顯微技術(shù)第六章原位雜交組織化學(xué)技術(shù)

1、第六章 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)(jsh)共一百一十三頁(yè) 核酸的分子雜交(molecular hybridization)技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的堿基互補(bǔ)原則(yunz)而發(fā)展起來的。共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)核酸(h sun)雜交 菌落原位雜交 斑點(diǎn)雜交法固相雜交 Southern印跡雜交 Northern印跡雜交 組織(zzh)原位雜交 吸附雜交、液相雜交 發(fā)光液相雜交、 液相夾心雜交 共一百一十三頁(yè) 原位雜交屬于固相核酸分子雜交的范疇(fnchu)，但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一

2、種核酸分子雜交技術(shù)：菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交；斑點(diǎn)雜交是檢測(cè)特定的DNA片段；Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段；Norhtern印跡雜交法是用以檢測(cè)某一特定RNA片段；共一百一十三頁(yè)分子雜交(zjio)技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本(yngbn)中是否含有特定的生物分子的一門技術(shù)。樣 品 制 備電 泳雜 交轉(zhuǎn) 膜結(jié)果顯示探 針 制 備分 子 雜 交 原 理 及 流 程 圖共一百一十三頁(yè)原位雜交組織化學(xué)技術(shù)(in situ hybridization histochemistry；ISHH) 簡(jiǎn)稱原位雜交,是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序

3、列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)(h b)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。 共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè) 核酸分子雜交除了能在變性的單鏈DNA間進(jìn)行外，在DNA與RNA間、RNA與RNA間，以及寡核苷酸與DNA或RNA間也可通過堿基配對(duì)(A-T、CG、AU)實(shí)現(xiàn)分子雜交。因此，核酸分子雜交所用的探針種類可以是DNA、RNA或寡核苷酸。探針的標(biāo)記物常用的有放射性核素和非放射性核素性化學(xué)物質(zhì)兩大類。其作用在于雜交后輔以感光(gn gung)或化學(xué)反應(yīng)，顯示與探針互補(bǔ)的靶核酸(DNA或RNA)共

4、一百一十三頁(yè) DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè) 應(yīng)先將雙鏈DNA分子通過(tnggu)變性解聚成單鏈后再進(jìn)行雜交。 單鏈核酸分子則不需變性即可直接進(jìn)行雜交。 雜交雙鏈即雜交體的穩(wěn)定程度與它的變性或熔解溫度（Tm）有關(guān)，Tm 值越高，雜交體越穩(wěn)定。影響雜交體Tm值的因素主要包括以下幾個(gè)方面：共一百一十三頁(yè)（1）雜交雙鏈的堿基組成：GC之間有三個(gè)氫鍵，AT之間或AU之間有兩個(gè)氫鍵，故（GC）含量越高的雜交雙鏈Tm值越高。（2）雜交雙鏈的長(zhǎng)度：雜交雙鏈越長(zhǎng)，Tm值越高。（3）雜交雙鏈的堿基錯(cuò)配程度：錯(cuò)配的堿基越多，即錯(cuò)配的程度越高，Tm值越低。（4）溶液中的離子(lz)

5、強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，Tm值越高（5）變性劑（如甲酰胺）的濃度：甲酰胺，以降低雜交反應(yīng)的溫度。 共一百一十三頁(yè)一、 核酸探針核酸探針是指已知堿基序列的核酸片段，并與待測(cè)組織的核酸片段特異性結(jié)合（堿基互補(bǔ)）。一）核酸探針的種類根據(jù)核酸性質(zhì)(xngzh)的不同，核酸探針可分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針和cDNA還有單鏈和雙鏈之分。其中用于組織細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA定位檢測(cè)的探針主要有單鏈cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針。共一百一十三頁(yè)（一）cDNA探針 cDNA是互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。 通過選擇不同的載體來控制所產(chǎn)生的 cDNA是雙

