本科《食品生物技術(shù)導(dǎo)論》課件第7章 生物工程下游技術(shù)

1、PAGE 3PAGE 39第7章 生物工程下游技術(shù)教學(xué)目標(biāo)：通過(guò)本章學(xué)習(xí)，學(xué)生應(yīng)掌握生物工程下游技術(shù)的路線以及主要的分離純化單元操作的原理、操作注意事項(xiàng)、適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。概述 生物工程下游技術(shù)也叫下游工程（downstream processing），或生物活性物質(zhì)分離純化（separation and purification of bioactive substances），是指從基因工程獲得的動(dòng)、植物和微生物的有機(jī)體或器官中，從細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和酶工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培養(yǎng)液）中把目標(biāo)化合物分離純化出來(lái)，使之達(dá)到商業(yè)應(yīng)用目的的過(guò)程。 1.1 生物工程下游技術(shù)的重要性在大多數(shù)情況下，基因工

2、程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和酶工程的產(chǎn)物不能直接成為產(chǎn)品和商品，必須經(jīng)過(guò)分離工程得到高純度的產(chǎn)品和能被市場(chǎng)接受的商品。因此，生物工程下游技術(shù)是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)工業(yè)化的必不可少的重要組成。生物工程下游技術(shù)也是生物制品成本構(gòu)成中的主要部分。在一般情況下。在生物工程產(chǎn)品的成本構(gòu)成中，分離純化部分的成本約占總成本的50%以上。而且在原料中目的產(chǎn)物的濃度越低，分離工程的人力物力投入也就越大，產(chǎn)品的價(jià)格也就越高。因此改進(jìn)分離工程是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)降低生產(chǎn)成本和提高經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。通過(guò)改進(jìn)工藝路線和技術(shù)參數(shù)有可能較大幅度地減少分離過(guò)程中目的產(chǎn)物的損失，提高回收率，增加經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)代分離工程的發(fā)展，正在深刻地影響著傳統(tǒng)的

3、食品工業(yè)和制藥工程，從而形成了精細(xì)食品工程（精細(xì)食品化工和精細(xì)食品生物化工）和生物制藥工程兩大學(xué)科和產(chǎn)業(yè)門類。 1.2 生物工程下游技術(shù)的特點(diǎn) （1）在原料液中目標(biāo)成分的含量較低。下游工程的原料通常是發(fā)酵液或培養(yǎng)液，目標(biāo)成分在原料液中的含量低于10%，有時(shí)只有千萬(wàn)之一或萬(wàn)分之一。而且通常生理活性越高的成分在原料液中的含量越低。原料液中卻存在著在含量和種類上都大大超過(guò)目標(biāo)成分的雜質(zhì)，許多雜質(zhì)在理化性質(zhì)上又與目標(biāo)成分十分接近，因而大大增加了分離的難度。（2）原料液是復(fù)雜的多相體系，既有完整的有機(jī)體和殘破的菌絲碎片，又有膠體溶液和真溶液。目標(biāo)成分可能既分布在固相，又分布在液相。目標(biāo)成分可能分布在胞內(nèi)

4、，或分布在胞外，或胞內(nèi)胞外都存在。（3）目標(biāo)成分的穩(wěn)定性較差，對(duì)熱、pH、酶、空氣、光、重金屬離子、機(jī)械剪切力十分敏感，在不適宜的分離條件下即會(huì)分解和失活。特別是生物大分子，其活性依賴于它的組成、序列和構(gòu)象，在理化因子和生物因子的作用下，即使其組成和序列不發(fā)生變化，只要構(gòu)象發(fā)生了變化，活性即喪失。因此在分離工程中要求采取較為溫和的條件，時(shí)刻關(guān)注目標(biāo)成分的失活問(wèn)題。（4）要求產(chǎn)品的純度很高。生物技術(shù)產(chǎn)品屬于精細(xì)生物化工產(chǎn)品，必須達(dá)到各種法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，如蛋白質(zhì)類產(chǎn)品要求雜蛋白含量2%。不少產(chǎn)品要求呈穩(wěn)定的無(wú)色的晶體。產(chǎn)品純度越高，意味著得率就越低。也就是說(shuō)，在一般情況下，超過(guò)20%的目標(biāo)成分在不斷的分

