也正是因?yàn)槿绱耍?xì)管電泳才能把電泳和色譜統(tǒng)一起來(lái)，變成一種新的方法。 毛細(xì)管電泳分離模式 毛細(xì)管電泳可以分為許多種不同形式，一般根據(jù)它們分離模式將其分為不同的類型，茲將它們列于表 2， P 2, 以供參考。 毛細(xì)管電泳的特點(diǎn) 毛細(xì)管電泳通常使用內(nèi)徑為25100m的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管，標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管的外徑為375m，有些管的外徑為160m。毛細(xì)管的特點(diǎn)是： 容積小（一根100c

12、m75m管子的容積僅4.4l）； 側(cè)面/截面積比大因而散熱快、可承受高電場(chǎng)（1001000V/cm）； 可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)； 在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)毛細(xì)管電泳具備如下優(yōu)點(diǎn)：高效 效率在105106片/m間，CGE效率可達(dá)107片/m以上；快速 幾十秒至十幾分鐘完成分離；微量 進(jìn)樣所需的體積可小到1l，消耗體積在150nl間；多模式 可根據(jù)需要選用不同的分離模式（表1-3）且僅 需一臺(tái)儀器；樣品對(duì)象廣 從無(wú)機(jī)離子到整個(gè)細(xì)胞，具有“萬(wàn)能”分析 功能或潛力；經(jīng)濟(jì) 實(shí)驗(yàn)消耗不過(guò)幾毫升緩沖溶液，維持費(fèi)可用分人 民幣計(jì)算；自動(dòng) CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離方法

13、；潔凈 通常使用水溶液，對(duì)人對(duì)環(huán)境無(wú)害。毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)毛細(xì)管的不足：制備能力差；光路太短，非高靈敏度的檢測(cè)器難以測(cè)出樣品峰；凝膠、色譜填充管需要專門的灌制技術(shù)；大的側(cè)面/截面積比能“放大”吸附的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等的分離效率下降或無(wú)峰；吸附引起電滲變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性等，目前尚難以定量控制電滲。 通過(guò)與雙向電泳（2-DE）和高效液相色譜（HPLC）等的比較，可以對(duì)CE獲得更細(xì)致了解。CE的分離效率、分析速度、消耗、應(yīng)用范圍、定性定量功能等都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)2-DE，但峰容量和制備水平則差得多。和HPLC相比，CE的應(yīng)用面廣得多，效率、峰容量高得多，操作費(fèi)用和環(huán)境污染則低得多，但制備能力也差得多。目

14、前的發(fā)展?fàn)顟B(tài) HPCE是一種迅速發(fā)展的分離技術(shù)，其最大的優(yōu)點(diǎn)之一是應(yīng)用范圍廣泛。最初人們主要考慮它用在生物大分子的分析方面，現(xiàn)在已經(jīng)證明它能用于分離多種化合物，諸如氨基酸、手性藥物、維生素、殺蟲劑、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、染料、表面活性劑、肽和蛋白質(zhì)、糖類、低聚核苷酸和DNA限制性內(nèi)切片段，甚至整個(gè)細(xì)胞和病毒顆粒。 高效毛細(xì)管電泳理論 HPCE可以看作是電泳的一種儀器化方式。通過(guò)利用毛細(xì)管代替平板凝膠所獲得的分離效率方面的提高在許多方面類似于使用柱代替板床方式進(jìn)行色譜分離所產(chǎn)生的效果。另外，HPCE使得分離機(jī)制大大擴(kuò)展，從而拓寬了電泳的應(yīng)用范圍。如今電泳不再局限于分離大分子，它還可以在一次分析中實(shí)現(xiàn)

15、陽(yáng)離子，陰離子以及中性物質(zhì)的同時(shí)分離。高效毛細(xì)管電泳理論 電泳的分離是以電場(chǎng)中溶質(zhì)的速度差異為基礎(chǔ)。一種離子的遷移速度可用下式表示： V=eE （1）其中： V=離子遷移速度 e=電泳淌度 E=電場(chǎng)強(qiáng)度 高效毛細(xì)管電泳理論 電場(chǎng)強(qiáng)度是外加電壓和毛細(xì)管長(zhǎng)度的簡(jiǎn)單函數(shù)（單位為V/cm）。對(duì)于給定的離子和介質(zhì)，淌度是該離子的特征常數(shù)。 何謂淌度？淌度由分子所受的電場(chǎng)力與其通過(guò)介質(zhì)時(shí)所受的摩擦力的平衡所決定。即 電場(chǎng)力（FE） e - （2） 摩擦力（FF）高效毛細(xì)管電泳概述電場(chǎng)力可以寫成： F = q E （3）而摩擦力（對(duì)于球形離子）為： F = 6rv （4）這里： q = 離子電量 = 溶液粘

