醫(yī)學資料4-分子流行病學

1、動物病毒性疾病分子流行病學研究方法 江西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院何后軍 教授聯(lián)系電話-mail: hehoujun精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日分子流行病學1972年Kilbourne 博士在美國傳染病學會第10次年會上作了題為“流感的分子流行病學”的報告。 1977年法國Higginson認為“分子流行病學”是應用復雜精細的技術進行生物材料的流行病學研究。1982年Perera與Weinstein在分子流行病學基礎上,提出了“癌癥分子流行病學” (molecular cancer epidemiology)精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星

2、期日一 產(chǎn)生的背景(一)疾病預防控制中的需求傳染性疾病 耐藥性質粒；病原體變異；新發(fā)現(xiàn)傳染病。 慢性非傳染病 多病因、多階段、多基因、長潛隱期。人群易感性 生物個體間的遺傳和環(huán)境不同，易感性差異很大；傳統(tǒng)流行病學無法有效測量。實驗醫(yī)學 實驗醫(yī)學的病因假設和防治措施的人群檢驗。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日一 產(chǎn)生的背景(二)分子生物學的快速發(fā)展理論的突破 如：DNA雙螺旋結構，遺傳中心法則，遺傳密碼子，RNA逆轉錄，斷裂基因，操縱子模型，限制性內(nèi)切酶，DNA聚合酶，DNA連結酶，染色體外遺傳物質等。技術的創(chuàng)新 凝膠電泳技術，核酸體外擴增，DNA測序，蛋白質測序，分子雜交，基因

3、克隆，色譜技術，計算機應用。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日定義分子流行病學(molecular epidemiology)是應用先進的技術測量生物標志的分布情況，結合流行病學現(xiàn)場研究方法，從分子或基因水平闡明疾病的病因及其相關的致病過程，并研究疾病的防治和促進健康的策略和措施的科學。 生物標志（biological marker，biomarker，簡稱M） 指能代表生物結構和功能的可識別物質。分子事件（molecular event）或分子生物標志（molecular biomarker）主要指代表生物結構和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白質等。精品醫(yī)學資料 歡

4、迎下載2021/7/18 星期日現(xiàn)代流行病學遇到的難題（1）傳染病方面：病原生物的多樣性和多變性，如流感病毒、艾滋病毒 ；抗生素廣泛應用，耐藥性病原體不斷出現(xiàn)；新發(fā)現(xiàn)的傳染病，SAS等 傳統(tǒng)表型研究 從分子或基因水平闡明 （2）研究個體的發(fā)病差異 根本闡明個體差異必須從分子水平研究 （3）證實疾病的病因 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日(三)分子流行病學的發(fā)展研究內(nèi)容更加豐富 傳染病、慢性非傳染病、健康狀態(tài)。研究手段越來越多 主要是分子生物學方法和技術。應用范圍不斷擴大 流行病學、預防醫(yī)學、基礎醫(yī)學、生物學、遺傳學、環(huán)境科學和人類學等。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18

5、星期日研究的水平不同： 傳統(tǒng)流行病學：宏觀水平或表型 分子流行病學：微觀水平或基因水平所解決的問題不同： 傳統(tǒng)流行病學：可闡明暴露與發(fā)病之間的聯(lián)系，但不能揭示疾病發(fā)生的機制（黑匣子）。 分子流行病學：既可闡明暴露與疾病之間的聯(lián)系，又可揭示疾病發(fā)生的機制。即可以闡明疾病的自然史。二、與傳統(tǒng)流行病學的關系精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日 暴露 - 暴露(E)與劑量(ED) 結局 -健康態(tài)(HC) 機體臨床態(tài)(CD) (健康疾病連續(xù)帶) 傳統(tǒng)流行病學分子流行病學 暴露生物標志- 外暴露標志(EEM)與劑量(EED) 內(nèi)暴露標志(IEM)與劑量(IED) 生物作用標志(BAM)與劑量(

6、BAD) 健康疾病連續(xù)帶：健康態(tài)亞健康態(tài)潛在疾病態(tài)臨界疾病態(tài)亞臨床態(tài)臨床態(tài) 效應生物標志： HCM EBEM ASFM PM SCCM CDM 易感生物標志-易感標志與水平(SM & SL)精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日三、與分子生物學的關系 研究對象不同: 分子生物學：個體 分子流行病學：群體 研究內(nèi)容和方向有所不同: 分子生物學：基礎研究（方法學研究） 分子流行病學：應用研究（指導疾病治）精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日分子流行病學的特點與傳統(tǒng)流行病學的區(qū)別 1.研究水平不同 宏觀水平 微觀水平 2.所解決問