5、離純化過(guò)程中損失掉了。1.3 下游工程的目的產(chǎn)物食品生物技術(shù)目的產(chǎn)物是指對(duì)人體具有保健或治療作用的功能因子，專用添加劑（如有防腐作用抗菌多肽、防御素、有改進(jìn)食品風(fēng)味作用的有機(jī)化合物、有增稠穩(wěn)定作用的微生物胞外多糖等），以及專用于食品工業(yè)的微生物或酶類等。（1）目的產(chǎn)物的特點(diǎn)通常是活的有機(jī)體或具有生理活性的有機(jī)化合物，不穩(wěn)定，易變性，易失活。許多目的產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量較大，如酶類的相對(duì)分子質(zhì)量介于1萬(wàn)到50萬(wàn)之間，多糖介于1萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)之間。目的成分在制備液中的濃度往往很低，但要求產(chǎn)品的純度卻很高，通常應(yīng)在95%以上，結(jié)晶態(tài)更為理想。產(chǎn)品的數(shù)量很小，但附加值很高。目的產(chǎn)物中的生物制劑含有豐富的營(yíng)養(yǎng)

6、成分，易被微生物污染和分解。成分較為復(fù)雜，有的可用常規(guī)分析方法檢測(cè)，有的則應(yīng)用分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。許多功能因子參與人體機(jī)能的精細(xì)調(diào)節(jié)，因此發(fā)生任何在性質(zhì)上或數(shù)量上的偏差，非但不能起到保健作用，反而可能造成嚴(yán)重的危害。（2）食品生物技術(shù)目的產(chǎn)物可分為5類：蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類，包括抗菌蛋白、內(nèi)源抗生素、降壓多肽、防御素、腫瘤壞死因子、干擾素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素等。酶、輔酶、酶抑制劑類，包括溶菌酶、纖維素酶、麥芽淀粉酶、蛋白酶、彈性蛋白酶、尿激酶、天冬氨酸酶、超氧化物歧化酶、各種輔酶、蛋白分解酶抑制劑、糖苷水解酶抑制劑等。多糖類，包括食用膠、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、殼聚

7、糖、真菌多糖等。免疫調(diào)節(jié)類，如生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素等。其它，包括脂類、多不飽和脂肪酸、去氧膽酸、維生素、芳香物質(zhì)、色素等。(3)目的產(chǎn)物的商業(yè)用途目的產(chǎn)物可以直接作為商品，或作為半成品進(jìn)一步加工成商品。目的產(chǎn)物的商業(yè)用途有4種：功能食品。有許多蛋白質(zhì)、活性多糖、脂類具有增加免疫和調(diào)節(jié)生理活動(dòng)的功能，因而可制備成輸液、片劑，滿足部分人群的消費(fèi)需要。食品添加劑。部分目的產(chǎn)物可作為精細(xì)生物化工產(chǎn)品，用于食品加工業(yè)改善食品的衛(wèi)生質(zhì)量和風(fēng)味質(zhì)量。生物藥物。食品生物技術(shù)和醫(yī)藥生物技術(shù)在保障人體健康的目的上和生物技術(shù)的手段上是一致的。一些食品生物技術(shù)的目的產(chǎn)物不僅具有調(diào)節(jié)生理的功能，而且具有治療作用，如干擾

