教學(xué)課件·植物組織培養(yǎng)

1、植物組織培養(yǎng)溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院0 緒論0.1 植物組織培養(yǎng)的簡介0.1.1 植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)（plant tissue culture）：是指在無菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用人工培養(yǎng)基，對離體的植物胚胎、器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整植株的技術(shù)。又稱為植物離體培養(yǎng)（plant culture in vitro）。植物組織培養(yǎng)是一門研究植物離體培養(yǎng)的生物技術(shù)學(xué)科?；A(chǔ)學(xué)科：植物生理學(xué)無菌：無真菌、細(xì)菌、病毒等微生物。人工控制的環(huán)境條件：光照、溫度、濕度、氣體等。離體生態(tài)學(xué)（in vitro ecology）：是指研究離體培養(yǎng)環(huán)境條件控制的科學(xué)，其研究

2、對象是培養(yǎng)基、植物材料和人工環(huán)境條件。外植體（explant）：用于離體培養(yǎng)的那部分植物器官、組織或細(xì)胞。愈傷組織（callus） ：是指外植體因受傷或在離體培養(yǎng)時(shí)，其細(xì)胞進(jìn)行活躍的分裂增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的組織。采用微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段來操作植物離體的器官、組織和細(xì)胞。0.1.2 植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)具體表現(xiàn)為以下方面：組培技術(shù)是無菌操作技術(shù)。組培材料處于完全的異養(yǎng)狀態(tài)。組培材料可以是離體狀態(tài)的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體。組織培養(yǎng)物可以形成克?。╟lone，無性繁殖系），也可以進(jìn)行莖芽增殖或生根。組培容器內(nèi)的氣體和環(huán)境氣體可通過封口材料進(jìn)行交換，相對濕度通常是幾乎100，因此，組培苗

3、葉片表面一般都無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，且氣孔保衛(wèi)細(xì)胞功能缺乏，氣孔始終都是張開的。組培的環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和時(shí)間都是人為設(shè)定的，其參數(shù)可調(diào)。0.1.3 植物組織培養(yǎng)的研究類型和任務(wù)組織培養(yǎng)：分生組織、形成層組織、薄壁組織、韌皮部組織等。器官培養(yǎng)：根、莖、葉、花、果實(shí)、種子。胚胎培養(yǎng)：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。細(xì)胞培養(yǎng)：單細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)，如性細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根尖細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞等。原生質(zhì)體培養(yǎng)研究任務(wù)：研究離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞、組織或器官所需營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，細(xì)胞、組織或器官的形態(tài)發(fā)生和代謝規(guī)律，植物脫毒方法和機(jī)理，植物特別是一些難繁植物的大量快速繁殖方法，細(xì)胞融合方法和機(jī)理，再生個(gè)體的遺

4、傳和變異，種質(zhì)資源的離體保存機(jī)理和方法等。0.2 植物組織培養(yǎng)的形成和發(fā)展開創(chuàng)階段（上世紀(jì)初上世紀(jì)30年代末）1. Schleiden 和Schwann 植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)源于德國植物學(xué)家Schleiden和動(dòng)物學(xué)家Schwann于1838-1839年提出的細(xì)胞學(xué)說：一切生物都是由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞是生物體的基本功能單位，細(xì)胞只能由細(xì)胞分裂而來。 2. Haberlandt 德國植物學(xué)家Haberlandt被公認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)之父，他于1902年發(fā)表的植物組織培養(yǎng)的第一篇論文：提出了植物細(xì)胞具有全能性，構(gòu)思了細(xì)胞培養(yǎng)的概念。Haberlandt選擇了柵欄組織細(xì)胞、髓部細(xì)胞、雄蕊絨毛以及氣孔保

5、衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將這些細(xì)胞培養(yǎng)在有機(jī)物豐富并含有葡萄糖的Knop培養(yǎng)液中，在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞沒有分裂，但存活了幾個(gè)星期并有生長。失敗的主要原因：1）實(shí)驗(yàn)材料高度分化。 Haberlandt沒有意識(shí)到，由于可進(jìn)行光合作用的細(xì)胞相應(yīng)地已經(jīng)分化了，它們的分生組織潛能不容易表達(dá)。2）培養(yǎng)基過于簡單。 Haberlandt不知道細(xì)胞脫分化成為分生組織狀態(tài)需要刺激物質(zhì)，植物生長調(diào)節(jié)劑當(dāng)時(shí)還未發(fā)現(xiàn)。3. Kotte and Robbins1922年，植物離體組織培養(yǎng)取得了一些進(jìn)展。德國人Kotte和美國人Robbins兩人同時(shí)分別獨(dú)立地將分生組織作為外植體。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖

6、，將它們放在含有Knop溶液鹽成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各種營養(yǎng)液中。Kotte觀察到根尖生長持續(xù)了2周，但他沒有進(jìn)行繼代培養(yǎng)。另一方面Robbins通過繼代，將玉米根尖離體培養(yǎng)了更長的時(shí)間，但隨著時(shí)間延長，生長量減少，最后消失。4. Hanning、Knudson和Laibach1904年，Hanning在無機(jī)鹽和蔗糖溶液中對蘿卜和辣根菜的胚進(jìn)行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育成熟，并提早萌發(fā)形成小苗。1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得了大量的蘭花幼苗。1925年，Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功，證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)源雜交中利用的可能性。在植物組

7、織培養(yǎng)研究的開創(chuàng)時(shí)期，由于影響植物組織和細(xì)胞增殖及形態(tài)發(fā)生能力的因素尚不清楚，培養(yǎng)材料的選擇十分重要，在30多年的探索實(shí)驗(yàn)中，植物組織培養(yǎng)幾乎沒有大的進(jìn)展。奠基階段（上世紀(jì)30年代上世紀(jì)50年代末）1. 李繼侗和沈同1933年，他們首次報(bào)道了利用天然提取物成功進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的研究。利用加有銀杏胚乳提取物的培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)了銀杏的胚。2. White、Gautheret and Nobecourt1934年，美國植物生理學(xué)家White用添加了酵母提取物（YE）的培養(yǎng)基進(jìn)行了番茄根的離體培養(yǎng)，建立了第一個(gè)活躍生長并能繼代增殖的無性繁殖系，從而使非胚器官培養(yǎng)首次獲得成功。同年，法國學(xué)者Gauthe

8、ret在添加了YE和水解酪蛋白（CH）的固體培養(yǎng)基上，使山毛櫸和歐洲黑楊的形成層培養(yǎng)物連續(xù)增殖了幾個(gè)月，這是固體培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)上的首次成功應(yīng)用。1937年，White又發(fā)現(xiàn)酵母提取物的作用可以被B-族維生素（硫胺素，VB6，煙酸）所取代，建立了第一個(gè)由已知化合物組成的培養(yǎng)基。 1939年，White建立了連續(xù)生長的煙草雜種培養(yǎng)物。同時(shí)期， Gautheret在山毛櫸和胡蘿卜形成層、Nobecourt在胡蘿卜根和馬鈴薯塊莖上也建立了連續(xù)生長的培養(yǎng)物。WhiteGautheretNobecourt White 和 Gautheret 獲得的愈傷組織，由含有大液泡的薄壁組織組成。3. Skoo