6、鏈還是單鏈。如果以質(zhì)粒作載體，則產(chǎn)生雙鏈cDNA，獲得的探針也是雙鏈 雙鏈cDNA探針的檢測(cè)靈敏度較低，較少用來(yn li)做探測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA 的原位雜交反應(yīng)。共一百一十三頁(yè) 如果將cDNA導(dǎo)入M13衍生載體中，則可產(chǎn)生大量的單鏈 cDNA。 用這種單鏈 cDNA作探針,從而提高了雜交反應(yīng)敏感性。（二）cRNA探針 cRNA探針是以DNA為模板在體外轉(zhuǎn)錄而成的探針。 以cRNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)可避免應(yīng)用(yngyng)雙鏈cDNA探針作雜交反應(yīng)時(shí)存在的兩條鏈之間的復(fù)性問題。共一百一十三頁(yè) cRNA和mRNA之間形成的雜交體要比 cDNAmRNA雜交體穩(wěn)定，因?yàn)殡s交反應(yīng)后可經(jīng)受高嚴(yán)格度洗滌。

7、cRNAmRNA雜交體不受RNA酶的影響，故雜交后還可用RNA酶處理(chl)，以除去未結(jié)合的探針。此外，用體外轉(zhuǎn)錄合成的cRNA探針的長(zhǎng)度比較一致。 共一百一十三頁(yè) cRNA探針的制備過程較復(fù)雜，需要較高的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)條件，cRNA對(duì)RNA酶敏感，易被RNA酶破壞(phui)，因而在操作過程中需要嚴(yán)格防止RNA酶污染。共一百一十三頁(yè)（三）寡核苷酸探針 寡核苷酸探針是指化學(xué)合成技術(shù)在體外合成的，一般(ybn)含1050個(gè)核苷酸的探針。寡核苷酸探針目前均由DNA合成儀合成。 在設(shè)計(jì)篩選寡核苷酸探針時(shí)應(yīng)遵守以下一些原則： （1）長(zhǎng)度一般為1850個(gè)核苷酸，過長(zhǎng)者，雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量低，過短者，

8、特異性較差。共一百一十三頁(yè)（2）堿基中（GC）含量應(yīng)在4060范圍(fnwi)以內(nèi)，超出此范圍(fnwi)則會(huì)增加非特異性雜交。（3）探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。（4）避免單一堿基重復(fù)出現(xiàn)過多，不能多于4個(gè)，如不能出現(xiàn)CCCCC。共一百一十三頁(yè) 寡核苷酸探針也有一定缺點(diǎn)，如與mRNA的雜交不如(br)RNARNA雜交穩(wěn)定，再則，因其分子較短，結(jié)合的標(biāo)記物較少，故其敏感性較低。共一百一十三頁(yè)二）核酸探針標(biāo)記的基本原理 利用核酸探針來檢測(cè)相應(yīng)的核酸，必須對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具備以下幾個(gè)條件(tiojin)： 首先，標(biāo)記后的探針分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原

9、來的分子結(jié)構(gòu)相同； 第二，標(biāo)記探針的顯示或檢測(cè)要簡(jiǎn)便、節(jié)時(shí)、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好；共一百一十三頁(yè) 第三，應(yīng)安全無害。目前用于標(biāo)記原位雜交探針的標(biāo)記物有20多種，可分為(fn wi)放射性標(biāo)記物（同位素）和非放射性標(biāo)記物。常用的同位素有32P、35S。 共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)三、原位雜交組織化學(xué)基本(jbn)技術(shù)由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體(jt)應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為： 雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等； 雜交； 雜交后

10、處理； 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。共一百一十三頁(yè)1.組織和細(xì)胞標(biāo)本的準(zhǔn)備 原位雜交技術(shù)可應(yīng)用于冷凍或石蠟片、細(xì)胞培養(yǎng)片或細(xì)胞切片等。為了獲得良好的雜交結(jié)果，組織和細(xì)胞標(biāo)本的取材和處理是十分重要的，總的目的是既要充分保留被測(cè)核酸不被降解，又要盡可能維持原有組織或細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。其基本(jbn)要求與免疫組織化學(xué)技術(shù)相似，即新鮮取材和及時(shí)固定 共一百一十三頁(yè) DNA的穩(wěn)定性較好，一般不需特殊處理。常規(guī)的石蠟或冷凍切片均適用于組織(zzh)或細(xì)胞內(nèi)DNA的原位雜交檢測(cè)，即使長(zhǎng)期保存的石蠟塊也可用于回顧性研究。 共一百一十三頁(yè) 但RNA非常容易降解(jin ji)RNA酶在周圍環(huán)境中

