齊魯醫(yī)學串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒遺傳代謝病篩查

1、串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒遺傳代謝病篩查上海市兒童醫(yī)院田國力12021/10/23 星期六遺傳代謝病遺傳性代謝病（Inborn Errors of Metabolism, IEM） 是由于基因改變導致某些酶或蛋白質(zhì)功能發(fā)生質(zhì)/量的改變，引起某些代謝途徑上的生化物質(zhì)發(fā)生改變引起一系列疾病。大多數(shù)為單基因遺傳病遺傳方式以常染色體隱性遺傳或X連鎖隱性遺傳為主22021/10/23 星期六遺傳代謝病發(fā)病機制異常代謝途徑代謝物（A1）代謝物(C1) 代謝物 (B1) 代謝物（A2）代謝物(C2) 代謝物 (B2) 代謝物(A) 代謝物(B) 輔酶（C）正常代謝途徑酶32021/10/23 星期六疾病特點目前已發(fā)

2、現(xiàn)500余種疾病主要類型有氨基酸代謝障礙、有機酸血癥、脂肪酸代謝障礙、核酸代謝異常癥、金屬代謝障礙、線粒體病80%屬常染色體隱性遺傳單病發(fā)生率低，群體患病率高單基因缺陷所致代謝通路阻,大多為單基因遺傳病，少數(shù)為線粒體基因遺傳病表現(xiàn)非特異性，有賴遺傳學或生化方法確診，代謝物、酶學和分子檢測常規(guī)試驗檢測：缺乏特異標志物兒科、血液科、神經(jīng)科、骨科等不同診室就診早期癥狀多無特異性，累及部位和病情輕重差異很大，極易造成誤診新生兒期、幼兒或兒童期發(fā)病,某些可至成人期開始發(fā)病。42021/10/23 星期六臨床特征多在新生兒期、幼兒或兒童期發(fā)病。某些可至成人期開始發(fā)病。新生兒期發(fā)病：嘔吐、喂奶困難、反應(yīng)力低

3、下、呼吸暫停、急促等兒童期發(fā)?。嚎杀憩F(xiàn)為全身多器官受累以神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等癥狀為主乏力、智力發(fā)育遲緩、肌張力增高或降低、癲癇、黃疸、肝脾腫大、呼吸困難代謝性酸中毒、容貌異常、毛發(fā)皮膚色素改變、特殊體味飲食、應(yīng)激反應(yīng)、體能消耗等為疾病急性發(fā)作誘因。52021/10/23 星期六遺傳代謝病診斷困難臨床癥狀和體征：缺乏特異性常規(guī)檢測：缺乏特異標志物特殊試驗檢測氨基酸分析：氨基酸自動分析儀，高效液相色譜?；鈮A分析串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)氣相質(zhì)譜技術(shù)酶學分析基因診斷組織活檢、成纖維細胞組織培養(yǎng)、腦脊液培養(yǎng)、其他神經(jīng)病學檢查62021/10/23 星期六PKU歷史體內(nèi)高Phe引起患兒智力低下1930

4、提出低苯丙氨酸飲食治療1950應(yīng)用飲食治療僅對PKU同胞有益大多患兒出現(xiàn)不可逆癥狀后才確診1963年美國新生兒PKU篩查Pediatrics, 105:89, 2000.72021/10/23 星期六重視遺傳代謝病篩查與診斷疾病譜的改變感染性疾病、重度營養(yǎng)不良、腫瘤、先天畸形、遺傳代謝性疾病診斷技術(shù)的進步生化檢測、基因芯片、全基因組測序等治療方法的提高替代治療、系譜分析、遺傳咨詢、器官移植、基因治療國內(nèi)外對出生缺陷的重視82021/10/23 星期六新生兒遺傳代謝病篩查對新生兒遺傳代謝缺陷、先天性內(nèi)分泌異常以及某些嚴重的遺傳性疾病進行篩查的總稱患病新生兒在臨床癥狀出現(xiàn)前能給予治療，防止或減輕體

5、格和智力發(fā)育障礙，避免癡呆或死亡的發(fā)生是當今國際上早期發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病患兒的有效措施92021/10/23 星期六是集篩查、早期診斷、及時治療、預防再發(fā)等措施為一體減少出生缺陷，提高人口素質(zhì)是當今國際上早期發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病患兒的有效措施預防效果顯著，成本效益最好 新生兒遺傳代謝病篩查102021/10/23 星期六新生兒遺傳代謝病篩查技術(shù)細菌抑制法:BIA熒光法：FIA, EFIA免疫法：ELISA, DELFIA串聯(lián)質(zhì)譜儀：一次檢測，多種疾病。檢測氨基酸代謝異常，脂肪酸代謝異常和有機酸代謝異常。Microarray platform：分子基因的研究，將DNA點在玻璃芯片上，然后與熒光標記的診斷探