8、素等?；瘖y品。部分目的產(chǎn)物可作為原料加工成各種化妝品，滿足人們追求美的需要。1.4 下游工程的基本路線不同的產(chǎn)物具有不同的分離路線。分離路線的確定，取決于目標(biāo)成分的性質(zhì)和它在細(xì)胞中所處的位置，即分布在胞內(nèi)還是在胞外。整個(gè)分離路線一般可分為預(yù)處理、固液分離、初步純化、精細(xì)純化、成品加工5個(gè)主要步驟。每一個(gè)步驟又通過(guò)若干個(gè)單元操作來(lái)完成。圖7-1是以發(fā)酵液或培養(yǎng)液為原料時(shí)下游工程的基本框架。胞外產(chǎn)物碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離預(yù)處理發(fā)酵液加熱調(diào)節(jié)pH凝聚離心過(guò)濾珠磨高速勻漿酶溶離心過(guò)濾初步純化精細(xì)純化成品加工結(jié)晶濃縮干燥層析電泳分子蒸餾萃取吸附沉淀離心圖7-1 下游工程的基本框架（1）預(yù)處理：采用加熱

9、、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)，為固液分離作準(zhǔn)備。（2）固液分離：采用珠磨、勻漿、酶溶、過(guò)濾、離心等單元操作除去固相，獲得包含目的產(chǎn)物的液相，供進(jìn)一步分離純化用。（3）初步純化：采用萃取、吸附、沉淀、離心等單元操作，將目的成分與大部分雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。（4）精細(xì)純化：采用層析、電泳、分子蒸餾等單元操作，將目的成分與雜質(zhì)進(jìn)一步分離，使產(chǎn)物的純度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。（5）成品加工：采用結(jié)晶、濃縮、干燥等單元操作，將目的產(chǎn)物加工成適應(yīng)市場(chǎng)需要的商品。下面將按各步驟的單元操作進(jìn)行講述，其中有些單元操作，也許在不同的步驟中被使用。1.5下游工程的質(zhì)量控制生產(chǎn)者必須通過(guò)小試、中試、質(zhì)

10、量鑒定、試生產(chǎn)、正式生產(chǎn)等階段，確定下游工程的工藝路線和參數(shù)。在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行工藝流程和參數(shù)，以保證生產(chǎn)高質(zhì)量的產(chǎn)品。生產(chǎn)工藝包括對(duì)廠房設(shè)施、工程儀表、機(jī)械設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、工藝條件、計(jì)算機(jī)軟件、介質(zhì)、原材料、半成品、成品、操作人員素質(zhì)和測(cè)試方法等的明確要求。當(dāng)工藝中某一部分有較大變動(dòng)時(shí)，如原料發(fā)生變化或溶劑的牌號(hào)發(fā)生變化時(shí)，就應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證，寫出驗(yàn)證報(bào)告。下游工程的安全防護(hù)除遵循生物技術(shù)安全規(guī)定的一般原則外，還應(yīng)要求清潔的GMP廠房，在關(guān)鍵工序或全過(guò)程應(yīng)設(shè)置屏蔽防護(hù)裝置，以免環(huán)境污染物污染目的產(chǎn)物，也應(yīng)防止重組生物材料等污染環(huán)境。安全生產(chǎn)的基本要求是控制進(jìn)入現(xiàn)場(chǎng)的人員，保持工作現(xiàn)場(chǎng)的負(fù)壓

11、，通過(guò)HEPA過(guò)濾器排放空氣，采取生物學(xué)或化學(xué)廢物處理措施，定期監(jiān)測(cè)工作人員的健康和環(huán)境狀況。食品生物技術(shù)產(chǎn)品的質(zhì)量控制應(yīng)包括產(chǎn)品的鑒證、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性等。真核細(xì)胞表達(dá)制品的純度應(yīng)大于98%，原核細(xì)胞表達(dá)制品的純度應(yīng)大于95%。在分離純化過(guò)程中應(yīng)避免病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白的污染和有毒有害物質(zhì)的進(jìn)入。柱層析配制用水應(yīng)為超純水。如采用柱層析純化，應(yīng)使用有質(zhì)量認(rèn)證證明的填料，排除填料掉落有害物質(zhì)的可能性。輸液成品加工前應(yīng)去除熱原。如采用單克隆抗體作配基的親和層析純化技術(shù)，應(yīng)確認(rèn)不含有其它免疫球蛋白，也應(yīng)避免單克隆抗體對(duì)目的產(chǎn)物的污染。制定純化工藝時(shí)應(yīng)測(cè)定每一步驟提純倍數(shù)和收率