11、幾乎無處不在，而且一般的消毒方法不能將其滅活。防止RNA酶污染及滅活RNA酶的方法有； 共一百一十三頁(yè)標(biāo)本盡早固定，組織(zzh)固定劑可以滅活組織(zzh)內(nèi)的RNA酶；所用玻璃器皿均需經(jīng)180處理3h以上，或用新鮮配制的0.1%二乙基焦碳酸鹽(DEPC)水在室溫中處理23h；所用試劑要用DEPC水配制并經(jīng)高壓消毒；所有操作都要帶手套；各種反應(yīng)過程中注意應(yīng)用RNA酶抑制劑。只要充分注意以上各點(diǎn)，在石蠟切片上一樣可以得到良好的RNA雜交結(jié)果，而石蠟切片的組織形態(tài)較冷凍切片好得多。共一百一十三頁(yè) 用于雜交的組織或細(xì)胞標(biāo)本的固定劑與免疫組化相似，其中醛類固定劑應(yīng)用最多，尤其是用4多聚甲醛(用0.1

12、mol/L PB配制)固定可以較好地保存組織中的靶核酸，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的保存也優(yōu)于沉淀類固定劑(如乙醇)，而且同時(shí)也適用于免疫組化染色。固定時(shí)，有兩點(diǎn)需注意，一是盡量早期(zoq)固定，另一是固定時(shí)間不能太長(zhǎng)，最好采用4下固定，一般不超過24h(根據(jù)組織片的厚薄從30 min至24h)。共一百一十三頁(yè)2.雜交前處理 雜交前處理是指從石蠟切片脫蠟到預(yù)雜交前的一系列過程。其主要目的是：增強(qiáng)組織或細(xì)胞的通透性，以利于探針的穿透(chun tu)；盡可能減少與探針產(chǎn)生非特異吸附的背景。采用的方法有：共一百一十三頁(yè) 2.1.蛋自酶消化 酶消化的應(yīng)用不僅可以消除組織固定時(shí)產(chǎn)生的分子間交聯(lián)對(duì)靶核酸造成的屏蔽作

13、用，還有增加組織通透性和去除無關(guān)的雜蛋白的意義。蛋白酶消化對(duì)石蠟(sh l)切片原位雜交結(jié)果的好壞具有非常重要的影響。常用的有蛋白酶K(proteinas。K)，此外還有胃蛋白酶(pepsin)、鏈霉蛋白酶(pronase)等。共一百一十三頁(yè) 各種酶的最佳作用通常要求(yoqi)37且與反應(yīng)溶液的pH值相關(guān)，如蛋白酶K和鏈霉蛋白酶在中性pH值下才能發(fā)揮最大的酶活力，而胃蛋自酶最大活力是在PH1.82.5之間，但是，消化酶的濃度、作用時(shí)間等參數(shù)的選擇則應(yīng)根據(jù)組織的類型、固定購(gòu)程度，探針的大小、酶的批號(hào)和活性等作具體分析，經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)才能選定最佳方案。消化后剩余的酶活性常用甘氨酸浸泡或4多聚甲醛

14、后固定等方法來中止。當(dāng)然，所用的消化酶本身不能含有核酸水解酶的活性.共一百一十三頁(yè) 2.2稀酸處理 稀酸處理常用的是0.2mol/L HCl；其目的是使堿性蛋白變性，消除(xioch)其對(duì)雜交反應(yīng)的干擾，有利于靶核酸的暴露，減少背景。在蛋白酶消化后的稀酸處理還具有清除蛋白酶的作用。此外，如果雜文后所用抗體采用辣根過氧化物酶等標(biāo)記的話稀酸還有去內(nèi)源性酶活性的作用。共一百一十三頁(yè) 2.3 乙?；?組織細(xì)胞中的堿性蛋白帶有正電荷，可以與探針中的磷酸根和標(biāo)記物所帶酌負(fù)電荷產(chǎn)生靜電吸附。乙酞化的目的在于中和標(biāo)本中的正電荷，減少靜電吸附，從而(cng r)減低背景著色。常用的方法是在雜交前用0.25乙酸酐