9、g和Miller 1954年，Skoog于做了一個(gè)著名的實(shí)驗(yàn)。在煙草愈傷組織培養(yǎng)中用了變質(zhì)的鯡魚精子DNA，發(fā)現(xiàn)它可促使愈傷組織加快生長。有效成分存在于變質(zhì)的DNA樣品或者經(jīng)高壓滅菌后的新鮮樣品中，他指出有效成分是降解的DNA產(chǎn)物。1955年，他把這種物質(zhì)命名為激動(dòng)素（KT）。1956年，Miller首次從鯡魚精子中分離出激動(dòng)素。 Skoog Skoog和Miller的煙草髓部愈傷組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 1957年，Skoog和Miller提出激素控制器官形成的觀點(diǎn)。在這篇著名的論文中，他們提到在煙草髓部愈傷組織培養(yǎng)中，根和芽的分化由生長素和細(xì)胞分裂素的比率決定，并且器官分化可以通過改變培養(yǎng)基中兩種激素

10、的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。高濃度的生長素誘導(dǎo)生根，而高濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)芽的形成。兩者濃度相當(dāng)時(shí)則傾向于未分化樣式的生長。這一對激素調(diào)節(jié)器官分化的觀點(diǎn)現(xiàn)在已在大多數(shù)植物種類中被證實(shí)。 4. Muir、Steward和Reinert1953年，Muir利用往復(fù)式搖床的振蕩，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行了萬壽菊和煙草愈傷組織的培養(yǎng)，獲得了單細(xì)胞或密集細(xì)胞的懸浮液，并可繼代增殖。這既是培養(yǎng)方法上的突破，也是Haberlandt培養(yǎng)單細(xì)胞設(shè)想的實(shí)現(xiàn)。1958年，英國學(xué)者Steward和Reinert幾乎同時(shí)在胡蘿卜根組織的韌皮部單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中誘導(dǎo)出胚狀體，并長成完整植株。證實(shí)了Haberlandt的細(xì)胞全能性理論。

11、 建立和發(fā)展階段（上世紀(jì)60年代至今）從植物細(xì)胞全能性理論的提出到其被實(shí)驗(yàn)科學(xué)地證實(shí)，植物組織培養(yǎng)研究領(lǐng)域走過了近60年的發(fā)展歷程。當(dāng)影響植物細(xì)胞分裂和器官形成的機(jī)理被揭示后，學(xué)者們對該領(lǐng)域進(jìn)行了全面研究，獲得的成果枝繁葉茂，發(fā)表的文章浩如煙海，形成了一套成熟的植物組織培養(yǎng)的理論體系和技術(shù)方法，擁有著極其廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，從而在生物科學(xué)中建成了這門具有理論、技術(shù)和應(yīng)用的科學(xué)。1. Thimann和Wickson 1958年，他們發(fā)現(xiàn)腋芽（當(dāng)頂芽存在時(shí)為休眠狀態(tài)）的生長，可以通過外源細(xì)胞分裂素的應(yīng)用而啟動(dòng)。這樣，將莖段培養(yǎng)在含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，就可以在一個(gè)具有完整頂芽的生長中的莖上誘導(dǎo)側(cè)芽的

12、形成。這將消除頂端優(yōu)勢，得到大量不定芽。Thimann2. Morel脫毒、快繁商業(yè)化1952年， Morel和Martin提出了植物脫毒（virus free）技術(shù)，通過分離已被病毒感染的大麗花個(gè)體的根尖，并將其離體培養(yǎng)，重新獲得了無病毒的大麗花。1960年，Morel利用蘭花莖尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了脫毒和快速繁殖（rapid clone propagation）的兩個(gè)目的。這一技術(shù)導(dǎo)致歐洲、美洲和東南亞許多國家“蘭花工業(yè)”的興起。Morel3. MurashingeMurashinge發(fā)展了一套標(biāo)準(zhǔn)的離體繁殖方法，將這一技術(shù)廣泛普及。與Skoog一起篩選出至今仍被廣泛應(yīng)用的MS培養(yǎng)基。4. Guh

13、a和Maheshwari等花藥培養(yǎng)1964-1966年，印度學(xué)者Guha 和Maheshwari成功地由曼陀羅花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，開創(chuàng)了花粉培育單倍體的新途徑。1973年，Nitsch采用花藥預(yù)培養(yǎng)方法獲得了煙草花粉植株的純合二倍體。 1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培養(yǎng)法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分離花粉進(jìn)行 培養(yǎng)成功，建立了一個(gè)適于深入研究雄核發(fā)育的實(shí)驗(yàn)體系。MaheshwariNitschNitsch發(fā)展了培養(yǎng)煙草和曼陀羅小孢子的技術(shù)、單倍體染色體加倍的技術(shù)，并且在5個(gè)月之內(nèi)收集到二倍體純合子的種子（Nitsch, 1974, 1977

14、）。 5. Cocking等-原生質(zhì)體培養(yǎng)1960年，英國學(xué)者Cocking首次用酶解方法獲得了原生質(zhì)體，開創(chuàng)了植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究。1971年，日本學(xué)者Nagata和Takebe首次將煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)出再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura獲得首例禾谷類水稻的原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1986年，Spangenberg獲得了甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。Cocking6. Carlson等原生質(zhì)體融合1972年，Carlson利用硝酸鈉進(jìn)行了煙草種間原生質(zhì)體的融合實(shí)驗(yàn)，獲得了首株體細(xì)胞種間雜種植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）進(jìn)行了大豆和煙草科間原生質(zhì)體的融合，獲得了3

15、的異質(zhì)體。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功進(jìn)行了具有葉綠體的海藻和不具有葉綠體的胡蘿卜根原生質(zhì)體的融合。1978年，Melchers獲得了首個(gè)屬間雜種植株（馬鈴薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生質(zhì)體融合的新方法電融合。Melchers植物遺傳操作成功的前景引起了大眾的興趣。Melchers和他的同事（1978年）通過將馬鈴薯和番茄原生質(zhì)體融合，允許遺傳信息在兩個(gè)不同的有機(jī)體中移動(dòng)，獲得了一個(gè)雜種植物。這一方法提供了獲得親緣相近但生殖隔離的種間雜種的機(jī)會(huì)。7. Kaul等次生代謝物生產(chǎn)1969年，Kaul發(fā)現(xiàn)三角葉薯蕷懸浮培養(yǎng)物可以生產(chǎn)薯蕷皂苷配基。1973年，F(xiàn)

16、uruya和Ishii發(fā)現(xiàn)人參培養(yǎng)細(xì)胞可以產(chǎn)生人參皂苷。Nickell組織培養(yǎng)的先驅(qū)，尤其是在培養(yǎng)中次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)方面。 Street培養(yǎng)設(shè)施化Street和他的助手開創(chuàng)了各種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的程序（恒化器和恒濁器）。 0.3 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用及展望快繁和脫毒育種次生代謝物生產(chǎn)種質(zhì)保存在遺傳、生理、生化、病理等研究上的應(yīng)用1. 離體快繁（試管苗和人工種子）和脫毒1）試管苗在生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、經(jīng)濟(jì)效益較大。特點(diǎn)：繁殖系數(shù)大、速度快，苗木整齊一致，周年生產(chǎn)。一個(gè)單株一年繁殖幾萬到幾百萬個(gè)植株。葡萄：3萬，蘭花：400萬，草莓：108 。尤其適用于“名、優(yōu)、特、新、奇” 品種、脫毒苗、優(yōu)良單株、瀕