16、度 r = 離子半徑 v = 離子速度高效毛細(xì)管電泳概述 在電泳過(guò)程中，可以達(dá)到由上兩力的平衡所決定的穩(wěn)態(tài)。此時(shí)，兩種力大小相等而方向相反： qE=6rv （5） 對(duì)速度求解并將公式（5）代入公式（1）,可以得到一個(gè)以物理參數(shù)表示淌度的公式： 電場(chǎng)力（FE） e - （6） 摩擦力（FF） 高效毛細(xì)管電泳概述 上式表明，帶電量大的物質(zhì)具有的淌度高，而帶電量小的物質(zhì)淌度低。 通常從標(biāo)準(zhǔn)表中查到的電泳淌度是一個(gè)物理常數(shù)，它是在溶質(zhì)帶最大電量時(shí)測(cè)定并外推至無(wú)限稀釋條件下所得到的數(shù)值。它往往不同于實(shí)驗(yàn)測(cè)定值。因此后者被稱為有效淌度，一般依賴于操作緩沖溶液的pH（即，溶質(zhì)pKa）和組成。 高效毛細(xì)管電泳

17、概述 絕對(duì)淌度和有效淌度之間存在差異。兩種假定的溶質(zhì)在完全離子化狀態(tài)下，具有相同的電泳淌度。在淌度表中，它們表現(xiàn)為因沒(méi)有差速遷移而不能得到分離。但是，它們具有不同的pKa值,從而因其依賴pH的電量不同而具有不同的淌度。電 滲 流（EOF） HPCE操作中一個(gè)基本的組成部分是電滲流（EOF）。電滲流是毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)，來(lái)源于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用。電滲流通過(guò)對(duì)溶質(zhì)淌度疊加一個(gè)體相流速來(lái)控制溶質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)停留的時(shí)間。這可能影響必需的毛細(xì)管長(zhǎng)度，但不影響選擇性。 電 滲 流（EOF） 在水溶液中，多數(shù)固體表面帶有過(guò)剩的負(fù)電荷。它們的來(lái)源可以是表面的離子化（即，酸堿

18、平衡）和表面對(duì)離子物種的吸附。對(duì)于石英，盡管電滲流強(qiáng)烈地受可能以陰離子方式存在（SiO）的硅羥基（SiOH）的控制，但上述兩種過(guò)程都有可能存在。雖然石英的確切pI難以測(cè)定，但電滲流在pH4以上確實(shí)變得非常顯著。非離子材料如聚四氟乙烯也可以產(chǎn)生電滲流，可能是由于它們對(duì)陰離子的吸附。 電 滲 流（EOF） 為了保持電荷平衡，對(duì)離子（多數(shù)情況下是陽(yáng)離子）在靠近表面處積聚，使得從雙電層到離壁很近的地方之間產(chǎn)生了一個(gè)電位差，稱為Zeta電位。向毛細(xì)管兩端施加一個(gè)電壓，組成擴(kuò)散層的陽(yáng)離子將被吸引到負(fù)極。由于這些離子是溶劑化的，它們將拖著毛細(xì)管中的體相溶液向負(fù)極運(yùn)動(dòng)。電 滲 流（EOF） 電滲流的大小可用速

19、度或淌度來(lái)表示：或 VEOF=(/)E (7) EOF =/ (8) 其中：VEOF=速度 EOF=電滲淌度 =zeta電位 =介電常數(shù)（注意：淌度與外加電場(chǎng)無(wú)關(guān)）電 滲 流（EOF） zeta電位主要是由毛細(xì)管表面電荷所決定的。由于電荷量受 pH控制，電滲流的大小也隨pH變化。在高pH下，硅羥基大量解離，電滲流將比低 pH下硅羥基質(zhì)子化時(shí)高得多。在特定的場(chǎng)合，pH 從 2到 12電滲流的大小變化可能會(huì)超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)。 Zeta電位還取決于緩沖溶液的離子強(qiáng)度。雙電層理論表明，增加離子強(qiáng)度可使雙電層壓縮，Zeta電位降低，從而減小電滲流。 電 滲 流（EOF） 毛細(xì)管內(nèi)電滲流的一個(gè)獨(dú)特性質(zhì)是其具