15、或無水乙酸(溶于0.1mol/L三乙醇胺，pH8)處理切片：共一百一十三頁(yè) 2.4去垢劑 有些實(shí)驗(yàn)在雜交前還加用去垢劑處理切片或在其他溶液中加入去垢劑，以溶解細(xì)胞(xbo)的膜蛋白，增強(qiáng)探針的通透性。常用的去垢劑是0.01一0.3的Triton X100。類似的增強(qiáng)通透性的措施還有反復(fù)凍融、用乙醇和二甲苯等溶劑處理切片等。共一百一十三頁(yè) 3.雜交 雜交即指序列互補(bǔ)的探針與靶核酸間的配對(duì)結(jié)合。這是原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟：雙鏈的探針雜交前要事先解鏈(變性)，若探針和靶核酸均為DNA則可將探針墑加在標(biāo)本上后一起變性。常規(guī)的變性方法(fngf)是用高溫處理切片(90一100，510 min)，也可用酸

16、(Hcl)或堿(NaOH)處理。 共一百一十三頁(yè) 理論上解離的核酸互補(bǔ)鏈，重新形成堿基配對(duì)的螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)性(雜交)速度取決于：反應(yīng)溫度；正離子濃度；DNA濃度；DNA片段大小(dxio)。由于雜交是兩條單鏈間的隨機(jī)結(jié)合，雙鏈DNA探針和DNA靶核酸變性后的復(fù)性過程中也可能發(fā)生探針和靶核酸自身兩條鏈的重新結(jié)合，此外，探針還可能與組織內(nèi)堿基順序相似的核酸以及其他無關(guān)結(jié)構(gòu)非特異結(jié)合(吸附)。共一百一十三頁(yè) 因此，欲達(dá)到最佳的信號(hào)背景著色比，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)碾s交條件(雜交的溫度、雜交液的離子強(qiáng)度和PH值)；要注意探針種類和大小，提高雜交時(shí)探針的濃度；在雜交液中加入(jir)些類似于免疫組化中的封閉物質(zhì)i在

17、雜交前先滴加不合探針的雜交液對(duì)組織片進(jìn)行預(yù)處理。 共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)3.2雜交溫度 復(fù)性反應(yīng)均需在一定(ydng)的溫度下進(jìn)行，以破壞和弱化鏈內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。溫度高雜交反應(yīng)快溫度太高則可破壞組織形態(tài)，一股應(yīng)采用低于該DNA Tm(Tm為DNA分子50解鏈時(shí)的濕度)25的溫度。需注意，核酸鏈中G-C多者Tm高(GC占50%時(shí)Tm約為70 )。雜交液中甲酰胺可降低雜交溫度，每增加1甲酰胺，可下降0.35一0.65 反應(yīng)的常用條件是：50中酰胺，42-65，雜交16-20 h.共一百一十三頁(yè) 3.3雜交液中高子強(qiáng)度和pH 單價(jià)陽(yáng)離了可以(ky)減少兩條互補(bǔ)鏈的磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷排斥力，因此在一

18、定范圍內(nèi)，較高的離子濃度可以(ky)增強(qiáng)雜交體的穩(wěn)定性。而兩價(jià)陽(yáng)離于可使雙鏈DNA結(jié)合更牢固，因此存變性和雜交時(shí)應(yīng)加入EDTA去除雙價(jià)離子。雜交常用的PH值在6575之間。共一百一十三頁(yè) 3.4探針的濃度(nngd) 雜交速率還與探針的長(zhǎng)度、復(fù)雜性及濃度有關(guān)。一般說來，較長(zhǎng)的探針雜交較快，但太長(zhǎng)時(shí)在組織內(nèi)穿遠(yuǎn)性差，結(jié)果反而不好。復(fù)雜性高的探針雜交所需時(shí)間較長(zhǎng)。核酸雜交反應(yīng)服從于二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，待測(cè)核酸的濃度決定分子間的碰撞頻率，可以影響雜交反應(yīng)的速度，探針濃度高亦可縮短雜交時(shí)間。因此，在雜交液中加入大分子非離子性多聚體，如葡萄糖硫酸鹽、聚丙烯酸和聚乙二醇等可以增加雜交液中探針的相對(duì)濃度，而加快