17、危植物和基因工程植株等的繁殖。目前園藝作物及經(jīng)濟(jì)林木等部分或大部分都用離體快繁提供苗木。美國Wyford國際公司年產(chǎn)花卉、蔬菜、果樹及林木的組培苗3000萬株。以色列Benzur苗圃年產(chǎn)觀賞植物組培苗800萬株。我國工廠化生產(chǎn)的組培苗有：香蕉、甘蔗、桉樹、葡萄、蘋果、脫毒草莓、脫毒馬鈴薯、非洲菊、蘆薈。Fig. 1. Mass propagation of multiple shoot cultures of Artemisia annua青蒿2）人工種子（artificial seed）人工種子的概念是1978年Murashinge首次提出的，它是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體或不定芽，被包裹

18、在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中，從而形成能發(fā)芽出苗的顆粒體。具有試管苗的優(yōu)點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）便于貯藏和運(yùn)輸、可直接播種和機(jī)械化操作；2）可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農(nóng)藥等成分，提高種子活力和品質(zhì)。前途是光明的，道路是曲折的。人工種子3）脫毒苗木培育很多作物特別是無性繁殖作物都帶有病毒，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，對生產(chǎn)造成極大損失。草莓主要病毒有4種，大蒜和馬鈴薯的病毒有10多種。感病植株并非每個(gè)部位都帶有病毒，生長點(diǎn)附近的病毒濃度很低甚至無毒。利用莖尖組培，再生植株就可脫毒，獲得脫毒苗。應(yīng)用：水果（甘蔗、菠蘿、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（馬鈴薯、大蒜、洋蔥等）、花卉（蘭花、菊花、

19、唐菖蒲等）等。莖尖培養(yǎng)用于脫毒2. 培育新品種或創(chuàng)制新物種單倍體育種離體選擇突變體培育遠(yuǎn)源雜種基因工程育種單倍體育種手段：花藥和花粉培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：所有基因均能表現(xiàn)，基因型可快速純合。成果：已育成大面積種植的品種。1974年我國育成第一個(gè)新品種煙草單育1號(hào)，此后還育出水稻中花8號(hào)、小麥京花1號(hào)和大量花培新品系。單倍體植株單倍體加倍離體選擇突變體愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞易變異、細(xì)胞數(shù)量大，有利于突變體篩選。多用于抗性篩選。已選出一些抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白的突變體，有些已用于生產(chǎn)。體細(xì)胞變異突變體篩選培育遠(yuǎn)源雜種胚培養(yǎng)可克服受精后障礙導(dǎo)致的遠(yuǎn)源雜交不孕，產(chǎn)生遠(yuǎn)源雜交后代，育成新物種。已育成蘋果和梨、

20、大白菜和甘藍(lán)、栽培棉和野生棉等雜交種。原生質(zhì)體融合可克服有性雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種。已獲得馬鈴薯和番茄、煙草和龍葵等屬間雜種，但尚無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。典型的原生質(zhì)體煙草原生質(zhì)體Aechmea fasciata (X400)Ti導(dǎo)入的原生質(zhì)體原生質(zhì)體遠(yuǎn)緣雜交基因工程育種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法均基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)?？钩輨⒖瓜x、抗病、抗逆性、品質(zhì)改良。轉(zhuǎn)基因作物已占種植面積的1/5左右。轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因槍技術(shù)3. 次生代謝物生產(chǎn)利用組織和細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可以生產(chǎn)人類需要的一些天然有機(jī)化合物，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿及其他活性化合物。已從200多種植物的培養(yǎng)組織或細(xì)胞中獲得了5

21、00多種有效代謝化合物，包括一些重要藥物。如人參皂苷、喜樹堿、降壓靈等。特別適于天然植物蘊(yùn)藏量少、含量低、臨床效用高的成分，如紫杉醇等。Fig. 2. Scale-up of Catharanthus roseus 長春花cell cultures in a 20 litre air紫草發(fā)酵罐培養(yǎng)4. 植物種質(zhì)資源的離體保存常規(guī)保存手段耗費(fèi)人力、物力和土地。1975年，Henshaw和Morel首次提出了離體保存植物種質(zhì)的策略。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)約人力、物力和土地，防止有害病蟲的傳播，便于種質(zhì)資源的交換和轉(zhuǎn)移。已有多種植物保存。如草莓莖培養(yǎng)物可保存6年。5. 在遺傳、生理生化、病理等研究上的應(yīng)用已成為植

22、物科研的常規(guī)方法。遺傳：單倍體、純合二倍體、無性系變異等。生理生化：植物營養(yǎng)、生長活性物質(zhì)、光合代謝等。病理：單細(xì)胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)快速鑒定抗病性、抗逆性等。復(fù)習(xí)思考題什么是植物組織培養(yǎng)？簡述植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)及分類。何謂離體生態(tài)學(xué)、外植體和愈傷組織？植物組織培養(yǎng)有那些方面的應(yīng)用？3 植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)3.1 培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù)3.2 基本操作3.3 離體培養(yǎng)體系的建立3.1 培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù)成分母液配方pH值制備3.1.1 基本成分水礦質(zhì)元素碳水化合物生理活性物質(zhì)生長調(diào)節(jié)劑附加物天然添加物1. 水（H2O ）水：可靠的水質(zhì)是實(shí)驗(yàn)的保證可以使用以下裝置：水質(zhì)軟化裝置離子交換反向滲透

23、蒸餾離子交換設(shè)備2. 礦質(zhì)元素大量必需元素（加入mM量級(jí)）：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫微量必需元素（加入 M量級(jí)）：鐵、錳、硼、鋅、銅、鉬其他：碘、鎳、鈷、鋁等3. 碳水化合物作用：提供碳源、維持滲透壓。通常碳源用蔗糖，高壓滅菌后蔗糖大部分水解為葡萄糖和果糖。濃度范圍15%，但在幼胚、莖尖、花藥等培養(yǎng)時(shí)可達(dá)10甚至更高。低濃度（1.52.5）的糖有利于木質(zhì)部的生長；高濃度（34）有利于韌皮部；4. 生理活性物質(zhì)維生素肌醇氨基酸及其酰胺類單核苷酸維生素（0.110mg/L）作用：輔酶注意事項(xiàng)：易高溫降解，過濾滅菌。硫胺素（VB1）：全面促進(jìn)生長。吡哆醇（VB6）煙酸（VB3）VC：抗氧化劑，防止褐變