20、有平面流型，由于引起流動(dòng)的推動(dòng)力沿毛細(xì)管（在管壁處）均勻地分布，不會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)形成壓力差，所以流速到處接近相同。平面流型的優(yōu)點(diǎn)是它對(duì)區(qū)帶的分散沒(méi)有直接的貢獻(xiàn)。這同由外部泵驅(qū)動(dòng)的因管壁處存在剪切力而產(chǎn)生的層流或拋物線流型形成了對(duì)照。電 滲 流（EOF） 流速在管壁附近迅速減小。這一靜止的溶液層是由管壁表面對(duì)流動(dòng)的摩擦阻力所引起的。由于該層向溶液中延伸的距離很短，它對(duì)整個(gè)分離過(guò)程的影響并不得要（以其它分散過(guò)程為主）。另外，流速和流型一般與毛細(xì)管內(nèi)徑無(wú)關(guān)，但如果毛細(xì)管內(nèi)徑太粗（200300微米），流型會(huì)被擾亂。流型對(duì)峰形的影響。 電 滲 流（EOF）電滲流的另一優(yōu)點(diǎn)是它可以使幾乎所有物種，不論其電荷

21、性質(zhì)如何，向同一方向運(yùn)動(dòng)。在一般情況下（帶負(fù)電的毛細(xì)管表面），電滲流的方向是由正極到負(fù)極。由于電滲流可以比陰離子的淌度大一個(gè)數(shù)量級(jí)，它可以將陰離子推向陰極。所以，陰離子，中性物質(zhì)以及陽(yáng)離子可以向同一方向“遷移”而在一次分析中得到電泳分離。其中，陽(yáng)離子遷移最快是因?yàn)槠溥w移與電滲流同向，中性物質(zhì)也可以隨電滲流遷移但彼此不能分離，而陰離子則因?yàn)槠溥w移與電滲流反向而速度最慢。 電 滲 流（EOF） 對(duì)于小離子的分析（如K+，Na+, Cl-）,電滲流的大小往往不比溶質(zhì)的淌度大。另外，對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷進(jìn)行修飾可以減小電滲流，而溶質(zhì)的淌度則不受影響。在這些情況下，陰陽(yáng)離子可以向不同的方向遷移。電 滲

22、流 的 控 制 電滲流通常是有利的因素，有必要對(duì)它進(jìn)行控制。例如，在高 pH 下，電滲流可能太快，使溶質(zhì)在未得到分離之前就被推出毛細(xì)管。相反，在低 pH 或中等 pH，負(fù)電表面可能會(huì)通過(guò)靜電作用吸附陽(yáng)離子溶質(zhì)。后一現(xiàn)象在堿性蛋白質(zhì)的分離中成為特別嚴(yán)重的問(wèn)題。除此之外，在等電聚焦，等速電泳以及毛細(xì)管凝膠電泳中常常要求減小電滲流。 電 滲 流 的 控 制 一般來(lái)說(shuō)，電滲流的控制要求對(duì)毛細(xì)管表面電荷或緩沖溶液粘度進(jìn)行調(diào)節(jié)。表4，P 9 所列和下面幾段中論述的幾種方法可以達(dá)到這一目的。但請(qǐng)注意，影響表面電荷的因素往往也會(huì)影響溶質(zhì)（如緩沖溶液 pH ）。在電滲流和溶質(zhì)淌度性質(zhì)得到優(yōu)化的條件下，可以實(shí)現(xiàn)成

23、功的分離。 電 滲 流 的 控 制 公式（7）表明，可以簡(jiǎn)單地降低電場(chǎng)強(qiáng)度來(lái)減小電滲流速度。但是這一方法存在著分析時(shí)間、分離效率和分離度方面的缺陷。從實(shí)用的觀點(diǎn)來(lái)看，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖溶液的 pH也可以引起 EOF的急劇變化。然而，改變 pH 可能會(huì)影響到溶質(zhì)的電荷和淌度。低 pH 緩沖溶液會(huì)使毛細(xì)管表面和溶質(zhì)質(zhì)子化，而高 pH 則促使它們解離。對(duì)于溶質(zhì)pI的了解將有助于選擇合適的操作緩沖溶液的pH范圍。 電 滲 流 的 控 制 通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖溶液的濃度和離子強(qiáng)度也可以改變電滲流。高離子強(qiáng)度緩沖溶液可以通過(guò)減少管壁上的有效電荷來(lái)限制溶質(zhì)與管壁的靜電相互作用。但高離子強(qiáng)度緩沖溶液的使用將受到毛細(xì)管內(nèi)的熱