19、雜交的進(jìn)行。 雜交常用的探針濃度為0.55.0ugm1 共一百一十三頁(yè)信/噪 “噪音”（noise）是固相膜雜交方法常遇到(y do)的問題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液和對(duì)膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對(duì)照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6SSC的雜交反應(yīng)液中“噪音”最低。 共一百一十三頁(yè) 3. 5雜交液的構(gòu)成 基于以上原理，雜交液內(nèi)除了探針外，還含有適量的甲酰胺，并保持一定的離子強(qiáng)度(qingd)和pH值。此外，還應(yīng)含有一些封閉物質(zhì)，如葡聚搪、

20、聚乙烯吡咯烷酮(PvP)、牛血清白蛋白(BsA)、tRNA或魚精DNA等，以阻止探針與組織內(nèi)的一些成分發(fā)生非特異性結(jié)合。為了提高雜交的特異性在雜交反應(yīng)前常先用不合探針的預(yù)雜交液處理切片(與雜交溫度相同，作用20 min左右)。雜交談的具體配制見本書雜交組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。共一百一十三頁(yè)硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。 硫酸葡聚糖的主要(zhyo)作用：

21、促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。共一百一十三頁(yè) 甲酰胺的主要作用： 在調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有(jyu)破壞氫鍵的作用從而具有(jyu)一種不穩(wěn)定的作用。共一百一十三頁(yè) 4 雜交后處理 雜交后處理的目的是盡可能多地洗去未雜交或非特異吸附于切片上的探針，并通過免疫組化反應(yīng)以顯示靶核酸的存在與分布。 洗片是減少背景著色的重要環(huán)節(jié)。通常用來(yn li)洗片的液體是不同濃度的SSC。為提高洗片的效果，可以提高洗片時(shí)所用的溫度、減低所用洗液的離子濃度和提高甲酰胺的濃度。在用RNA探針時(shí)還可用

22、不合DNA酶的RNA酶處理切片，將殘存的單鏈RNA探針消化掉，從而明顯降低非特異性背景。共一百一十三頁(yè) 非放射性核素法標(biāo)記探針在雜交(zjio)后需經(jīng)過顯色反應(yīng)來顯示靶核酸的存在與分布，其方法與免疫組化法相同。為了減少顯色過程中可能產(chǎn)生的非特異著色，在抗體反應(yīng)液和洗液中可以加入Tween20，并在滴加抗體前，切片失用動(dòng)物正常血清或用試劑盒所帶的特殊阻斷劑孵育 共一百一十三頁(yè)雜交(zjio)嚴(yán)格度（Hybridization stringency） 雜交條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全(wnqun)配對(duì)及不完全(wnqun)配對(duì)雜交體的鑒別程度。 共一百一十

23、三頁(yè)低嚴(yán)格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm-35至Tm40之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生(chnshng)。中嚴(yán)格度， Tm -20至Tm-30的范圍。高嚴(yán)格度（high stringency）為Tm-10至Tm-15，低鹽和高甲酰胺濃度。 共一百一十三頁(yè)由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格(yng)范圍，無疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格(yng)度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進(jìn)行細(xì)