7、題不同 揭示“黑匣子”之謎與分子生物學的區(qū)別 1.研究對象不同 個體 群體 2.研究內(nèi)容和方向有所不同 側重基礎，側重應用精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日分子流行病學的主要研究內(nèi)容傳染病病因及流行規(guī)律的探討非傳染病病因及病因致病機制研究疾病易感性的測定疾病防治措施的研究疾病治療效果和預后評價生物標志（測量指標）的研究暴露測量及其與疾病的關系效應測量及其與疾病的關系易感性測量及其與疾病的關系疾病防治效果評價 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日傳染病病因及流行規(guī)律的探討對已知傳染病，通過分子流行病學研究可闡明病原體特點，能更準確地分析其傳染源和傳播途徑；對新發(fā)現(xiàn)的傳染

8、病，可以盡快確定傳染病的病因和流行規(guī)律。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日1、研究已知傳染病的病原體和流行特點基因水平研究病原體 快速準確闡明 其特點分析病因、傳染源和傳播途徑 利于防治流行或爆發(fā)時 病原體的鑒定和分型十分重要傳統(tǒng)：從表型進行鑒定、分型 不穩(wěn)定或無法進行分型現(xiàn)在：從分子或基因水平鑒定、分型 直接反映其遺傳本質、特點 穩(wěn)定可靠精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日2、研究新發(fā)傳染病病原體和流行特點新發(fā)傳染病分子流行病學研究方法查找病原體，確定遺傳特點闡明病因、傳播規(guī)律和流行特點如庚肝的發(fā)現(xiàn)和心肌V.分離 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日非傳

9、染病病因及病因致病機制研究病因復雜 環(huán)境因素+遺傳因素通過分子流行病學的研究方法可闡明疾病發(fā)生的遺傳本質、環(huán)境因素致病的分子基礎，為疾病的防治提供理論依據(jù)。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日二、疾病易感性的測定個體對疾病都存在一定的感受性，稱之易感性以往認為：只有傳染病才有確定易感性 特異Ab傳染性疾病的易感性與機體某些基因類型有聯(lián)系，決定免疫反應的方式與強度慢性病也存在易感性，與個體基因型別或序列或其表達產(chǎn)物有關 遺傳易感性精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日三、疾病防治措施的研究傳染病的預防 通過分子流行病學手段，可以研究疫苗的預防效果、疫苗株引起的感染以及疫苗的

10、逃逸株等問題。非傳染病的防治 分子流行病學通過研究病因的致病機制，為三級預防奠定理論基礎。 以腫瘤為例精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日四、疾病治療效果和預后評價從分子或基因水平評價治療措施的效果及判斷預后，更客觀、快速、準確、節(jié)約對基因治療，可能是唯一可行的評價方法。通過檢測患者體內(nèi)是否有導入的基因及導入的基因表達情況，判斷治療效果。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標志與分子生物學標志生物標志(biological markers，biomarkers)是宿主生物材料(組織、體液、細胞)中可測量的細胞的、生物化學的、免疫的或分子的改變。 是可以測量的、能代表

11、生物結構和功能的大分子物質，如DNA、RNA或蛋白質等。分子生物學標志(molecular biomarkers) 能反映分子水平、基因水平的DNA損傷、變異和表達的蛋白質分子的生物標志。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標志的分類在暴露-疾病鏈中，一般可將生物學標志分為:體內(nèi)劑量標志、生物有效劑量標志、生物學反應標志、疾病標志，此外，尚有易感性標志：起著重要作用,是決定疾病能否發(fā)生的主要因素。常用按疾病發(fā)病過程進行分類，根據(jù)疾病發(fā)生的不同階段出現(xiàn)不同的標志,分為三類：暴露標志、易感性標志和效應或疾病標志精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日五、生物標志暴露標志(e