24、。肌醇作用：幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用，使培養(yǎng)物快速生長，促進(jìn)胚狀體及芽的形成。一般用量：50100mg/L。氨基酸及酰胺有機(jī)氮源、緩沖作用、調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡。甘氨酸：促進(jìn)離體根的生長。絲氨酸、谷氨酰胺：有利于花藥胚狀體或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）：氨基酸混合物。5. 植物生長調(diào)節(jié)劑： 目前公認(rèn)的已用于植物組織培養(yǎng)和生長操作的有六大類植物激素。它們是：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯和油菜素內(nèi)酯。此外還有一些具有植物激素特征的化合物。天然生長素 在植物中發(fā)現(xiàn)的天然生長素主要是吲哚-3-乙酸（IAA）。在植物分生組織區(qū)濃度很高，與許多生理反應(yīng)有關(guān)。與植物組培有關(guān)的作用主要

25、是在細(xì)胞分裂和有絲分裂過程。生長素的一個(gè)主要應(yīng)用是促進(jìn)生根，因此被廣泛用于切段的微繁和生根培養(yǎng)。然而，不可忽視它可抑制根的伸長。合成生長素： 最廣泛使用的合成生長素：吲哚-3-丁酸IBA、-萘乙酸（NAA）和2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）。通常與細(xì)胞分裂素聯(lián)用。這些生長素對光、溫的穩(wěn)定性高于IAA，可以經(jīng)高壓滅菌。 其余較少用的生長素包括：2-萘氧乙酸（NOA）、4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA） 、2,4,5-三氯苯氧基乙酸（2,4,5-T）、3,6-二氯茴香酸(麥草畏)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定）。細(xì)胞分裂素 細(xì)胞分裂素是腺嘌呤6位上

26、的N被其他基團(tuán)取代的衍生物，與生長素共同作用促使植物細(xì)胞分裂。玉米素是最早被分離的細(xì)胞分裂素。呋喃甲基腺嘌呤和芐基腺嘌呤是最早合成的。細(xì)胞分裂素主要在植物的根部合成，運(yùn)輸?shù)角o干。在組織培養(yǎng)中對芽的形成和器官分化起主要作用。均二苯脲（DPU）從椰子汁中提取，具有類似細(xì)胞分裂素活性，常作為微繁的附加成分。常用的細(xì)胞分裂素：芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、激動(dòng)素（KT）。Thidiazuron（TDZ）已廣泛用于組織培養(yǎng)。TDZ抑制細(xì)胞分裂素氧化酶，從而降低細(xì)胞分裂素的新陳代謝，使得細(xì)胞分裂素在組培過程中維持較高的水平。 赤霉素 赤霉素對熱敏感，因此在組培中不常用。使用時(shí)，在培養(yǎng)基高壓滅菌后

27、，對它單獨(dú)過濾除菌。它們主要的作用是刺激植物亞頂端分生組織的擴(kuò)展生長。因此常用來刺激芽的伸長，如對矮稻的生物測定可明顯看到其作用。赤霉酸（GA3）是在組培中用得最多的赤霉素。脫落酸 脫落酸（ABA）是植物生長的強(qiáng)有效的抑制劑。與其他生長因子相互起作用。在組培中廣泛用來促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育為成熟的胚，并轉(zhuǎn)化為小植株。乙烯 乙烯是氣態(tài)的，是一種揮發(fā)性的激素。要將這種激素降低到最小程度，培養(yǎng)容器大小，尺寸以及密閉方法就顯得非常重要。在過去的幾年發(fā)展了大量的植物生長調(diào)節(jié)劑。由于它們更強(qiáng)的活性、穩(wěn)定性以及低廉的價(jià)格，在植物組培中它們的用途也不斷地?cái)U(kuò)展。生長素/細(xì)胞分裂素相互作用 在Skoog和Miller工

28、作的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立起很好的生長素細(xì)胞分裂素比率關(guān)系，用于組培中決定芽和/或根的形成。細(xì)胞分裂素對生長素的濃度比值高時(shí)，傾向于形成芽，而生長素細(xì)胞分裂素的濃度比值高時(shí)，傾向于形成根。兩種激素的比值處于中間水平時(shí)增強(qiáng)愈傷組織的形成。6. 附加物膠凝劑螯合劑滲透劑活性炭其他膠凝劑： 瓊脂：從藻類中提取的天然產(chǎn)品，710 g/L。瓊脂一般都含有雜質(zhì)，特別是鈣、鎂和微量元素，在營養(yǎng)研究時(shí)應(yīng)避免使用。Gelrite：一種吉蘭多糖（異多糖），是假單胞菌產(chǎn)生的胞外多糖，2.02.5 g/L。不同品牌其物理化學(xué)特征不同螯合劑 Chelates可與金屬陽離子（主要是鐵）形成復(fù)合物，使其溶解于溶液中。 EDTA：

29、乙二胺四乙酸EDDHA：乙二胺二鄰羥苯基大乙酸鐵鈉 滲透劑 Osmotic agents組培培養(yǎng)基的滲透能力影響水和各種成分的可用性。蔗糖的濃度大于2%常常是由于其滲透效果而非作為碳源的作用。大多數(shù)情況下甘露醇僅作為有滲透效果的糖醇，而不參與代謝變化?；钚蕴緾harcoal（0.53）使培養(yǎng)基變黑（根部環(huán)境）。吸附分子，特別是帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的植物生長調(diào)節(jié)劑。可能含有刺激因素（如多胺）。由于吸附能力的不同，活性炭的商標(biāo)很關(guān)鍵。在高壓滅菌前加入會(huì)降低培養(yǎng)基的pH值，使瓊脂不易凝固。7. 天然添加物椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、酵母提取液（YE）等。作用：提供天然微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長調(diào)

30、節(jié)劑等。缺點(diǎn)：成分不確定，影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。3.1.2 母液（貯備液）10倍、100倍或更高倍數(shù)，冰箱貯存。貯備液：大量元素20倍貯備液：微量元素200倍貯備液：鐵鹽200倍貯備液：有機(jī)物質(zhì)（除了蔗糖）200倍各種激素貯備液分別配制：0.1mg/L或1mg/L注意事項(xiàng)：各種藥品要充分溶解后才能混合?；旌蠒r(shí)要注意先后順序，避免相互結(jié)合生成沉淀。鐵鹽單獨(dú)配制，一般用硫酸亞鐵和EDTA-Na2通過加熱形成穩(wěn)定的螯合鐵貯存。生長素類先用少量95乙醇或1mol/L NaOH加熱助溶后，用水定容。細(xì)胞分裂素類先用少量1mol/L鹽酸溶解，再用水定容。3.1.3 配方基本培養(yǎng)基：MS、B5、White等。激素

31、配比：主要是生長素和細(xì)胞分裂素的比例。如：MS + BA2 + NAA0.10.23.1.4 pH值一般5.66.0。高壓滅菌后稍有下降，所以滅菌前要略調(diào)高。大于6.0，培養(yǎng)基變硬；低于5.0，瓊脂凝固不好。一般用1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。培養(yǎng)階段pH值會(huì)改變 3.1.5 培養(yǎng)基制備加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。調(diào)節(jié)pH值。加入需要量的瓊脂，加熱溶解（要不斷攪拌）。分裝：在瓊脂未凝時(shí)（40左右凝固）分裝，量一般為容器的1/41/3，注意不要沾到容器口。封口。滅菌。存放。注意事項(xiàng)：不能高壓滅菌的物質(zhì)，在滅菌后溫度下降但瓊脂尚未凝固時(shí)，在無菌條件下，用過濾

