西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院

1、PAGE PAGE - 2 -西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 2015屆（本科）畢業(yè)生論文開題報(bào)告題目： Mark4對3T3-L1脂肪細(xì)胞線粒體功能的影響學(xué) 院： 動(dòng)物科技學(xué)院 專 業(yè) 班 級(jí)： 動(dòng)科112班 學(xué) 生 姓 名： 劉 雷 指 導(dǎo) 教 師： 孫 超 論文通過開題論證日期： 2015年 1月16日開題論證教師簽名： 目 錄1選題的目的意義32選題的依據(jù)33國內(nèi)外研究概況34研究內(nèi)容65研究方法及技術(shù)路線66預(yù)期結(jié)果77研究的創(chuàng)新點(diǎn)78所需的主要儀器設(shè)備和試劑及工作條件 - 79論文工作進(jìn)展安排810經(jīng)費(fèi)預(yù)算811研究工作中面臨的技術(shù)難點(diǎn)和擬采取的解決辦法812參考文獻(xiàn)8PAGE PAG

2、E 3PAGE PAGE - 10 -1.選題的目的意義線粒體是廣泛存在于真核細(xì)胞中的半自主細(xì)胞器，有“細(xì)胞動(dòng)力工廠”之稱，它不僅是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要場所，也是很多代謝活動(dòng)如糖代謝、脂類代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡的重要調(diào)控者。線粒體功能與脂類代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、肥胖、糖尿病等代謝綜合癥等相關(guān)過程的發(fā)生有著密切聯(lián)系。Mark4是微管親和性調(diào)控激酶4，是細(xì)胞微管關(guān)聯(lián)蛋白（MAPs）的絲/蘇氨酸激酶家族（MARKs）中的成員，MARKs家族通過磷酸化作用使得微管關(guān)聯(lián)蛋白從微管上解離，進(jìn)而參與微管的動(dòng)力學(xué)作用、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞極性決定和細(xì)胞形態(tài)改變等機(jī)

3、體內(nèi)的多項(xiàng)生理調(diào)節(jié)功能，近年來，MARKs促進(jìn)細(xì)胞凋亡、參與糖代謝、微管束形成、參與能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等功能被逐漸發(fā)現(xiàn)。 本試驗(yàn)研究Mark4對3T3-L1脂肪細(xì)胞線粒體功能的影響，并預(yù)測Mark4可能通過對線粒體的影響進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞其他生理功能，為深入研究肥胖和糖尿病等疾病治療奠定理論基礎(chǔ)。2.選題的依據(jù) Mark4，即Par-1d/MarkL1，是MAP/微管親和力調(diào)控激酶超家族（MARKs） Par-1c/Mark1，Par-1b/Mark2/Emk，Par-1a/Mark3/C-TAK1和Par-1d/Mark4/KarkL1成員之一。在早期研究中，MARKs家族功能主要集中

4、在細(xì)胞微管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性調(diào)控以及細(xì)胞極性調(diào)控方面?，F(xiàn)今研究發(fā)現(xiàn)MARK4除了在細(xì)胞極性及微管穩(wěn)定性方面有調(diào)控作用外，還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡、參與糖代謝、維管束形成、參與能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等。在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要場所1，也是很多代謝活動(dòng)如糖代謝，脂代謝，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡的重要調(diào)控者2。線粒體功能紊亂可引起一系列疾病，例如糖尿病、肥胖、癌癥、衰老、心血管疾病、神經(jīng)性退化疾病等。本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，Mark4可能負(fù)向調(diào)控機(jī)體能量代謝，并且同時(shí)負(fù)調(diào)控胰島素敏感性，但是其具體機(jī)理還不清楚；此外，在這一過程中，線粒體這一在新陳代謝中起重要作用的細(xì)胞器是否參與其中

5、，也未見研究。3.國內(nèi)外研究概況3.1 Mar4研究概況3.1.1 Mark4的結(jié)構(gòu)與調(diào)控MARKs家族在結(jié)構(gòu)上有較高的相似性，按其功能可以分為三部分：N端的催化區(qū)域、C端的結(jié)構(gòu)序列和一個(gè)可以結(jié)合泛素的區(qū)域3。其中的Mark4基因可編碼S型和L型兩個(gè)可變剪切體：其中Mark4S長達(dá)3,609bp，包括一個(gè)2,069 bp的18個(gè)外顯子的開放閱讀框，可編碼688個(gè)氨基酸；而Mark4L的cDNA 有3,529對堿基，但是缺乏第16個(gè)外顯子，只可以編碼752個(gè)氨基酸。 Mark4的兩個(gè)亞型中，Mark4L 由752個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，可以分為三個(gè)功能區(qū)：蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(59314)，泛素結(jié)合區(qū)(32