24、效應(yīng)的約束。盡管可以使用100500mM甚至更高的濃度，但一般緩沖溶液的濃度為1050mM。 電 滲 流 的 控 制 最后，還可以通過(guò)對(duì)毛細(xì)管壁以動(dòng)態(tài)的涂漬（緩沖溶液添加劑）或共價(jià)鍵合的方式進(jìn)行改性處理來(lái)控制電滲流。這些涂層，可以增加、減小或反轉(zhuǎn)表面電荷，從而改變電滲流。 分 析 參 數(shù) 毛細(xì)管電泳中的分析參數(shù)可以用色譜中類似的術(shù)語(yǔ)加以描述。毛細(xì)管區(qū)帶電泳是HPCE中最簡(jiǎn)單的方式，本節(jié)中所有后續(xù)的討論都是關(guān)于CZE方式的。下面將討論關(guān)于時(shí)間、淌度、樣品區(qū)帶分散、分離效率和分離度的理論和實(shí)用方面。 淌度和遷移時(shí)間 一種溶質(zhì)遷移至檢測(cè)點(diǎn)所用的時(shí)間稱為“遷移時(shí)間”，它等于遷移距離除以速度。遷移時(shí)間和

25、其它實(shí)驗(yàn)參數(shù)可用于計(jì)算溶質(zhì)的表觀淌度： a=1/tE = 1L/tV （9）其中： a=e+EOFV=外加電壓I=毛細(xì)管有效長(zhǎng)度（到檢測(cè)器）L=毛細(xì)管總長(zhǎng)度t=遷移時(shí)間E=電場(chǎng)強(qiáng)度淌度和遷移時(shí)間 在電滲流存在的情況下，測(cè)得的淌度稱為表觀淌度，a?？梢酝ㄟ^(guò)用一種中性標(biāo)記物單獨(dú)測(cè)定電滲流的方式，自表觀淌度中扣除電滲淌度而求得溶質(zhì)的有效淌度?？梢允褂玫闹行詷?biāo)記物有二甲亞砜（DMSO），異亞丙基丙酮（mesityloxide）和丙酮等。 淌度和遷移時(shí)間 有效長(zhǎng)度指的是從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)點(diǎn)之間的距離。對(duì)于柱上（On-Column）光度檢測(cè)來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管有效長(zhǎng)度一般比其總長(zhǎng)度短5-10cm。而在柱后檢測(cè)方式下（

26、如質(zhì)譜），兩個(gè)長(zhǎng)度相等。由于遷移時(shí)間和淌度是由有效長(zhǎng)度確定的，而電場(chǎng)強(qiáng)度是由總長(zhǎng)度確定的，對(duì)兩個(gè)不同長(zhǎng)度的了解是非常重要的。分 散 過(guò) 程 電泳分離以溶質(zhì)淌度的差異為基礎(chǔ)。分離兩個(gè)區(qū)帶所必需的淌度差異取決于區(qū)帶的長(zhǎng)度。而區(qū)帶長(zhǎng)度則同作用于區(qū)帶上的分散過(guò)程密切相關(guān)。由于分散過(guò)程增加區(qū)帶的長(zhǎng)度和實(shí)現(xiàn)分離所必需的淌度差異，有必要對(duì)分散過(guò)程進(jìn)行控制。 分 散 過(guò) 程 分散，即溶質(zhì)區(qū)帶的展寬，來(lái)源于該區(qū)帶中溶質(zhì)的速度差異，可定義為峰底寬度，Wb。對(duì)于一個(gè)高斯峰。 Wb=4 （10） 這里=峰的標(biāo)準(zhǔn)偏差（以時(shí)間，長(zhǎng)度或體積表示） 以理論塔板數(shù)表示的分離效率，N，可從下式求得： N = ( 1/)2 （11

