中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-生物化學(xué)第08章第06節(jié)教學(xué)

1、第六節(jié) 核酸的分離與鑒定一、核酸的分離（一）DNA的分離提取DNA最基本的原則是保持DNA的完整性。影響完整性的因素： 機(jī)械損傷； 細(xì)胞內(nèi)源DNAase(cofactor: Ca2+,Mg2+)的作用； 化學(xué)因素DNA核蛋白溶解特點(diǎn)： 溶于水和濃鹽溶液（1 mol/L NaCl） 不溶于生理鹽溶液（0.14 mol/L NaCl）DNA分離技術(shù)要點(diǎn)：DNA提?。恹}溶液、 EDTA、SDS、蛋白質(zhì)酶K）DNA沉淀（水稀釋或異丙醇）苯酚(水飽和)抽提除去蛋白乙醇沉淀DNA氯化銫密度梯度離心進(jìn)一步純化（二）RNA分離RNA不穩(wěn)定！RNA酶非常穩(wěn)定！提取RNA的關(guān)鍵在于盡可能完全抑制RNA酶的活性。

2、抑制RNase的措施：器皿特殊處理使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑使用RNAase 抑制劑RNA制備: 酸性胍鹽/苯酚/氯仿 抽提 氯化銫 密度梯度離心二、核酸的超速離心氯化銫(8.0 mol/L)密度梯度1.80 g/cm3 1.55g /cm3密度: RNADNA蛋白質(zhì)核酸超速離心的用途: 1. 分離核酸(含熒光染料溴化乙錠, EB) 2. 核酸構(gòu)象研究 超螺旋DNA環(huán)狀DNA線型DNA 3. C-G含量測(cè)定 =0.100 x C-G +1.658三、核酸電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳1. 影響遷移率的主要因素: 核酸分子大小; 膠濃度（EB）; DNA的構(gòu)象(超螺旋線型環(huán)狀)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn):DNA/Hind

3、 III1 kb ladder2. 用途 常用于分析DNA（濃度、分子大小、分離） (分析RNA時(shí)必須加蛋白質(zhì)變性劑) （二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 適合小于1 kb 的DNA片段 適合RNA樣品（三）脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE） 被分離的DNA可達(dá)10000 kb四、柱層析（一）羥基磷灰石柱層析 雙鏈DNA與羥基磷灰石結(jié)合緊 結(jié)合變溫可以按堿基組成分離DNA（二）親和層析 oligo（dT）纖維素柱五、DNA的序列測(cè)定化學(xué)法（chemical cleavage method）Maxam & Gilbert（1977） 1. 首先用標(biāo)記分子的一條鏈的一端； 2. 選擇專(zhuān)一性試劑（針對(duì)四種堿基），分別對(duì)DNA降解，產(chǎn)生四套大小不等的放射性片段； 3. 對(duì)四套放射性片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離各片段； 4. 放射自顯影觀察放射性片段的位置； 5. 自下而上讀出核苷酸順序。 DNA序列測(cè)定酶法分離提純DNA和RNA時(shí)分別應(yīng)注意什麼？為什麼？核酸在 nm有特征吸收峰。核酸分子雜交， 核酸變性， 退火， Tm，限制性?xún)?nèi)切酶， 粘末端，平末端核酸只有在260nm才有吸收。（）可以用 判斷核酸制品純度。核