6、2369)和激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(703752) 。其中激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域和之前的649703位氨基酸殘基共同發(fā)揮作用，影響激酶的折疊和功能。此外，第6573 位的氨基酸殘基是ATP結(jié)合域，而Lys88 是ATP結(jié)合位點(diǎn)。Asp181 是Mark4的活性位點(diǎn)，其側(cè)鏈的Thr214可以通過被磷酸化而激活。3.1.2 MARKs的功能MARKs家族通過磷酸化作用使得微管關(guān)聯(lián)蛋白從微管上解離，進(jìn)而參與微管的動(dòng)力學(xué)作用、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞極性決定和細(xì)胞形態(tài)改變等機(jī)體內(nèi)的多項(xiàng)生理調(diào)節(jié)功能。在早期的研究中，MARKs家族的功能主要集中在細(xì)胞微管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的調(diào)控以及細(xì)胞極性的調(diào)控方面。具體體現(xiàn)為MARKs可

7、以磷酸化修飾Tau蛋白，從而使Tau蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的微管分離4。Thies等人研究中指出Tau蛋白是微管關(guān)聯(lián)蛋白，它的解離能夠引起神經(jīng)細(xì)胞的軸突變性，微管網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定5。其中，Mark2的過表達(dá)在Chen等人的研究中被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)細(xì)胞中軸突的形成有關(guān)，此外，Mark2還被發(fā)現(xiàn)能夠參與細(xì)胞極性的決定6。除了細(xì)胞極性以及微管穩(wěn)定性方面的調(diào)控作用，MARKs家族越來越多的功能被逐漸發(fā)現(xiàn)。例如促進(jìn)細(xì)胞凋亡、參與糖代謝、維管束的形成、參與能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等等。有研究表明Mark2不但參與學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控，而且作用于生殖和免疫系統(tǒng)的平衡7-8，并且在葡萄糖代謝和能量代謝方面也有著重要的作用。例如

8、在Hurov J等人9發(fā)現(xiàn)Mark2-/-敲除鼠在高脂日糧的誘導(dǎo)下，胰島素敏感性和機(jī)體的代謝率都有所增強(qiáng)，而脂肪沉積和體增重有所減少，敲除鼠的白色脂肪組織（WAT)和褐色脂肪組織(BAT)中，葡萄糖的吸收較之對照組，被明顯促進(jìn)了。此外，對另一家族成員Mark3的研究發(fā)現(xiàn)這一成員在機(jī)體能量平衡的調(diào)節(jié)中也有著重要的作用。在Mark3-/-敲除鼠中，飼喂正常日糧時(shí)，敲除鼠的能量消耗增加，體脂的沉積減少，胰島素敏感性也降低；飼喂高脂日糧時(shí)，敲除鼠體增重減少，葡萄糖吸收增強(qiáng)，胰島素敏感性也增加，而且無肥胖體征或肝臟脂肪變性出現(xiàn)10。然而同為Par-1家族激酶成員的Mark4，其生理功能的研究，較之家族的

9、其他成員較少，其具體功能目前仍不清楚。3.1.3 Mark4研究近況有報(bào)道稱，Mark4S 亞型在腦中大量表達(dá)，這預(yù)示著該很可能參與神經(jīng)元的分化，而Mark4L 亞型在肝癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，這預(yù)示著該亞型，可能會(huì)參與細(xì)胞周期調(diào)控 3。此外，在Sun等人11研究中，Mark4敲缺小鼠可通過上調(diào)棕色脂肪活性，表現(xiàn)出食欲過勝、活動(dòng)量增多、代謝率增加的效應(yīng)，從而有效抵制高脂日糧引起的肥胖。該研究進(jìn)一步指出，Mark4缺乏可減輕胰島素抵抗相關(guān)的飲食誘導(dǎo)肥胖，而該作用是通過增加并激活胰島素刺激的AKT 磷酸化來實(shí)現(xiàn)；Mark4缺失可通過上調(diào)并活化AMPK 相關(guān)激酶來維持體內(nèi)葡萄糖代謝的穩(wěn)態(tài)。

10、據(jù)已有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)能夠底物磷酸化作用于4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，從而生成3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，而PIP3能夠通過PKB/Akt等下游的諸多細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、能量平衡、糖代謝、脂類代謝等生理反應(yīng)12-13。此外，PI3K/Akt還能夠抑制細(xì)胞的線粒體凋亡通路：首先通過磷酸化促凋亡蛋白Bad而使之發(fā)生降解，從而增加抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xl的活性，最終抑制凋亡14。綜上所述， PI3K/Akt信號(hào)通路很可能在Mark4促進(jìn)脂沉積的過程中起著重要的作用，并且涉及線粒體功能的改變。另外，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過磷酸化從而降解I