6、針反應(yīng)，檢測響應(yīng)熒光信號數(shù)字微流體(Digital Microfluidics):用于溶酶體貯積病的篩查112021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜篩查的優(yōu)勢一種疾病一種測試多種疾病多種測試新生兒篩查方案的擴展 將非常昂貴一份血樣同時檢測超過30多種物質(zhì)，近40種 代謝疾病。高靈敏性、高選擇性快速檢測，達到早診斷、早治療的效果降低了篩查診斷的假陽性和假陰性VS. 傳統(tǒng)篩查 串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS是一種在同一樣本中同時測量多種待測物的方法在同個測試平臺上檢測多個疾病就變得可能122021/10/23 星期六質(zhì)譜儀組成MS儀主要由離子源、真空接口、質(zhì)量分析器、檢測器等四部分組成樣品中被測物質(zhì)在離子源內(nèi)電離

7、形成各種質(zhì)荷比不同帶電離子（離子化），經(jīng)真空接口進入由電場或磁場形成的質(zhì)量分析器，利用電磁學原理，根據(jù)m/z不同將帶電離子分開，最后到達檢測器被檢測，得到樣品的質(zhì)譜圖及離子強度132021/10/23 星期六質(zhì)譜的基本原理將分析物離子化為各種質(zhì)荷比(m/z)不同的帶電粒子應(yīng)用電磁學原理, 帶電粒子按m/z在空間或時間上產(chǎn)生分離排列成的圖譜根據(jù)它們所形成的譜圖、離子峰強度對分析物進行鑒定若同時加入被檢測物質(zhì)對應(yīng)的內(nèi)標或外標，既可以進行定量檢測。142021/10/23 星期六MS/MS的基本原理兩個MS經(jīng)碰撞室(CID)串聯(lián)而成最常應(yīng)用于NBS的是三重四極桿，由兩個MS經(jīng)碰撞室(CID)串聯(lián)而成

8、一級MS是功能類似于氣相和液相色譜的分離器，只允許選擇的離子(母離子)通過母離子進人CID產(chǎn)生碎片(子離子)子離子經(jīng)二級MS選擇最終進入檢測器通過不同掃描的方式記錄即可得到串聯(lián)質(zhì)譜圖譜，實現(xiàn)對待測物的定性通過樣品中加入定量同位素內(nèi)標，實現(xiàn)待測物定量檢測152021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜儀一級質(zhì)譜碰撞室二級質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進入碰撞器分離器分子離子碰撞解離形成子離子掃描一定范圍子離子選擇特定子離子進入檢測器分析儀162021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)設(shè)備串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進樣器高效液相泵儀器控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)172021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查的基本原理遺

9、傳代謝?。河捎谶z傳因素體內(nèi)正常代謝途徑受阻氨基酸代謝病患者血中氨基酸水平異常有機酸血癥及脂肪酸代謝障礙病患者血中游離肉堿或不同種類的?；鈮A水平異常利用串聯(lián)質(zhì)譜儀通過檢測檢測濾紙干血片中氨基酸、游離肉堿及?；鈮A的水平通過一系列規(guī)則來評估結(jié)果將化合物濃度和代謝疾病關(guān)聯(lián)起來，綜合判斷多種遺傳代謝病一個測試平臺上同時檢測多個疾病182021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查的步驟采血后滴于專用采血濾紙片，晾干，制成濾紙干血片采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過同位素內(nèi)標法(IS)分析物和對應(yīng)內(nèi)標的響應(yīng)比等比于分析物和對應(yīng)內(nèi)標的濃度比一次性定量檢測新生兒的濾紙干血片樣品中的數(shù)十種氨基酸、?；鈮A濃度通過一系列

10、規(guī)則來評估結(jié)果將化合物濃度和代謝疾病關(guān)聯(lián)起來，綜合判斷30余種遺傳代謝病192021/10/23 星期六衍生化氨基酸掃描質(zhì)譜圖氨基酸m/z同位素m/zAla146.0Ala-d4150.3Leu188.1Leu-d3191.2Phe222.2Phe-d5227.2Tyr238.2Tyr-13C6246.2202021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜檢測指標名稱縮寫丙氨酸 AlanineAla精氨酸 ArginineArg瓜氨酸 CitrullineCit鳥氨酸 OrnithineOrn苯丙氨酸 PhenylalaninePhe酪氨酸 TyrosineTyr甘氨酸 GlycineGly亮氨酸 Leu