12、xposure marker) 與疾病或健康狀態(tài)有關的暴露因素的生物標志，包括外暴露標志和內(nèi)暴露標志。 效應標志 指宿主暴露后產(chǎn)生功能性或結構性變化的生物標志，如突變的基因、畸變的染色體等。 易感標志 指宿主對疾病發(fā)生、發(fā)展易感程度的生物標志。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日外暴露標志：是指暴露因素進入機體之前的標志和劑量生物性：微生物、寄生蟲、生物毒素等;非生物性：某些化學和物理因素，如吸煙煙霧、環(huán)境物質等。內(nèi)暴露標志：指暴露因素進入機體之后的標志生物性病原因子：可以是生物病原因子本身、其代謝產(chǎn)物或與宿主體內(nèi)生物大分子結合產(chǎn)物，像病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等非生物

13、性病原因子：可以是體內(nèi)轉運分子、代謝產(chǎn)物或與宿主靶體結合物等，如暴露于苯并(a)芘后，在淋巴細胞中能檢測到特異的DNA加合物。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日易感性標志(susceptibility marker)易感性標志：指宿主對疾病發(fā)生、發(fā)展易感程度的生物標志，如宿主的遺傳特征、營養(yǎng)、免疫、機體的活動狀態(tài)等。是在暴露之前就已存在的遺傳性或獲得性的可測量指標，決定著機體對疾病發(fā)生、發(fā)展的易感程度。可以探討疾病發(fā)生的個體差異。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日效應標志(effect marker)或疾病標志(disease marker)宿主暴露于某種因素后產(chǎn)生

14、結構或功能性變化的生物性標志，如突變的基因、畸變的染色體、特異抗體、細胞因子等。 在病后的不同階段，其效應標志不同精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標志的篩選要求：具有較好的特異性和穩(wěn)定性 檢測方法具有較高的靈敏度，特異度高檢測方法快速、簡便依據(jù)：研究目的、生物學標志的本身特性、在疾病過程中的意義、檢測方法、生物學標志與所要代表的特定階段的關聯(lián)程度。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標志特性分子特性 化學結構、組成、物理特性和穩(wěn)定性等時相特性 即生物學標志存在的時間長短及其在暴露至疾病不同階段的表現(xiàn)和意義。 變異性 - 個體內(nèi)變異 生物標本采集時間、部位等

15、不同造成 - 個體間變異 不同生物個體的檢測結果不相同 - 群體間變異 不同生物群體的檢測結果不相同 - 儲存變異 生物標志的生物特性、儲存條件、儲存時 間等都會影響其檢測結果精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標志檢測方法實用性 研究樣本一般較大一定的實驗室條件可信性 可信性強 有效性 靈敏度和特異度，注意區(qū)分流行病學的靈敏度和實驗室測量中所謂的敏感性的不同精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日暴露測量外暴露研究 指環(huán)境因素暴露，分為生物性因素和非生物性因素。作為分子流行病學測量的生物標志一般是生物性病原因子，如病原生物、生物毒素等。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/

16、7/18 星期日生物性病原因子檢測鑒定 流感嗜血桿菌 病原生物進化變異規(guī)律研究 O157大腸桿菌確定傳播途徑 S.munchen菌感染 非生物性因素的暴露測量 吸煙煙霧 可研究病原生物分型、分類和檢定是最有效手段、研究病原生物變異的規(guī)律等。這是傳染病分子流行病學的重要使命。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日內(nèi)暴露研究傳染性疾病 應用分子生物學方法直接檢測病原體的生物大分子物質如核酸、蛋白質等，使我們能夠準確地判斷人體是否感染疾病，即感染狀況；用分子生物學技術鑒定各感染者所感染病原體之間的遺傳關系，可追蹤傳染源 慢性非傳染性疾病 內(nèi)暴露水平 生物作用水平精品醫(yī)學資料 歡迎下載202

17、1/7/18 星期日效應測量傳染病 免疫效應：測定體內(nèi)抗體變化可以判斷機體感染狀態(tài)。 病理性效應：測量機體損害性的生物標志可以判斷病原生物感染的病理效應。 慢性非傳染病 基因表達異常和代謝異常 基因突變或染色體畸變 健康狀態(tài)：一個群體從疾病到健康或從健康到疾病也是一個連續(xù)帶。通過健康狀態(tài)相關生物標志分布的研究，如生長、發(fā)育和衰老，可以為探討影響健康的因素、制訂促進健康的策略和措施提供科學依據(jù)。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日易感性測量探明遺傳病易感(致病)基因、分布規(guī)律、影響因素和防制手段， 傳染病和寄生蟲病的易感性水平高低可以從兩個方面評判，一是特異抗體水平，二是對該病原體