11、B，然后活化NF-B，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的存活。3.2 線粒體功能相關(guān)機(jī)理的研究在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體是脂肪酸氧化、氧化磷酸化和ATP合成的主要場所1，也是很多代謝活動(dòng)的重要調(diào)控者，例如糖代謝，脂代謝，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡2。線粒體功能紊亂可以引起一系列的人類疾病，例如糖尿病，肥胖，癌癥， 衰老， 心血管疾病，神經(jīng)性退化疾病等15。PGC-1 這類共轉(zhuǎn)錄共激活因子是線粒體生物合成的主要誘導(dǎo)物16。許多研究表明，脂肪化的肝臟中，線粒體的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，比如線粒體腫脹，線粒體嵴扭曲17-18。有研究表明，膽固醇合成的增加，可以抑制線粒體功能的發(fā)揮，并降低了線粒體合成蛋白質(zhì)的能力，這一現(xiàn)象揭示了細(xì)胞脂質(zhì)代謝

12、的改變可以影響線粒體功能這一規(guī)律19。另有研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可通過激活肌肉中的AMPK信號(hào)通路，從而增加血漿中脂聯(lián)素的含量，并且增加有關(guān)線粒體功能和脂肪氧化中關(guān)鍵基因的表達(dá)20。據(jù)研究報(bào)道，在3T3-L1細(xì)胞的分化過程中，線粒體的異常蓄積可能與脂肪酸的氧化和葡糖糖的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)21。而Kim等人在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞研究中，添加了誘導(dǎo)劑以及線粒體呼吸鏈的抑制劑魚藤酮，在相關(guān)處理之后，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的分化表現(xiàn)異常，主要是甘油三酯形成被顯著降低了。因此推測線粒體與脂代謝密切相關(guān)22。最近研究表明，脂肪細(xì)胞分化過程中線粒體生物合成增加23，但在肥胖db/db小鼠的脂肪細(xì)胞的線粒體的數(shù)量減少24-25。

13、這些數(shù)據(jù)表明，線粒體的發(fā)生是脂肪細(xì)胞分化以及代謝活動(dòng)所必需的，脂肪細(xì)胞肥大過程伴隨著線粒體數(shù)量的減少。mtTFA是一種重要的核編碼線粒體基因，調(diào)控線粒體基質(zhì)蛋白和線粒體DNA的表達(dá)26。EH Koh25研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的NRF-1基因3T3L1 脂肪細(xì)胞中過表達(dá)增加了mtTFA 表達(dá)和 mtDNA 含量，并且伴隨著脂聯(lián)素分泌的增加近年來，肥胖發(fā)生時(shí)的線粒體功能紊亂一直是研究熱點(diǎn)。有研究報(bào)道了在嚙齒動(dòng)物骨骼肌中AMPK 的活化既可以增加線粒體的生物合成也可以增加線粒體的活性。而在AMPK-2 的敲缺鼠中，PGC-1表達(dá)量減少，和活化AMPK可增加線粒體生物合成這一結(jié)果一致27。在肥胖動(dòng)物模型中

14、，脂聯(lián)素激活的 AMPK 可以增加肌肉和肝臟中的脂肪的氧化，并且增加胰島素的敏感性28。有研究揭示，活化的AMPK 促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase，ACC) 的磷酸化作用，減少丙二酰輔酶A的表達(dá)， 增加 CPT-1 的活性和線粒體中脂肪酸的氧化29-30?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)皆揭示了AMPK的激動(dòng)劑可以同時(shí)增加線粒體的數(shù)目和線粒體的氧化能力。AMPK/ACC2信號(hào)通路也可以為為本試驗(yàn)提供理論上的機(jī)理解釋。 綜上所述，線粒體功能與脂代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、肥胖、糖尿病等代謝綜合癥等相關(guān)過程的發(fā)。生有著密切的聯(lián)系，并且其中可能涉及JNK

15、s、AMPK-ACC、Akt等多條信號(hào)通路的參與。但是Mark4是否影響線粒體功能，又是否通過線粒體功能影響其他相關(guān)生理功能的實(shí)現(xiàn)，還有待研究。4.研究內(nèi)容（1）Mark4對3T3-L1脂肪細(xì)胞中線粒體的形態(tài)學(xué)影響；（2）Mark4對線粒體膜電位變化的影響；（3）細(xì)胞色素C免疫熒光檢測；（4）線粒體功能關(guān)鍵基因的表達(dá)水平變化。5.研究方法及技術(shù)路線(1) 研究方法: 培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Mark4超表達(dá)載體和干擾載體，利用熒光顯微鏡觀察觀查細(xì)胞中線粒體形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中線粒體膜電位變化，通過免疫熒光染色技術(shù)測定細(xì)胞色素C的熒光變化，采用定量PCR技術(shù)和蛋白雜交等檢查線粒體