24、胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高1015。實(shí)驗(yàn)證明，cRNA產(chǎn)生的信號(hào)比雙鏈cDNA要強(qiáng)。單鏈的RNA探針其雜交信號(hào)大于雙鏈的cDNA的約8倍。共一百一十三頁(yè) 5 對(duì)照 同免疫組化一樣，每次進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)也應(yīng)設(shè)立若干個(gè)對(duì)照以估計(jì)所用試劑的可靠性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，排除假陰性和假陽(yáng)性的干擾(gnro)。常用的對(duì)照有：共一百一十三頁(yè)1標(biāo)本對(duì)照 陰性標(biāo)本對(duì)照，即在個(gè)含相應(yīng)靶核酸的組織或細(xì)胞片上進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，以鑒定有無探針與組織或細(xì)腦的非待異結(jié)合(jih)。還可以用Dnase或Rnase處理陽(yáng)性標(biāo)本片，消化靶核酸后作為陰性對(duì)照. 陽(yáng)性標(biāo)本片對(duì)照即每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)加上一張陽(yáng)性標(biāo)本片進(jìn)行原

25、位雜交，其結(jié)果可以顯示技術(shù)上的重復(fù)性(操作的正確與否、所用試劑的可靠性)。必要時(shí)還可用該基因產(chǎn)物的抗體染同一切片，對(duì)照雜交陽(yáng)性產(chǎn)物的分布特點(diǎn)，在一定程度廣也可提示雜交結(jié)果的正確性。共一百一十三頁(yè)2探針對(duì)照 探制的Northern印跡檢測(cè)，可通過探針對(duì)組織總RNA的Northern印跡雜交帶的分析，以明確探調(diào)的特異性。3探針正義鏈陰性對(duì)照 應(yīng)用RNA探針時(shí)可以轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記與靶核酸序列相同的核酸片段(即正義鏈)，代替(dit)探針(反義鏈)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而其不能與靶核酸完成雜交，此即為正義鏈陰性對(duì)照。共一百一十三頁(yè) 4未標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)抑制 與免疫組化相同，在原位雜交實(shí)驗(yàn)中也可加入不同濃度的未標(biāo)記探針，進(jìn)行

26、特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制。 5不合探針的陰性對(duì)照(duzho) 即在雜交時(shí)用不含探針的雜交液作用，其意義主要在于對(duì)顯色系統(tǒng)作陰性對(duì)照 共一百一十三頁(yè)6質(zhì)粒對(duì)照 即用不合(bh)探針片段的載體質(zhì)粒DNA與標(biāo)本片朵交，以排除因載體引起的非特異件著色. 7無關(guān)的標(biāo)記探針對(duì)照 使用已知標(biāo)本片中不合有的核酸片段之標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，其可以排除標(biāo)本對(duì)探針的非特異性吸附的可能性。共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè)原位PCR方法(fngf)共一百一十三頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄P

27、CR多重PCR反向PCR不對(duì)稱(duchn)PCR 錨定PCR 共一百一十三頁(yè)原位雜交技術(shù)(jsh)的優(yōu)缺點(diǎn) 原位雜交技術(shù)在顯示陽(yáng)性雜交信號(hào)(即特定的DNA或RNA)時(shí),不僅能判斷含有靶序列的細(xì)胞類型,還能顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與病理變化. 但是原位雜交對(duì)拷貝數(shù)較少的序列檢出有一定(ydng)的困難,而單拷貝序列或低拷貝序列(10-20拷貝的RNA或單拷貝DNA),則不能被檢出,所以原位雜交的敏感性不夠共一百一十三頁(yè) PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過模板的變性、退火和引物延伸(ynshn)三種循環(huán)，將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過擴(kuò)增的靶序列（一般能擴(kuò)增106倍），很

28、容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。PCR技術(shù)(jsh)的優(yōu)點(diǎn)共一百一十三頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)(jsh)的缺點(diǎn) 但是，PCR技術(shù)是在液相中進(jìn)行的，在擴(kuò)增前，需將細(xì)胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結(jié)果與組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系(linx)起來，同時(shí)，也很難判斷含特異性靶序列的細(xì)胞類型。 共一百一十三頁(yè) 原位PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效(o xio)擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 共一百一

29、十三頁(yè) 原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)又彌補(bǔ)了各自(gz)的不足。共一百一十三頁(yè)原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種( zhn)成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 共一百一