18、致病的遺傳易感性。第二方面則是分子流行病學研究的重要內(nèi)容之一。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日疾病防治效果評價預防評價：分子生物學技術可用于傳染病的預防效果評價中，如疫苗接種后的免疫學效果、也可以對不同人群采取措施與否的感染情況進行分析。另外也可用于預防接種發(fā)病研究。 治療評價：應用分子流行病學進行治療措施的效果評價比以臨床診斷為依據(jù)的效果評價要節(jié)約時間、費用和人力，而且更加客觀。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日應用生物學標志的意義能精確測量暴露因素及其水平；揭示生物學反應的早期事件;判定宿主的易感性;提高篩檢和診斷疾病的準確性和精確性;評價治療措施或干預措

19、施的效果;估計疾病的預后;有效控制病因推斷過程中的混雜因素;揭示疾病的發(fā)病機理。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日分子流行病學應用的主要研究方法 測量指標 標本采集 現(xiàn)場調(diào)查研究方法 實驗室檢測技術 研究設計 資料分析 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日測量指標的選擇的原則生物標志應特異、穩(wěn)定標本采集、儲存方便檢測方法比較簡單、實用，而且操作規(guī)范，便于 與同類研究結果比較檢測方法靈敏度和特異度高精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日測量指標暴露指標 最好能代表接觸劑量或生物作用劑量 易感性指標 一般選擇抗體水平作為傳染病易感性指標，易感基因及其表達產(chǎn)物等作

20、為心腦血管病、惡性腫瘤、糖尿病、遺傳病等慢性非傳染病的易感性標志。效應指標 一般以最早期生物效應標志作為探索暴露因素的致病作用或干預措施的短期效果評價指標，如抗體產(chǎn)生、代謝異常、基因表達異常等選擇結構和功能改變作為確定暴露的致病作用和早期診斷、早期預防的指標臨床診斷標志作為干預措施長期效果評價或預后的指標精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日標本采集生物標本 一般包括病原的和人體的生物標本。常用的有：微生物標本、血液（血清）標本、組織標本、其他生物標本（如唾液、胃液、尿液、精液、頭發(fā)、媒介生物等） 生物標本庫 通常將儲存有一種類型或多種類型生物標本，并能保持它們的生物活性以供研究之用

21、的系統(tǒng)稱為生物標本庫(biological specimen bank, BSB)，如血清庫、組織庫、病原生物庫等。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日生物標本采集和儲存 分子流行病學研究成功的關鍵要求在采集和儲存過程中不能受到“污染” 儲存的生物標本在任何時候進行檢測都可以獲得一致的結果所有的生物標本都應有詳細的背景材料和鑒別標識精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日現(xiàn)場調(diào)查研究方法傳統(tǒng)的現(xiàn)場流行病學研究方法 ,即描述性研究、分析性研究與干預性研究均可應用于分子流行病學。一般需要的樣本量相對較小 不宜作大規(guī)?，F(xiàn)場調(diào)查研究 分子流行病學在橫斷面研究中多是小樣本抽樣調(diào)查，在

22、分析性研究中多為病例對照研究、隊列與病例對照結合的巢式病例對照研究、病例-病例研究等，在實驗性研究也多采用小樣本隨機對照試驗。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日實驗室技術標本的采集與儲存：生物標本：病原的、動物的生物標本。 生物標本庫（biological specimen bank, BSB）：是指儲存有一種類型或多種類型生物標本，并能保持它們的生物活性以供研究之用的系統(tǒng)。 常用的生物標本：微生物標本、血液標本、組織標本、其他生物標本（如唾液、胃液、尿液、精液、頭發(fā)、媒介生物） 生物標本儲存: 冷藏（0短期儲存, -80長期儲存） 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期

23、日生物標本采集和儲存是研究成功的關鍵 要求： （1）在采集和儲存過程中不能受到“污染”，包括外界生物的、化學的和其他標本的“交叉污染”。 （2）儲存的生物標本在任何時候進行檢測都可以獲得一致的結果。 （3）所有的生物標本都應有詳細的背景材料和鑒別標識。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日實驗室常用檢測技術核酸技術 核酸電泳圖譜 核酸酶切電泳圖譜 核酸分子雜交 核酸體外擴增 核酸序列分析 PCR蛋白質技術 凝膠電泳、蛋白轉印雜交、色譜分析、蛋白質測序酶學技術 多位點酶電泳法 生物芯片技術 基因芯片 其他技術 免疫學技術 如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光免疫試驗(FIA) 等；色