12、。純化工藝應(yīng)避免使用有害有毒物質(zhì)，如萬(wàn)不得已使用時(shí)應(yīng)設(shè)法去除，并測(cè)定其在最終產(chǎn)品中的殘留量。2原料與預(yù)處理2.1原料下游工程的原料包括發(fā)酵工程、酶工程、細(xì)胞工程的發(fā)酵液和培養(yǎng)液，以及基因工程獲得的動(dòng)、植物、微生物的有機(jī)體或器官。目前，發(fā)酵液和培養(yǎng)液仍是下游工程的主要原料。不同菌種的發(fā)酵液具有不同的性質(zhì)，大多數(shù)目標(biāo)成分存在于發(fā)酵液中，少數(shù)存在于菌體中，或者發(fā)酵液和菌體中兼而有之。原料發(fā)酵液的成分極為復(fù)雜，有微生物菌體、殘存的培養(yǎng)基、各種有活性的酶類、微生物的代謝產(chǎn)物等。發(fā)酵液呈懸浮液狀態(tài)，懸浮物顆粒小，濃度低，液相粘度大，為非牛頓型流體，性質(zhì)不穩(wěn)定。因此發(fā)酵液應(yīng)及時(shí)進(jìn)行處理，否則輕則增加分離純化

13、的難度，重則使所含的目標(biāo)成分分解失活。在分批發(fā)酵時(shí)應(yīng)選擇菌體處于一定生長(zhǎng)階段的發(fā)酵液作為原料。當(dāng)目標(biāo)成分是初級(jí)代謝產(chǎn)物如核酸、酶等時(shí)，應(yīng)選擇處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的微生物菌體。當(dāng)目標(biāo)成分為次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)選擇生長(zhǎng)速率已經(jīng)減慢而目的產(chǎn)物產(chǎn)量增多并達(dá)到高峰時(shí)的菌體。當(dāng)原料為轉(zhuǎn)基因的動(dòng)植物材料時(shí)，應(yīng)注意季節(jié)、生長(zhǎng)期、組織器官部位、老嫩程度、新鮮程度對(duì)目標(biāo)成分含量和活性程度的影響。同樣，原料應(yīng)及時(shí)加工，或者制成粗制品保存，在不得已的情況下應(yīng)低溫或速凍保存。2.2 發(fā)酵液預(yù)處理（pretreatment）為了進(jìn)行固液分離，必須對(duì)發(fā)酵液作必要的簡(jiǎn)單的預(yù)處理。通過(guò)加熱、調(diào)節(jié)pH、凝聚或絮凝等措施，使發(fā)酵液的粘度下

14、降，為以后的離心、過(guò)濾做準(zhǔn)備。（1）加熱(heating)加熱法是最簡(jiǎn)單的預(yù)處理手段。提高發(fā)酵液的溫度可顯著降低懸浮液的粘度，提高過(guò)濾速率。適當(dāng)?shù)臏囟群褪軣釙r(shí)間還有利于作為雜質(zhì)的一部分蛋白質(zhì)凝聚，改善發(fā)酵液的過(guò)濾特性。具體操作方法，在目的產(chǎn)物較為耐熱時(shí)，往往先調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，再加熱發(fā)酵液至60-70，維持0.5h。采用加熱法的前提是目的產(chǎn)物必須具有熱穩(wěn)定性。即使目的產(chǎn)物較為耐熱，也應(yīng)嚴(yán)格控制加熱的溫度和維持時(shí)間，以免目的產(chǎn)物失活。(2)調(diào)節(jié)pH（adjusting pH）適當(dāng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，可使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)處于等電點(diǎn)，因不穩(wěn)定而被沉淀，用固液分離方法去除。大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH4.5