32、除菌法加入。配好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在兩周內(nèi)用完。3.2 離體培養(yǎng)體系的建立3.2.1 外植體的選擇和處理3.2.2 培養(yǎng)條件3.2.1 外植體外植體（explant）從需要培養(yǎng)的母株分離的一小塊植物材料。接種體（inoculum）已經(jīng)培養(yǎng)的植物材料用于繼代培養(yǎng)。地上部比地下部清潔。外植體越小，克服特殊植物病理問題（如病毒、支原體、細(xì)菌）的機(jī)會(huì)越大，但同時(shí)也降低了存活率。內(nèi)部的組織比外部的不易受到污染。不同外植體反應(yīng)不總是相同。外植體的選擇2. 外植體的滅菌 根據(jù)培養(yǎng)容器大小將材料切割成適當(dāng)大??；流水（自來水）沖洗植物表面；在酒精中晃動(dòng)幾秒鐘；HgCL2（0.11%）吐溫（潤濕劑）2滴/100ml：

33、35min；用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗；商業(yè)漂白劑715%吐溫2滴/100ml：1030min；再用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗幾次。注釋自來水：除去塵土，清潔劑去掉表面垢污。 酒精：70%酒精使蛋白質(zhì)失活。95%有時(shí)被用來溶解外植體表面的臘質(zhì)層。 NaOCl（商業(yè)漂白劑）或Ca(OCl)2：活性在于Cl- 和其他氧化反應(yīng)。 HgCl2活性在于Cl-和使蛋白質(zhì)失活的重金屬。 潤濕劑（例如：吐溫20或80）可以加到上述溶液中。 *汞對環(huán)境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一個(gè)大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀。蘭花花枝的無菌消毒3.2.2 培養(yǎng)條件溫度光照濕度氣相條件溫度 事實(shí)上要對每種特定的植

34、物甚至每一特定階段調(diào)整最優(yōu)化的溫度。對大多數(shù)植物日間培養(yǎng)室的溫度調(diào)節(jié)點(diǎn)在22 2C。夜間的溫度通常要低幾度。容器內(nèi)的溫度要比室溫高（可達(dá)5C）。培養(yǎng)室的一個(gè)主要的問題是維持始終如一的溫度。保障措施：需要安裝一個(gè)很大的自動(dòng)調(diào)溫器，當(dāng)溫度太高時(shí)可以關(guān)掉燈光 光通常用熒光燈，在架子上平行安放。大多數(shù)情況是裝在培養(yǎng)室的外面，以避免熱。 以下的光參數(shù)是重要的：光周期 和光強(qiáng)光周期大多數(shù)情況光周期不是最重要的。通常是16小時(shí)光照。為了節(jié)省能源和降低安裝費(fèi)培養(yǎng)室內(nèi)不同架子上的燈不必同時(shí)打開。光強(qiáng) 適當(dāng)?shù)墓饷芏仁?0 mol m-2 s-1，這一光強(qiáng)下為混合培養(yǎng)類型。自養(yǎng)型組培則需要達(dá)到250 mol m-2

35、 s-1。 依據(jù)不同類型的容器，容器內(nèi)的光強(qiáng)或多或少被減弱。 PAR Photosynthetic active radiation PAR每秒每平方米波長在400700nm之間的光子摩爾數(shù) LUX是一個(gè)不太合適的單位，因?yàn)樗谌搜鄣拿舾行?光譜光譜是光形態(tài)建成的因素（植株高度以及葉片伸展）重要的比率：藍(lán)光/紅光，紅光/紅外 光譜因燈不同而不同濕度 Humidity 培養(yǎng)室的相對濕度（RH）通常不控制。標(biāo)準(zhǔn)容器其頂部空間水蒸氣飽和。容器內(nèi)的RH可以通過不同的裝置控制通風(fēng)，底部冷卻，瓊脂濃度 。容器氣體組分在組培容器中頂部空間的成分組成與溫室空氣有顯著的區(qū)別，見下表 ：其他揮發(fā)性氣體含量微小。

36、 componentgreenhouse environmentcontainer atmosphereO222 %as low as 4 %N277 %up to 87 %CO2 365 - 1000 ppmup to 20 %water vapour60-85 % 100 %ethylene5 ppb - 100 ppb 2 ppm頂部空間氣體成分對植物生長發(fā)育的影響： 矮化或白化 玻璃化軟腐自養(yǎng)/混合營養(yǎng)乙烯傷害矮化或白化有限的氣體交換對組培的效應(yīng)組培容器盡可能密閉，以防止污染。然而，在一個(gè)完全密閉的容器中可能出現(xiàn)氣體的堆積，對植物生長造成不利，如產(chǎn)量減少、白化病或壞疽。Fig. 1:

37、growth reduction Fig. 2 Albinism玻璃化Hyperhydricity玻璃化是在植物組培過程中的一種生理混亂現(xiàn)象。程度有低高之分。程度低的話在培養(yǎng)初期不會(huì)遇到大的問題。但程度高的話在培養(yǎng)的各個(gè)階段都有可能遇到嚴(yán)重的問題。 玻璃化癥狀 玻璃化的癥狀通常不易用肉眼觀察到。植物易感或培養(yǎng)條件非常不利則會(huì)出現(xiàn)可見的癥狀。培養(yǎng)條件非常不利的例子：細(xì)胞分裂素濃度過高水分含量過高容器過于密實(shí)膠凝劑濃度過低 產(chǎn)生原因原因是多方面的。然而許多因素只是當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)的條件沒有達(dá)到最優(yōu)化時(shí)表現(xiàn)誘導(dǎo)或激發(fā)玻璃化。下列可以作為考慮的因素： 外植體：種類，栽培變種；繼代間隔時(shí)間；繼代次數(shù)；切割方法

38、；在培養(yǎng)基上的放置情況。 培養(yǎng)基：凝膠的濃度和類型；有無液體層；細(xì)胞分裂素的種類及水平；鹽濃度。容器：氣體組成和氣體濃度。 環(huán)境：溫度；光強(qiáng)和光質(zhì)，濕度；空氣流動(dòng) 補(bǔ)救方法培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基用較高濃度的凝膠固化，也可以使用有較高凝固能力的凝膠劑；降低細(xì)胞分裂素的濃度。容器特征：不太密實(shí)的裝置，比如氣透性膜；增加水蒸氣和其他氣體與周圍環(huán)境的交換，從而調(diào)節(jié)容器的頂部空間氣體成分；環(huán)境條件：底部冷卻；增加光強(qiáng)；在不含BA的培養(yǎng)基上冷藏。底部冷卻 大部分容器的底部由于燈產(chǎn)生的微弱熱量而變暖。結(jié)果水蒸氣在冷的蓋子上凝結(jié)成水滴。容器內(nèi)相對濕度可以通過冷卻底部來控制，這樣水蒸氣就在培養(yǎng)基表面凝結(jié)。培養(yǎng)基溫度