16、功能相關(guān)基因的表達(dá)水平。(2) 技術(shù)路線:Mark4超表達(dá)與干擾質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞線粒體關(guān)鍵基因與mtDNA數(shù)量變化線粒體相關(guān)通路水平檢測線粒體膜膜電位變化Cytc-C的表達(dá)水平變化線粒體數(shù)量、嵴變化關(guān)鍵標(biāo)志指標(biāo)檢測機(jī)理驗(yàn)證形態(tài)學(xué)分析Mark4影響3T3-L1前體脂肪細(xì)胞線粒體功能6.預(yù)期結(jié)果（1）闡明Mark4對線粒體功能的影響；（2）探討Mark4可能通過對線粒體的作用。7.研究的創(chuàng)新點(diǎn)本試驗(yàn)首次通過基因功能研究方法即超表達(dá)和干擾Mark4基因轉(zhuǎn)染前體脂肪細(xì)胞系3T3-L1細(xì)胞，闡明Mark4對3T3-L1細(xì)胞中線粒體的形態(tài)學(xué)影響、線粒體發(fā)育的影響，并從信號(hào)通路對相關(guān)

17、調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了探討。8.所需的主要儀器設(shè)備和試劑及工作條件(1) 儀器設(shè)備:PCR擴(kuò)增儀(Veriti 96 Well Thermal Cycle)、電子天平、常溫高速離心機(jī)、低溫冷凍離心機(jī)、移液器、高壓滅菌鍋、凝膠成像儀、超凈工作臺(tái)等。(2) 試劑：Trizol（TaKaRa公司）；質(zhì)粒抽提試劑盒（Omega公司）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶（Fermentas公司）；DNA Marker（天根公司）；TurboFect in vivo Transfection Reagent（Fermentas公司）；DME

18、M(高糖)干粉（Gibco公司）；HEPES、胰蛋白酶（Merck公司）；胎牛血清FBS（四季青公司）；引物（上海生工公司）；蘋果酸脫氫酶1(MDH) 和細(xì)胞色素C (Cytc) 一抗（Bioword公司），二抗（武漢博士德公司）；MyHC一抗MF-20（美國DSHB公司），二抗羊抗鼠IGg2b（英駿公司）等。9.論文工作進(jìn)展安排工作進(jìn)展安排表時(shí)間Time工作進(jìn)展安排Work arrangement2014.11-2014.12收集資料，撰寫開題報(bào)告，學(xué)習(xí)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)2014.12-2015.02篩選Mark4干擾質(zhì)粒載體，檢測超表達(dá)及干擾效率2015.02-2015.04Mark4對線粒體功

19、能相關(guān)指標(biāo)的影響2015.04-2014.05整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果2015.06撰寫本科學(xué)位論文，答辯10.經(jīng)費(fèi)預(yù)算經(jīng)費(fèi)預(yù)算表用途金額（元）胎牛血清500DMEM(高糖)干粉 200HEPES、胰蛋白酶100實(shí)時(shí)定量檢測試劑500質(zhì)粒提取試劑盒100測序費(fèi)用100RNA提取試劑盒100反轉(zhuǎn)錄試劑盒300抗體400JC-1染液、DAPI染料100其它試劑400文印費(fèi)200合計(jì)300011研究工作中面臨的技術(shù)難點(diǎn)和擬采取的解決辦法（1）學(xué)習(xí)動(dòng)物生化中脂類代謝及其調(diào)控的基礎(chǔ)理論知識(shí)；(研讀生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等專業(yè)書籍，夯實(shí)基礎(chǔ)知識(shí)；閱讀大量文獻(xiàn)，熟悉研究進(jìn)展)（2）掌握分子生物學(xué)中PCR

20、和Western Blot等技術(shù)。（向老師、高年級(jí)同學(xué)請教，上網(wǎng)查詢）12參考文獻(xiàn)1 Kadenbach B, Ramzan R, Vogt S. High efficiency versus maximal performancethe cause of oxidative stress in eukaryotes: a hypothesisJ. Mitochondrion, 2013, 13(1): 1-6.2 Diaz F, Moraes C T. Mitochondrial biogenesis and turnoverJ. Cell calcium, 2008, 44(1): 24-

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