30、十三頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)(jsh)的應(yīng)用1組織細(xì)胞樣品中病毒(bngd)核酸探測(cè)2細(xì)胞內(nèi)源核酸的探測(cè)3染色體基因定位4組織細(xì)胞基因表達(dá)的研究共一百一十三頁(yè) 直接(zhji)法原位PCR技術(shù) 直接法原位PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記的三磷酸腺苷或引物片斷。當(dāng)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記的分子就摻入到擴(kuò)增的產(chǎn)物中，顯示標(biāo)記物，就能將特定的DNA或RNA在標(biāo)本（原位）中顯現(xiàn)出來。 共一百一十三頁(yè) 間接(jin ji)法原位PCR技術(shù) 間接法原位PCR技術(shù)是先在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定DNA或RNA擴(kuò)增，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應(yīng)用最為廣泛的原位PCR技術(shù) 共一百一十三頁(yè)

31、 間接法原位PCR與直接法不同的是，反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。即實(shí)現(xiàn)先擴(kuò)增的目的，然后用原位雜交技術(shù)去檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)已擴(kuò)增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來的一種新技術(shù)，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴(kuò)增效率(xio l)也較高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。 共一百一十三頁(yè) 原位反轉(zhuǎn)錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術(shù)(jsh

32、)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)(jsh)，與RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。 共一百一十三頁(yè)幾本步驟原位PCR的基本步驟包括標(biāo)本制備、預(yù)處理、原位擴(kuò)增（PCR）、后處理和原位檢測(cè)(jin c)等，現(xiàn)分述如下；共一百一十三頁(yè)標(biāo)本(biobn)制備1 標(biāo)本種類 原位PCR可以在細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、細(xì)胞離心標(biāo)本、細(xì)胞分裂中期染色體標(biāo)本、冰凍(bngdng)切片以及石蠟切片上進(jìn)行，相比之下，以懸浮的

33、完整細(xì)胞做原位PCR效果最好，細(xì)胞涂片和細(xì)胞離心標(biāo)本次之，而切片標(biāo)本最差。 共一百一十三頁(yè)2固定 由于原位PCR要對(duì)擴(kuò)增的靶序列進(jìn)行細(xì)胞定位，因此標(biāo)本需要固定。固定的目的不僅保存組織細(xì)胞的形態(tài)(xngti)結(jié)構(gòu)，便于定位，而且還要能保存用做PCR模板的起始物DNA或RNA。常用的固定劑，緩沖福爾馬林（10，4固定4-6h）和4多聚甲醛，一般都能滿足這一要求。 共一百一十三頁(yè)3預(yù)處理制備好的組織標(biāo)本 在進(jìn)行原位擴(kuò)增即PCR之前，一般都要用蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理。常用的蛋白酶有蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶。組織標(biāo)本經(jīng)蛋白酶消化后能增加通透性，允許反應(yīng)試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并暴露靶序列，用以擴(kuò)增。蛋白酶消化不足

34、，則組織細(xì)胞的通透性差，而且蛋白質(zhì)與核酸之間交聯(lián)廣泛。這些都會(huì)影響PCR反應(yīng)，以導(dǎo)致假陰性結(jié)果(ji gu)。反之，消化過度則會(huì)破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也會(huì)使PCR產(chǎn)物易于通過破裂的膜結(jié)構(gòu)向外彌散。共一百一十三頁(yè)4 原位擴(kuò)增 原位擴(kuò)增也即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其基本原理及反應(yīng)條件(tiojin)與液相PCR相同，但由于PCR是在固定的細(xì)胞組織標(biāo)本上進(jìn)行，所以也有其特殊性。1 引物 原位PCR宜用較短的引物2 反應(yīng)體系 原位PCR的反應(yīng)體系與常規(guī)的液相PCR基本相同 共一百一十三頁(yè)5 熱循環(huán) 載玻片原位PCR的熱循環(huán)可在專用的熱循環(huán)儀上進(jìn)行。最近生產(chǎn)的專用原位PCR熱循環(huán)儀一次可同時(shí)放