39、和蓋子下面的溫度差別越大，相對濕度就越低。例如：培養(yǎng)基20 ，蓋子下部 23，RH為 85% 。 各種容器和封口裝置復(fù)習(xí)思考題簡述用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成。如何選擇外植體？請?jiān)敿?xì)說明外植體滅菌的方法。植物組織培養(yǎng)需要哪些環(huán)境條件？1.1 植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞全能性（totipotency）：是指任何攜帶完整遺傳信息的植物活細(xì)胞都具有表達(dá)其所有遺傳信息的能力，能夠發(fā)育成完整的植株。全能性是一種可能性，變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)必須滿足兩個(gè)條件：解除抑制和給予刺激。細(xì)胞需經(jīng)過脫分化和再分化過程才能表現(xiàn)其全能性。1 植物組織培養(yǎng)的基本原理1.2 植物細(xì)胞的分化與脫分化脫分化（dedifferentiatio

40、n）：成熟細(xì)胞或分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)（即形成愈傷組織）的過程。再分化（redifferentiation）：成熟細(xì)胞或分化細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織后重新分化成異質(zhì)細(xì)胞的過程。1.3 植物的形態(tài)建成1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和保持傷口可能導(dǎo)致愈傷組織的形成。愈傷組織形成可以在幾乎所有的活的植物中發(fā)現(xiàn)。傷口愈傷組織的開始是植物的一種自我保護(hù)反應(yīng)；內(nèi)源植物激素水平的改變，結(jié)果使細(xì)胞分裂具有活性。機(jī)械損傷、微生物入侵以及昆蟲的襲擊也可以導(dǎo)致愈傷組織產(chǎn)生。Wound callus on the stemof an Erythrina tree1.3.1.1 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織起源于母體組織增

41、殖細(xì)胞。在培養(yǎng)時(shí)，通過把全植株的一小部分（外植體）在無菌條件下放到支持生長的培養(yǎng)基上來產(chǎn)生愈傷組織。激素改變了細(xì)胞的代謝使之從靜止轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚浴碜杂谌~組織來源于根來源于維管組織來源于胚組織培養(yǎng)條件固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的缺點(diǎn)污染損失大不利于氣體交換，影響愈傷組織形成。誘導(dǎo)期（啟動(dòng)期）細(xì)胞準(zhǔn)備分裂。因植物種類和外植體狀況而異。對大多數(shù)植物，愈傷組織建立相對比較容易；如雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物以及苔蘚等。來自多種器官的組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上可能都有分裂和增生擴(kuò)散的潛能，然而，某些組織似乎比另一些更傾向于使細(xì)胞快速分裂。一般需要1天到幾天。1.3.1.2 愈傷組織的生長誘導(dǎo)期

42、后，外植體外層細(xì)胞開始分裂，在組織受傷表面形成一種創(chuàng)傷形成層，愈傷組織的細(xì)胞數(shù)目迅速增加。特點(diǎn)：細(xì)胞分裂速率大大超過細(xì)胞伸長速率，單個(gè)細(xì)胞的平均重量下降，體積變小。如菊芋外植體培養(yǎng)7d后，細(xì)胞數(shù)目增加10倍以上，鮮重僅增加1倍。愈傷組織類型質(zhì)地：松脆、致密高生長素：致密變松脆。低或無生長素或高細(xì)胞分裂素：松脆變致密。 顏色：白色、黃色、綠色、紅色1.3.1.3 愈傷組織的保持一段時(shí)間后，由于基本培養(yǎng)物的損耗、凝膠的干燥以及代謝物的積累，需要將愈傷組織轉(zhuǎn)到新鮮的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)要有適當(dāng)?shù)拇笮。员ＷC在新鮮培養(yǎng)基上可以重建生長。通常每36周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。Typical ca

43、llus growth curve. X indicates time for subculture大多數(shù)情況下，隨繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織出現(xiàn)生長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力逐漸降低甚至死亡或發(fā)生能力完全喪失。遺傳因素：染色體畸變、基因突變。生理因素：細(xì)胞內(nèi)激素平衡或細(xì)胞對外源生長物質(zhì)的敏感性發(fā)生改變。延長培養(yǎng)期可能使愈傷組織對生長素的需求發(fā)生變化，導(dǎo)致生長素的自給或自養(yǎng)，出現(xiàn)馴化現(xiàn)象。一般1年以上或10代以上出現(xiàn)。生理因素導(dǎo)致的形態(tài)發(fā)生能力下降可通過改變培養(yǎng)條件而恢復(fù)。1.3.2 愈傷組織再分化 愈傷組織生長過程中，開始細(xì)胞分裂局限在外層細(xì)胞，當(dāng)表面細(xì)胞分裂逐漸減慢

44、并停止時(shí)，內(nèi)部較深處的細(xì)胞才開始分裂，且分裂的方向也發(fā)生改變，形成了維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)，這是愈傷組織生長的一個(gè)共同特征。很多情況下，它們往往變成生長中心，但不進(jìn)一步分化，并從它們的周圍產(chǎn)生薄壁細(xì)胞，結(jié)果形成一種“泡沫球”增殖物，這仍然是生長活躍的愈傷組織的特點(diǎn)。隨后這些小疣狀物可以經(jīng)歷另一個(gè)發(fā)育過程，出現(xiàn)器官分化和體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生。在愈傷組織的培養(yǎng)過程中細(xì)胞分化的程度和類型有相當(dāng)大的可變性。很難找到由完全一致的實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成的均一的愈傷組織。當(dāng)形成導(dǎo)管元件、篩管元件、栓化細(xì)胞、分泌細(xì)胞等時(shí)就發(fā)生了細(xì)胞分化。一些分裂的細(xì)胞形成擬分生組織或維管節(jié)結(jié)，以后它們將變成芽頂點(diǎn)、根原基或初始胚形成的中心

45、。xylem tissuemeristematic activityunorganised tissue再分化途徑器官發(fā)生途徑：愈傷組織先產(chǎn)生芽（或根），再在另一種培養(yǎng)基上產(chǎn)生根（或芽），然后形成完整植株。胚狀體發(fā)生途徑：愈傷組織形成胚狀體，再在另一種培養(yǎng)基上同時(shí)發(fā)展成帶有根的苗。也叫無性胚胎發(fā)生（無性系）。胚狀體是指愈傷組織中形成的與種子中胚相似的具有苗端和根端的雙極性結(jié)構(gòu)。也叫體細(xì)胞胚。 1.3.2.1 器官發(fā)生先形成芽，后在芽基部長根。先形成根，后在根基部形成芽。在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后根、芽的維管束接通形成完整植株。僅形成芽或根。如茶樹花粉愈傷組織往往只能形成根。Sho