11、cineLeu甲硫氨酸 MethionineMet纈氨酸 ValineVal脯氨酸 ProlinePro212021/10/23 星期六串聯(lián)質(zhì)譜檢測指標名稱縮寫名稱縮寫名稱縮寫游離肉堿CC0己酰肉堿C6肉豆蔻二烯酰肉堿C14:2乙酰肉堿C2己二酰肉堿C6DC3-羥基肉豆蔻酰肉堿C14-OH丙酰肉堿C3辛酰肉堿C8棕櫚酰肉堿C16丙二酰肉堿C3DC辛烯酰肉堿C8:1棕櫚烯酰肉堿C16:1丁酰肉堿C4辛二烯酰肉堿C8:23-羥基棕櫚烯酰肉堿C16:1-OH3-羥基丁酰肉堿C4-OH葵酰肉堿C103-羥基棕櫚酰肉堿C16-OH異戊酰肉堿C5葵烯酰肉堿C10:1十八碳酰肉堿C18異戊烯酰肉堿C5:1葵

12、二烯酰肉堿C10:2十八碳烯酰肉堿C18:13-羥基異戊酰肉堿C5-OH月桂酰肉堿C123-羥基十八碳烯酰肉堿C18:1-OH戊二酰肉堿C5DC肉豆蔻酰肉堿C143-羥基十八碳酰肉堿C18-OH肉豆蔻烯酰肉堿C14:1222021/10/23 星期六高苯丙氨酸血癥232021/10/23 星期六中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥242021/10/23 星期六游離肉堿及?；鈮A有機酸血癥相關(guān)：C0、C2、C3、3DC、C4、C4-OH、C5、C5-OH、C5DC、C5:1脂肪酸代謝病有關(guān)：C0、C4、C5DC、C6、C8、C10、C12、C14、C14:1、C16、C16-OH、C18、C18-OH2

13、52021/10/23 星期六標本前處理方式262021/10/23 星期六衍生化標本前處理方法樣品處理過程中加入鹽酸正丁醇，引入丁基改變分子結(jié)構(gòu)（除去羧酸功能團），消除潛在負離子，提高正離子模式下的離子化效率酯化作用可以減少潛在的溶劑或其他干擾物質(zhì)降低分析物極性更好的去溶劑化，樣品更加容易進入儀器真空環(huán)境酯化作用可以引入測量?；鈮A和氨基酸方式（游離酸形式）無法檢測到的干擾物272021/10/23 星期六非衍生化標本前處理方法無需使用鹽酸正丁醇，使用甲醇萃取后可直接進樣整個樣本預處理步驟僅需半小時，琥珀酰丙酮的測試無需單獨處理具有擴展性：類固醇疾病、維生素缺乏等多種臨床疾病二羧酸酰基肉堿或

14、氨基酸可能有兩個負電荷位置，影響正離子效率 （分子的pKa值、流動相的pH值）282021/10/23 星期六非衍生化法為應(yīng)用趨勢操作繁瑣(3h)過程難以標準化對環(huán)境和人員有害需要氮吹設(shè)備衍生化法非衍生化法操作步驟簡單(40min)易于標準化不涉及酸腐、有毒物擴展性好發(fā)達國家的遺傳代謝病篩查已從傳統(tǒng)衍生化法逐步轉(zhuǎn)為非衍生化法（近5年美國12.20%46.84%）292021/10/23 星期六標本前處理方法比較衍生化實驗步驟長實驗過程2.5小時左右需要氮吹設(shè)備丁醇鹽酸具有強烈腐蝕性對實驗室環(huán)境要求高實驗人員需防護試劑相對便宜非衍生化簡化實驗過程實驗過程1小時無需氮吹及衍生化過程環(huán)境好人員無需特

15、殊防護試劑價格相對貴302021/10/23 星期六美國CDC統(tǒng)計年度N熒光法比例%MS（N）MS%非衍/衍生%衍生化非衍生化2009218135116.175638452.250.82010214135116.399535563.135.72011250236814.7111662269.555.72012248335414.2108666770.661.42013263051019.4%106580471.175.5Phe測定標本數(shù)為例312021/10/23 星期六檢測指標選擇322021/10/23 星期六不同酶缺陷引起不同代謝途徑差異引起特定指標升高或降低氨基酸代謝病可有一種或數(shù)種氨