15、5.5的范圍內(nèi)。同時(shí)調(diào)整pH還可改變一部分大分子物質(zhì)的電荷性質(zhì)，因而在膜過(guò)濾時(shí)這些大分子不易被膜吸附，從而改善發(fā)酵液的過(guò)濾特性。具體操作方法是，用濃度小于1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液，在攪拌下緩緩加入發(fā)酵液中。應(yīng)避免局部濃度過(guò)大，引起蛋白質(zhì)變性。也可用草酸代替鹽酸，在調(diào)節(jié)pH的同時(shí)，去除發(fā)酵液中的鈣離子。如要去除鎂離子，可加入三聚磷酸鈉。(3)凝聚和絮凝（agglutination）凝聚和絮凝都是指在化學(xué)試劑的作用下，改變發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)和細(xì)胞碎片的分散性質(zhì)，使之聚結(jié)沉淀的現(xiàn)象。用于凝聚的試劑為電解質(zhì)，常用的電解質(zhì)，有硫酸鋁、氯化鋁、三氯化鐵、碳酸鎂等。用于絮凝的試劑為高分子絮凝劑，如

16、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、殼聚糖、脫乙酰殼聚糖、海藻海鈉等。聚丙烯酸類陰離子絮凝劑的絮凝效果好，無(wú)毒，適用于食品和生物醫(yī)藥工業(yè)。具體操作方法，首先測(cè)定發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L），然后確定最佳的添加量、溶液pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時(shí)間等因素，使達(dá)到最佳凝聚效果。當(dāng)凝聚劑或絮凝劑的用量超過(guò)最佳用量時(shí)，反而會(huì)引起吸附飽和，使凝聚和絮凝效果下降。3固液分離和細(xì)胞破碎3.1 固液分離（solid-liquid separation）按照工藝路線，發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后立即進(jìn)行固液分離。在目的產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物的情況下，液相部分即為操作者關(guān)注的部分。如目的產(chǎn)物為胞內(nèi)產(chǎn)物，則固相部分即為關(guān)注部分。固相

17、部分必須經(jīng)細(xì)胞破碎后，將目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至液相部分，才能以液相部分為對(duì)象進(jìn)一步開(kāi)展分離純化。固液分離是下游工程的瓶頸問(wèn)題，引起各國(guó)科學(xué)家的重視和研究，固液分離的單元操作有離心、過(guò)濾等。細(xì)菌和酵母菌的發(fā)酵液一般采用離心分離，霉菌和放線菌的發(fā)酵液一般采用過(guò)濾分離。離心分離（centrifugal separation）離心既可以是固液分離的手段，也可以是純化的手段。離心分離是在離心產(chǎn)生的重力場(chǎng)作用下使懸浮顆粒沉降下來(lái)的操作過(guò)程。單元操作可以是分批的、半連續(xù)的或者連續(xù)的。常用的離心設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)、蝶片式離心機(jī)、管式離心機(jī)和傾析式離心機(jī)等。高速冷凍離心機(jī)：高速冷凍離心機(jī)適用于分離熱穩(wěn)定性較差的目的產(chǎn)

18、物，但其容量較小和不能連續(xù)操作，只能作為研究開(kāi)發(fā)和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模使用。蝶式離心機(jī)：蝶式離心機(jī)的應(yīng)用最廣泛，密封的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有傾斜的錐形碟片，顆粒沉淀在鼓壁上，上清液則經(jīng)溢流口排出。蝶式離心機(jī)適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，最大允許處理量達(dá)300m3/h，可連續(xù)或分批式操作，操作穩(wěn)定性好，但連續(xù)操作時(shí)固相部分的含水量較高，半連續(xù)操作時(shí)，出渣和清洗較為困難（見(jiàn)圖7-2）。管式離心機(jī)：管式離心機(jī)內(nèi)有細(xì)長(zhǎng)直管轉(zhuǎn)筒，懸浮液由管底加入，在50 000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，上清液由頂部排出。管式離心機(jī)具有很高的離心分離效果，可用于微生物細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)等大分子的分離。生產(chǎn)能力則不如蝶式離心機(jī)，最大處理