46、ot (caulogenesis) (a) and root development (b & c) on callus of Hypoxis1.3.2.2 體細(xì)胞胚胎發(fā)生起源：合子胚是配子細(xì)胞融合的產(chǎn)物，即受精卵；對體細(xì)胞胚而言（合成的無性胚）融合是不需要的。形態(tài)：一個(gè)完全發(fā)育的胚是具有兩極的軸，一端是芽分裂組織，另一端是根分裂組織；也可以根據(jù)一種特殊類型的葉片子葉來辨別。進(jìn)化：胚胎發(fā)育有連續(xù)的典型形態(tài)階段（球形胚、心形胚和魚雷胚）。 體細(xì)胞胚胎的特征：體胚最根本的特征是具有兩極性。即在發(fā)育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單向極性。體胚的維管組織與外植體的該組

47、織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往住總與愈傷組織的維管組織聯(lián)系。體胚的維管組織的分布是獨(dú)立的Y字形，而不定芽的維管組織則無此現(xiàn)象。Typical morphological stages during embryo development: (A) globular, (B) heart shaped, (C) torpedo體胚發(fā)生的方式體胚發(fā)生的方式分為直接發(fā)生和間接發(fā)生兩類。直接發(fā)生是指體胚直接從原外植體的胚性細(xì)胞不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成；而間接發(fā)生是體胚從愈傷組織或懸浮細(xì)胞、有時(shí)也從已形成的體胚的一組細(xì)胞中發(fā)育而成。多數(shù)體胚是間接發(fā)生。直接發(fā)生胚性細(xì)胞：與分生組織細(xì)胞類似，通常較

48、小，近圓形，具有較大的核和核仁并能高度染色，胞質(zhì)濃厚，可直接發(fā)育成體細(xì)胞胚胎。如柑橘的珠心組織、茶樹和龍眼的子葉、香雪蘭的花序等外植體。間接發(fā)生胚胎發(fā)生叢（EC）的形成：EC是愈傷組織中一種液泡小、胞質(zhì)濃的小細(xì)胞聚集成的叢狀結(jié)構(gòu)。其表面是高度分生組織化的細(xì)胞團(tuán)，每個(gè)表面細(xì)胞都可能發(fā)育成胚狀體。EC原培養(yǎng)基上不能使其表面的胚狀體發(fā)育，但可增殖、崩潰而不衰。EC在轉(zhuǎn)入降低或去除生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基后，才能完成胚狀體的發(fā)育。人工種子合成或人工種子是獨(dú)立包埋的體細(xì)胞胚。通常術(shù)語“embling”用來描述從人工種子發(fā)育而來的植株。通常用海藻酸鈉作為人工種子的包埋劑。也發(fā)展了用新的自裂膠珠的方法。直

49、到現(xiàn)在人工種子的質(zhì)量和保真度仍然是人工種子產(chǎn)品發(fā)展和大量生產(chǎn)的制約因素。1.4 植物組織培養(yǎng)的基本程序無菌外植體的獲得初代培養(yǎng)物的建立形態(tài)發(fā)生和植株再生培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載1.4.1 無菌外植體的獲得外植體攜帶有各種微生物，這些微生物一旦進(jìn)入培養(yǎng)容器，會(huì)造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料污染，實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。所以，污染是組織培養(yǎng)的一大障礙，需要利用各種滅菌劑進(jìn)行外植體的滅菌。不同器官的滅菌方法莖尖、莖段、葉片根、塊莖、鱗莖花蕾果實(shí)、種子1、莖尖、莖段、葉片的滅菌清水沖洗（茸毛較多的先用皂液洗滌），吸水紙吸干。0.10.2氯化汞浸泡210min；或70酒精浸數(shù)秒，再在10次氯酸鈣浸泡520min（或21530mi

50、n）。無菌水沖洗35次，吸干。適當(dāng)切塊，接種。2、根、塊莖、鱗莖的滅菌帶土，易損傷。仔細(xì)刷洗，切除損傷部位，增加滅菌時(shí)間或濃度。0.10.2氯化汞浸泡512min；或70酒精浸數(shù)秒，再在610次氯酸鈣浸泡520min。3、花蕾的滅菌花蕾中的花藥處于無菌狀態(tài)，采摘后可直接滅菌。70酒精浸1030s， 0.1氯化汞浸泡310min（或1次氯酸鈣1020min）。4、果實(shí)、種子的滅菌有些表面具茸毛或蠟質(zhì)，需加吐溫-80。果實(shí)：70酒精浸數(shù)秒，2次氯酸鈣1020min。種子： 0.10.2氯化汞浸泡510min（或10次氯酸鈣2030min）。1.4.2 初代培養(yǎng)物的建立無菌環(huán)境：外植體、培養(yǎng)基、接種

51、器械、接種工作臺(tái)。規(guī)范操作：無菌操作合適條件：培養(yǎng)基、激素、其他添加物、外植體、培養(yǎng)條件等。抗生素的使用外植體滅菌是表面滅菌，無法除去侵入組織內(nèi)部的微生物。有時(shí)可以考慮在培養(yǎng)基中加入抗生素?？股貙χ参锷L可能有抑制作用，需摸索其合適的種類和濃度。注意添加方式，一般不能高壓滅菌，有些需要過濾除菌。1.4.3 形態(tài)發(fā)生和植株再生 體細(xì)胞胚 植株外植體（愈傷組織） 具根、莖的兩極器官 植株 器官分化 單極器官 先莖后根 植株 先根后莖 植株1.4.4 培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載愈傷組織誘導(dǎo)率產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)*100胚狀體誘導(dǎo)率產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)*100芽分化率產(chǎn)生芽的外植體

52、數(shù)/外植體總數(shù)*100發(fā)根率發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)復(fù)習(xí)思考題：簡述植物細(xì)胞全能性的概念。什么是植物細(xì)胞脫分化和再分化？愈傷組織是如何形成和生長的？植物離體培養(yǎng)中再生植株有哪些途徑？何謂植物體細(xì)胞胚胎？其發(fā)生有哪些途徑？影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？為什么愈傷組織誘導(dǎo)一般選用固體培養(yǎng)基？愈傷組織的形成時(shí)期及特點(diǎn)。簡述繼代培養(yǎng)的原因及要點(diǎn)。體細(xì)胞胚胎的特征及發(fā)生方式。4 植物器官培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)是指對植物某一器官的全部或部分或器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。根、莖、葉、花器、果實(shí)、種子。4.1 根的培養(yǎng)根系生理代謝研究的良好實(shí)驗(yàn)體系；研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；建立根無性系，用于制藥；誘變育種。

53、4.1.1 離體根的培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)法：平放液體培養(yǎng)法：振蕩固體液體雙層培養(yǎng)法：根段形態(tài)學(xué)上端插入固體培養(yǎng)基，下端朝上浸露在液體培養(yǎng)基中。其他特殊方法4.1.2 離體根所用培養(yǎng)基WhiteMS、B5等大量元素減半或減2/34.1.3 影響離體根生長因素基因型營養(yǎng)條件：氮源、碳源、微量元素、維生素B1激素：生長素pH光照和溫度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 莖段培養(yǎng)植物莖段培養(yǎng)是指對植物的帶有一個(gè)以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖在內(nèi)的幼莖切段）進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。4.2 莖段和莖尖培養(yǎng)莖段培養(yǎng)的目的進(jìn)行植物的離體快速繁殖。研究莖細(xì)胞的分裂潛力和全能性。誘導(dǎo)細(xì)胞變異和突變體的獲