16、基酸水平異常有機酸血癥或脂肪酸氧化代謝病可有一種或數(shù)種?；鈮A水平異常一種指標異?？商崾疽环N或幾種代謝病一種疾病也可對應(yīng)多種指標異常計算不同氨基酸或酰基肉堿之間的比值，有助于不同疾病之間的鑒別，降低假陽性率或假陰性率。332021/10/23 星期六一個指標對應(yīng)一種疾病疾病指標丙二酸血癥C3DC戊二酸血癥I型C5DC精氨酸血癥ARG酪氨酸血癥TYR342021/10/23 星期六多個指標對應(yīng)一種疾?。褐饕笜思膊≈笜吮酵虬YPHE，TYR，PHE/TYR楓糖尿癥LEU/ILE，VAL戊二酸血癥第II型C4，C5，C8，C8:1，C10，C12，C14，C16極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥 C14

17、:1， C14 ,C16，中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥 C6，C8,C10，C8/C10352021/10/23 星期六一個指標對應(yīng)多種疾病疾病指標3-甲基巴豆酰輔酶羧化酶缺乏癥C5OH C5OH 3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥C5OH C6DC B-酮硫解酶缺乏癥C5:1 C5OH 3-甲基戊烯二酸血癥C5OH多種羧化酶缺乏癥C5OH C3362021/10/23 星期六一個指標對應(yīng)多種疾病疾病指標丙酸血癥、甲基丙二酸血癥C3瓜氨酸血癥、NICCDCitOTC，CPS，NAGSCit372021/10/23 星期六疾病與臨床癥狀疾病臨床癥狀氨基酸代謝障礙PKU、MSUD、尿素循環(huán)障礙智力低下、發(fā)

18、育遲緩、高血氨有機酸代謝障礙MMA、PA、IVA代謝性酸中毒、嗜睡、呼吸窘迫、周期性代謝危象脂肪酸代謝障礙MCAD、VLCAD、LCHAD低血糖、昏迷、猝死、心肌病382021/10/23 星期六392021/10/23 星期六疾?。ㄈ毕菝福┏Ｒ娍s寫主要標志相關(guān)比例異戊酸血癥（異戊?；o酶A脫氫酶缺乏）IVAC5C5/C0, C5/C2, C5/C3戊二酸血癥I型（戊二酰輔酶A脫氫酶缺乏）GA IC5-DCC5-DC/C5-OH, C5-DC/C8, C5-DC/C163-羥-3-甲基戊二酰輔酶A裂解酶缺乏癥HMGC5-OH, C6-DCC5-OH/C8多種?；o酶A脫氫酶缺乏MCDC5-OH

19、C5-OH/C8甲基丙二酸血癥(甲基丙二酰-CoA 變位酶)MUTC3C3/C2, C3/C163-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶，亞組）3MCCC5-OHC5-OH/C8, C5-OH/C0甲基丙二酸血癥（腺苷鈷胺素合成）CblA，BC3C3/C2, C3/C16丙酸血癥(丙酰-CoA羧化酶)PROPC3C3/C2, C3/C16酮基硫解酶缺乏癥BKTC5:1, C5-OHC5-OH/C8甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥(MTHF 甲基轉(zhuǎn)移酶）Cbl C,DC3C3/C2,C3/C16,C3/Met甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥(MMADHC蛋白)Cbl C,

20、DC3C3/C2, C3/C16, C3/Met 丙二酸血癥MALC3-DCC3-DC/C10異丁酰甘氨酸血癥(異丁酰-CoA 脫氫酶)IBGC4C4/C2, C4/C3, C4/C82-甲基3-羥基丁酰輔酶A水解酶缺乏癥2M3HBAC5-OHC5-OH/C82-甲基丁酰甘氨酸血癥(2-甲基丁酰-CoA 脫氫酶)2MBGC5C5/C0, C5/C2, C5/C33-甲基戊二酰血癥 (3-甲基戊二酰-CoA 水合酶)3MGAC5-OHC5-OH/C8402021/10/23 星期六412021/10/23 星期六新生兒篩查的首要代謝疾病氨基酸類代謝病6苯丙酮尿癥 楓糖漿尿癥 同型胱氨酸尿癥 瓜氨酸血癥 精氨酸琥珀酸血癥 酪氨酸血癥型脂肪酸類代謝病5中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥長鏈-3-羥酰輔酶A脫氫酶缺乏癥三功能蛋白缺乏癥肉堿攝取缺陷癥有機酸類代謝病9異戊酸血癥戊二酸尿癥型3-羥基-3-甲基戊