35、置1220張玻片，操作(cozu)簡(jiǎn)便。熱量則通過載玻片傳遞給組織及整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)。如果無專用的原位PCR儀，則可用常規(guī)PCR s循環(huán)儀代替。通常在樣品臺(tái)上覆蓋一層鋁箔，制成平臺(tái)，載玻片即可置于平臺(tái)上 。共一百一十三頁(yè)6 后處理 原位擴(kuò)增結(jié)束后，標(biāo)本要輕輕地洗滌以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。洗滌不充分，會(huì)使彌散的擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)顯現(xiàn)，造成背景過高或出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。反之，洗滌過度，可能將保留在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物洗脫(x tu)，而造成陽(yáng)性信號(hào)減弱。因此洗滌的程度要折衷于減低背景和保留強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)這兩個(gè)因素。雖然有的操作流程中沒有擴(kuò)增后洗滌，但一般還是將此步驟包括在原位PCR的操作規(guī)程中。 共一百一十三

36、頁(yè)7 原位檢測(cè)(jin c) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的原位檢測(cè)方法，取決于原位PCR的設(shè)計(jì)方案。 共一百一十三頁(yè)怎樣設(shè)定原位PCR對(duì)照實(shí)驗(yàn)？設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，即用已知陽(yáng)性細(xì)胞或組織切片(qi pin)做陽(yáng)性標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)呈陽(yáng)性，表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。同時(shí)要設(shè)立陰性對(duì)照，即用已知陰性細(xì)胞或組織切片(qi pin)作陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)呈陰性，表示實(shí)驗(yàn)方法無假陽(yáng)性結(jié)果；也可以用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或組織切片(qi pin)，不加標(biāo)記的dUTP（直接法），PCR結(jié)果顯示陰性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，結(jié)果均應(yīng)陰性。 共一百一十三頁(yè)存在的問題(wnt)與對(duì)策1引物錯(cuò)配2DNA 修復(fù)和內(nèi)源DNA延伸3pcr產(chǎn)物(

37、chnw)的擴(kuò)散4擴(kuò)增失敗共一百一十三頁(yè)第七章 光鏡標(biāo)本顯微攝影(xin wi sh yn)技術(shù)共一百一十三頁(yè)顯微攝影的特點(diǎn)1.攝影對(duì)象不同2.被攝視野區(qū)域較小3.光強(qiáng)的特殊性4.獨(dú)立光學(xué)通道5.專用接口(ji ku)6.物距調(diào)節(jié)有限7.色溫及彩色補(bǔ)償共一百一十三頁(yè)生物顯微圖像處理與分析面向的任務(wù)有1根據(jù)需要對(duì)原始圖像進(jìn)行相應(yīng)(xingyng)的處理,如圖像平滑,圖像增強(qiáng)和圖像復(fù)原等,以改善圖像質(zhì)量2描述并提取圖像的結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)行特征參數(shù)的測(cè)量,如組織(細(xì)胞)的二維幾何參數(shù)以及某些物質(zhì)成分在組織化學(xué),免疫組織化學(xué)和雜交組織化學(xué)等染色中的光度學(xué)參數(shù)等3三維重建共一百一十三頁(yè)1顯微細(xì)胞圖像處理的基

38、本方法1.1 顯微圖像處理過程 顯微圖像處理的基本過程是： 制作切片； 顯微細(xì)胞圖像采集； 圖像預(yù)處理； 圖像分割； 特征參數(shù)抽??；統(tǒng)計(jì)分析；結(jié)果(ji gu)輸出共一百一十三頁(yè)1.2 顯微細(xì)胞圖像采集 通過顯微鏡將切片放大，成像在攝像器材上，完成光電轉(zhuǎn)換，經(jīng)AD轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)輸入(shr)計(jì)算機(jī)。其中攝像器材可采用電荷耦合器件(Charge coupled devices，CCD)照相機(jī)、帶有視像管的視頻攝像機(jī)和掃描儀(Scanners)等。這些器件均稱為數(shù)字化器，都能將模擬電信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字的形式共一百一十三頁(yè)共一百一十三頁(yè) 在圖像采集的過程中，由于專門針對(duì)的是顯微細(xì)胞圖像，其目標(biāo)較小，圖像采集卡分辨率應(yīng)該盡可能高，否則，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞邊緣模糊，不利于后期分割處理；顯微鏡光源的亮度對(duì)攝像機(jī)攝取