27、）其中： 1 =毛細(xì)管有效長(zhǎng)度分 散 過(guò) 程 分離效率與理論等板高度（HETP），H，之間的關(guān)系如下： H = ( 1/ N) （12）分 散 過(guò) 程 在理想條件下（進(jìn)樣塞較小，沒(méi)有溶質(zhì)管壁相互作用等等），可將縱向（沿毛細(xì)管）擴(kuò)散視為HPCE中對(duì)樣品區(qū)帶展寬有貢獻(xiàn)的唯一因素。由于流型呈塞狀，徑向擴(kuò)散（橫穿毛細(xì)管）不太重要。同樣，由于毛細(xì)管的抗對(duì)流性質(zhì)，對(duì)流引起的區(qū)帶展寬也不明顯。 影響分離效率的因素 在HPCE中，除了縱向擴(kuò)散之外，其它因素也會(huì)引起區(qū)帶分散。這些因素中，最重要的有焦耳熱引起的溫度梯度，進(jìn)樣塞長(zhǎng)度以及溶質(zhì)與毛細(xì)管壁的相互作用。值得慶幸的是，這幾種因素都是可以控制的。它們與其它因素

28、引起區(qū)帶擴(kuò)展的機(jī)制列于表6，P 6。 焦耳熱和溫度梯度在細(xì)孔徑毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行電泳的一個(gè)主要的好處就是減小了曾限制傳統(tǒng)電泳技術(shù)的熱效應(yīng)。熱效應(yīng)可以導(dǎo)致不均勻的溫度梯度和局部的粘度變化從而引起區(qū)帶展寬。雖然分離效率和分離度的理論公式中提倡使用盡可能高的電場(chǎng)強(qiáng)度，但不論毛細(xì)管的尺寸和溫度控制措施如何，升高場(chǎng)強(qiáng)所帶來(lái)的收獲將最終受到焦耳熱的限制。 焦耳熱和溫度梯度 因電流通過(guò)而產(chǎn)生的熱稱為焦耳熱。溫度的上升與產(chǎn)生的功率（電壓與電流之積）有關(guān)，并由毛細(xì)管尺寸，溶液的電導(dǎo)和外加電壓所決定。當(dāng)功率的產(chǎn)生超過(guò)散逸時(shí)，溫度就會(huì)急劇升高。一般功率的產(chǎn)生在0.5-5W/m范圍之內(nèi)。溫度升高10是很平常的，有時(shí)甚至可升

29、高70或更高。焦耳熱和溫度梯度 雖然溫度的絕對(duì)升高并無(wú)妨礙（除非可能引起樣品分解等），但溫度梯度卻是有害的。毛細(xì)管壁的熱散逸會(huì)使毛細(xì)管中心溫度高于管壁溫度。這一溫度梯度將引起操作緩沖溶液的粘度變化從而導(dǎo)致區(qū)帶變形。由于溫度每變化1引起的粘度變化為2-3%（淌度也變化2-3%），控制溫度梯度是非常關(guān)鍵的。焦耳熱和溫度梯度 有許多方法可用于顯示過(guò)熱和溫度梯度的存在。比如可以利用升高電壓以后分離效率的降低來(lái)說(shuō)明過(guò)熱現(xiàn)象的產(chǎn)生。另一種跡象是在高電壓下EOF或溶質(zhì)淌度的非線性增加。同樣，電流隨電壓的非比例變化也可以表明溫度的升高（偏離歐姆定律）。焦耳熱和溫度梯度 表8列出了可以限制焦耳熱的各種方法。公式

30、（17）表明溫度梯度將隨功率的減小而線性降低。這可以通過(guò)降低外加電壓或減小緩沖溶液電導(dǎo)（降低離子強(qiáng)度或緩沖離子淌度）的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。后一方法雖然有效但有實(shí)用方面的限制。降低緩沖溶液濃度可能減小緩沖容量并導(dǎo)致溶質(zhì)和管壁的相互作用。焦耳熱和溫度梯度 另一種選擇是使用低淌度緩沖溶液，它們具有較大的弱電解質(zhì)離子，如三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），硼酸鹽，組氨酸和3-環(huán)己氨基-1-丙磺酸（CAPS）等。關(guān)于緩沖溶液的選擇將在3.1.1.1節(jié)討論。焦耳熱和溫度梯度 還可以通過(guò)減小毛細(xì)管內(nèi)徑來(lái)實(shí)現(xiàn)溫差的急劇降低，因?yàn)槊娣e（電流）與半徑的平方有關(guān)。內(nèi)徑細(xì)到5-10m的毛細(xì)管已經(jīng)得到了應(yīng)用，但在這種內(nèi)徑的毛細(xì)管