54、得。莖段培養(yǎng)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)特點(diǎn)：以芽生芽的方法進(jìn)行增殖。優(yōu)點(diǎn)：容易成功、變異小、性狀均一、繁殖速度快。莖段培養(yǎng)產(chǎn)物單苗（芽）叢生苗（芽）單生芽和叢生芽的增殖方式適宜植物的離體快速繁殖。完整植物愈傷組織影響因素基因型激素配比：生長素、細(xì)胞分裂素4.2.2 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)（shoot tip culture or apical meristem culture）是指對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。材料莖尖分生組織培養(yǎng)：1mm(帶有12個(gè)葉原基的生長錐），可去毒。普通莖尖培養(yǎng)：幾毫米至幾十毫米的莖尖、芽尖及側(cè)芽培養(yǎng)。Shoot tip culture 莖尖培養(yǎng)的一般方法材料制備：精心

55、預(yù)處理嚴(yán)格滅菌小心取材：體視顯微鏡、解剖針莖尖培養(yǎng)注意事項(xiàng)取材大?。好摱拘∮?mm，快繁可數(shù)毫米。莖尖微小趨向于形成愈傷組織。培養(yǎng)基：多為MS，避免2,4-D（促使外植體愈傷組織化）。莖尖分生組織培養(yǎng)與脫毒普通莖尖培養(yǎng)與繁殖技術(shù)無菌物的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導(dǎo)生根移栽概念：Micropropagation生長狀態(tài)及原因生長太慢：莖尖不見明顯增大，但顏色轉(zhuǎn)綠。進(jìn)入休眠生長素太低溫度低生長過旺：莖尖明顯增大，基部產(chǎn)生愈傷組織，莖尖難于伸長，色澤較淡。生長素偏高用了2,4-D光照太弱溫度過高生長正常：莖尖逐漸轉(zhuǎn)綠，基本逐漸膨大，有時(shí)形成少量愈傷組織，莖尖逐漸伸長，最終形成小枝。影響莖尖微繁的

56、因素基因型外植體的大小供試植株的生理狀態(tài)芽的著生部位褐變玻璃化極性后生變化形態(tài)發(fā)生能力遺傳穩(wěn)定性4.3 葉的培養(yǎng)離體葉：葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等葉組織。意義：研究葉形態(tài)建成、光合作用、葉綠體形成等；葉細(xì)胞全能性；原生質(zhì)體融合；無性繁殖系；誘變育種。影響葉組織培養(yǎng)的因素基因型細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素和生長素的組合供試植株的發(fā)育時(shí)間和葉齡葉脈極性損傷離體葉組織發(fā)育途徑直接產(chǎn)生不定芽由愈傷組織產(chǎn)生不定芽胚狀體其他將鑷子、解剖刀置于含有70酒精的清潔瓶內(nèi)。葉片浸于該液1分鐘作表面消毒。將葉片置于10漂白粉水溶液中（1/4杯漂白粉+2 杯水+幾滴洗潔精）10分鐘，并不時(shí)用鑷子攪動(dòng)。如果葉片浮在水上，

57、則需用鑷子夾入水底。10分鐘后，將漂白粉水溶液中的葉片轉(zhuǎn)移到盛有無菌水的瓶子內(nèi)，一次放入一片。將葉片轉(zhuǎn)移到消毒過的盤上準(zhǔn)備切割。切去葉的邊緣，再將剩下的葉片切成24片，并分別將它們接入紫羅蘭培養(yǎng)基上。經(jīng)消毒的非洲紫羅蘭葉片切成0.5-1英寸寬，接種于新鮮的培養(yǎng)基上。3周后葉片周圍及表面腫脹，并有芽生成。芽伸長成苗。有時(shí)葉片表面都被誘導(dǎo)的芽所包圍。接種56周后將接種的葉片1分2，并轉(zhuǎn)入無激素的培養(yǎng)基中以利于苗的生長及生根。一個(gè)即將用于移栽的生根的紫羅蘭試管苗。移栽到土壤中的小苗的前幾天要用塑料袋罩上，直到小苗適應(yīng)低濕度的環(huán)境。復(fù)習(xí)思考題植物根培養(yǎng)主要有哪幾種方法？什么是莖段培養(yǎng)？有何特點(diǎn)及用途？

58、何謂莖尖培養(yǎng)？有何類型？需注意什么？葉培養(yǎng)有哪些意義？4 植物器官培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)是指對植物某一器官的全部或部分或器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。根、莖、葉、花器、果實(shí)、種子。4.1 根的培養(yǎng)根系生理代謝研究的良好實(shí)驗(yàn)體系；研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；建立根無性系，用于制藥；誘變育種。4.1.1 離體根的培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)法：平放液體培養(yǎng)法：振蕩固體液體雙層培養(yǎng)法：根段形態(tài)學(xué)上端插入固體培養(yǎng)基，下端朝上浸露在液體培養(yǎng)基中。其他特殊方法4.1.2 離體根所用培養(yǎng)基WhiteMS、B5等大量元素減半或減2/34.1.3 影響離體根生長因素基因型營養(yǎng)條件：氮源、碳源、微量元素、維生素B1激素：生長素

59、pH光照和溫度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1 莖段培養(yǎng)植物莖段培養(yǎng)是指對植物的帶有一個(gè)以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖在內(nèi)的幼莖切段）進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。4.2 莖段和莖尖培養(yǎng)莖段培養(yǎng)的目的進(jìn)行植物的離體快速繁殖。研究莖細(xì)胞的分裂潛力和全能性。誘導(dǎo)細(xì)胞變異和突變體的獲得。莖段培養(yǎng)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)特點(diǎn)：以芽生芽的方法進(jìn)行增殖。優(yōu)點(diǎn)：容易成功、變異小、性狀均一、繁殖速度快。莖段培養(yǎng)產(chǎn)物單苗（芽）叢生苗（芽）單生芽和叢生芽的增殖方式適宜植物的離體快速繁殖。完整植物愈傷組織影響因素基因型激素配比：生長素、細(xì)胞分裂素4.2.2 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)（shoot tip culture or

60、apical meristem culture）是指對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。材料莖尖分生組織培養(yǎng)：1mm(帶有12個(gè)葉原基的生長錐），可去毒。普通莖尖培養(yǎng)：幾毫米至幾十毫米的莖尖、芽尖及側(cè)芽培養(yǎng)。Shoot tip culture 莖尖培養(yǎng)的一般方法材料制備：精心預(yù)處理嚴(yán)格滅菌小心取材：體視顯微鏡、解剖針莖尖培養(yǎng)注意事項(xiàng)取材大?。好摱拘∮?mm，快繁可數(shù)毫米。莖尖微小趨向于形成愈傷組織。培養(yǎng)基：多為MS，避免2,4-D（促使外植體愈傷組織化）。莖尖分生組織培養(yǎng)與脫毒普通莖尖培養(yǎng)與繁殖技術(shù)無菌物的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導(dǎo)生根移栽概念：Micropropagatio