24、譜技術 如高效液相色譜技術(HPLC)等精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日研究設計要點：研究假設的建立： 力求明確，并有相應的分子生物學技術可予以檢驗。研究模式的選擇： （見調(diào)查研究方法）生物標志的選擇： 既要考慮到標志物的特異性、檢測的敏感性、穩(wěn)定性以及費用等，更要考慮研究的假設或目的。 以上構成了分子流行病學研究設計中的三個相互聯(lián)系的基本要素，而研究假設首當其沖。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日遺傳因素的考慮 應與遺傳流行病學研究設計一并考慮。宏觀資料的收集：不應忽視偏倚的控制： 選擇偏倚：樣本選擇偏倚、標本采集偏倚（如采集的部位、時間、機體狀態(tài)、方法等）

25、信息偏倚：檢測偏倚、標本儲存偏倚（儲存條件和時間）。 混雜偏倚：也可出現(xiàn)。輔以動物實驗研究問題 動物實驗可以較好控制 影響因素，連續(xù)采樣、動態(tài)觀察研究樣本量的估計問題 原理和方法同一般流行病學研 究設計。 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日資料分析傳統(tǒng)流行病學分析 生物標志發(fā)生率、檢出率、危險度；均數(shù)、標準差等 血清流行病學分析 抗體的幾何平均滴度、陽性率、感染率等 遺傳多態(tài)性分析 等位基因頻率、遺傳多態(tài)度、雜合度等遺傳關系分析過 遺傳一致性(如相似系數(shù)S)、遺傳差異(如 遺傳距離D) 遺傳關系樹等精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日研究設計研究目的 充分考慮創(chuàng)新性、

26、實用性、可行性 測量指標 生物標志是否特異、穩(wěn)定，標本采集是否方便，是否有靈敏而特異的檢測方法測量方法 簡便、成熟，靈敏度和特異度高 調(diào)查方法與樣本 樣本有代表性，適量結果與分析 設計中要預測研究結果，并根據(jù)選擇的測量指標和測量方法確定資料分析方法 質量控制 注重現(xiàn)場質量控制的同時，特別重視實驗室的質量控制 注意事項 預實驗 精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日基因型(genotype)：具有相同遺傳結構的一類生物體。 克隆(clone)：廣義 許多生物特征（表型或基因型）相同的生物體，雖然分離來源、地區(qū)、時間可能不同，但它們的這些特征幾乎只能解釋為共同來源，則這些生物體稱為一個克

27、隆。狹義 一個生物體的無性繁殖群體，稱為一個克隆。克隆群(clone cluster)：遺傳關系非常緊密的多個生物克隆，可以劃分為一個克隆群。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日實例一研究題目 人漢坦病毒?。⊿NV）與病毒宿主關系的確定測量標志 （SNV）/鹿鼠組織、血清、肺；死者取肺組織、存活者采集外周血單核細胞（介質） 測量方法 PCR、Western blotting研究設計SNV 病毒的序列患者住宅的鹿鼠、附近對照住宅的鹿鼠、遠處對照住宅的鹿鼠，所攜帶SNV 病毒的序列比對；用蛋白印跡法進行SNV 的 IgM和IgG抗體檢測患

28、者和死亡者的感染情況；用反轉錄PCR(RTPCR)擴增SNV RNA 中的特征片段 ,比較該片段上患者體內(nèi)病毒與鼠攜帶病毒的基因序列，應用種系發(fā)生分析法判定病毒與宿主的聯(lián)系。結果分析從基因水平證明了該病毒是由鹿鼠傳染給人的；證明暴露地點為家庭居住地結論：本研究將先進的分子生物學技術和流行病學現(xiàn)場調(diào)查有機地結合起來。采用分子流行病學方法 ,有力地證實了 SNV 病毒是經(jīng)鹿鼠傳播給人的 ,并明確了暴露地點 ,有助于深入研究相關因素 ,以有效地控制漢坦病毒肺綜合征的發(fā)生與流行。精品醫(yī)學資料 歡迎下載2021/7/18 星期日實例二 研究目的研究布魯氏菌的生物標志測量指標布魯氏菌的核苷酸序列同源性測量方法 基因外重復回文PCR(REPPCR)、細菌內(nèi)基因重復一致PCR(ERICPCR)和核酸測序 研究設計 研究者選擇了來自近 20 個國家和地區(qū)的 34 株