31、中，檢測(cè)、進(jìn)樣以及毛細(xì)管的堵塞等問(wèn)題的存在，使得它們不能用于日常分析。更實(shí)用的是25-50m內(nèi)徑的毛細(xì)管。 焦耳熱和溫度梯度 自毛細(xì)管外壁驅(qū)除熱量極端重要。可以簡(jiǎn)單地利用風(fēng)扇吹動(dòng)毛細(xì)管周圍的室溫下的空氣來(lái)達(dá)到這一目的。使用高速流動(dòng)的空氣或液體對(duì)毛細(xì)管恒溫的冷卻系統(tǒng)可以大大改善冷卻效果。從理論上使用液體更為有效（k液k空氣），但在一般條件下，生熱低于5-7W/m時(shí)，高速空氣冷卻也同樣有效。Beckman Coulter公司毛細(xì)管電泳儀使用冷凍劑。焦耳熱和溫度梯度 主動(dòng)的溫度控制對(duì)散熱和保持毛細(xì)管溫度恒定至關(guān)重要。即使在沒(méi)有焦耳熱效應(yīng)的情況下，室溫的變化也會(huì)引起粘度變化（2-3%/）從而改變遷移時(shí)

32、間。另外，由于進(jìn)樣過(guò)程也與溫度有關(guān)，較小的溫度變化可能對(duì)進(jìn)樣量造成明顯的影響。有關(guān)控溫和重現(xiàn)性的進(jìn)一步討論見(jiàn)第4章。 進(jìn) 樣 塞 長(zhǎng) 度 在進(jìn)樣過(guò)程中，減小樣品塞長(zhǎng)度非常重要。如果其長(zhǎng)度超過(guò)因擴(kuò)散造成的區(qū)帶分散，分離效率和分離度將受損失。 進(jìn)樣塞長(zhǎng)度與擴(kuò)散系數(shù)之間的關(guān)系及其對(duì)分離效率的影響列于表9，P 15。進(jìn) 樣 塞 長(zhǎng) 度 對(duì)進(jìn)樣長(zhǎng)度的一個(gè)實(shí)用的限制是低于毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1-2%。對(duì)于70cm長(zhǎng)的毛細(xì)管，1%長(zhǎng)度相當(dāng)于7mm（或14nl,50m內(nèi)徑時(shí)）。雖然目前使用儀器可以重現(xiàn)地將如此少量的樣品引到毛細(xì)管中，但在一般情況下，檢測(cè)限方面的困難需要更長(zhǎng)些的進(jìn)樣長(zhǎng)度。在不損失分離效率的情況下改善檢

33、測(cè)限的措施將在第2章，4.1.3節(jié)，4.3節(jié)中討論。溶質(zhì)與管壁相互作用 溶質(zhì)與毛細(xì)管之間的相互作用對(duì)HPCE極其有害。在不同的相互作用程度下，可能會(huì)出現(xiàn)拖尾峰甚至發(fā)生對(duì)溶質(zhì)的完全吸附。引起毛細(xì)管壁對(duì)溶質(zhì)吸附的主要原因是陽(yáng)離子溶質(zhì)與負(fù)電表面之間的離子相互作用和疏水相互作用。毛細(xì)管的高表面容積比對(duì)傳熱來(lái)說(shuō)是有利的，但也增加了產(chǎn)生吸附的可能性。已經(jīng)注意到，對(duì)多肽和蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)這種吸附作用特別嚴(yán)重，主要是因?yàn)檫@類分子具有較多的電荷和疏水基團(tuán)。 溶質(zhì)與管壁相互作用 可以采取多種對(duì)策來(lái)減小溶質(zhì)管壁相互作用。其中幾種簡(jiǎn)便易行且有特殊效果。例如，增加緩沖溶液濃度可以降低有效表面電荷來(lái)減小溶質(zhì)管壁相互作用。高離子強(qiáng)度也可以降低電滲流，因此增加了溶質(zhì)在毛細(xì)管中的停留時(shí)間。但是，這種嘗試往往受到因電流增加而引起的焦耳熱的限制。為此可以選擇使用兩性離子緩沖體系。溶質(zhì)與管壁相互作用 限制吸附的另一種嘗試是在極端pH下進(jìn)行分離。在低pH下（2-3），石英表面硅羥基主要以不帶電的形式存在。盡管此時(shí)電滲流接近為零，但因蛋白質(zhì)（和其它溶質(zhì)）也可以質(zhì)子化而帶正點(diǎn)荷，它們?nèi)钥上蜇?fù)極遷移。相反，在高pH下（910），毛細(xì)管壁和溶質(zhì)都將解離而帶負(fù)電，溶質(zhì)管壁相互作用則因電荷之間的排斥而