19、量為10m3/h。分離后固相部分含水量低。缺點(diǎn)在于生產(chǎn)規(guī)模過(guò)小和間歇式操作（見(jiàn)圖7-2）。傾析式離心機(jī)：傾析式離心機(jī)把離心和螺旋推進(jìn)結(jié)合在一起，懸浮液經(jīng)加料孔進(jìn)入螺旋內(nèi)筒，再進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，顆粒沉降到轉(zhuǎn)鼓壁，經(jīng)螺旋輸送至排渣孔排出，上清液則由另一端的溢流孔排出。傾析式離心機(jī)具有連續(xù)操作、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在下游工程中得到廣泛應(yīng)用，特別適合固形物較多的懸浮液的分離。但分離效果不夠理想，液相的澄清度較差（見(jiàn)圖7-2）。 碟式 管式 傾析式圖7-2 碟式、管式和傾析式離心機(jī)料液入口；2-上清液出口；3-排渣出口過(guò)濾分離（filtration separation）過(guò)濾是傳統(tǒng)的化工單元操作，在操作中迫使懸浮液

20、通過(guò)固相支承物或過(guò)濾介質(zhì)，截留固相，以達(dá)到固液分離的目的。在下游工程中應(yīng)用較廣的過(guò)濾設(shè)備有壓力過(guò)濾、真空過(guò)濾和錯(cuò)流過(guò)濾3種。壓力過(guò)濾（pressure filtration）：最常見(jiàn)的壓力過(guò)濾裝置是板框過(guò)濾機(jī)（見(jiàn)圖7-3），過(guò)濾介質(zhì)為濾布，當(dāng)懸浮液通過(guò)濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻隔而形成濾餅，濾餅達(dá)到一定厚度時(shí)起過(guò)濾作用，壓力來(lái)自于液壓泵。板框過(guò)濾機(jī)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，過(guò)濾面積大，能承受較高的壓力差，應(yīng)用范圍廣，固相含水量低，但不能連續(xù)操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率較低。圖7-3 壓力過(guò)濾設(shè)備濾漿入口；2-固定端板；3-移動(dòng)端板；4-調(diào)節(jié)手柄 ；5-濾布；6-濾液真空過(guò)濾（vacuum filtration）：

21、最常見(jiàn)的真空過(guò)濾是真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)（見(jiàn)圖7-4），工作部件是一個(gè)繞著水平軸轉(zhuǎn)動(dòng)的鼓，鼓的表面為濾布，鼓內(nèi)維持一定的真空度，鼓外為大氣壓，即為過(guò)濾的推動(dòng)力。轉(zhuǎn)鼓下部浸于懸浮液中，隨著轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)，懸浮液附著在轉(zhuǎn)鼓上，透過(guò)濾布的濾液被吸入鼓內(nèi)，濾渣附著在濾布上，被洗滌、吸干、刮卸下來(lái)。真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)可連續(xù)操作，處理量大，自動(dòng)化程度高，但不適于過(guò)濾粘度較大、菌體較大的細(xì)菌發(fā)酵液。圖7-4 真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾設(shè)備1-料液斗；2-轉(zhuǎn)鼓；3-洗滌噴嘴；4-卸渣刮刀；5-真空錯(cuò)流過(guò)濾（cross-flowing filtration）：錯(cuò)流過(guò)濾也叫切向流過(guò)濾，采用多孔高分子材料作為過(guò)濾介質(zhì)，懸浮液在過(guò)濾介質(zhì)表面作切向流

22、動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切力將過(guò)濾介質(zhì)表面形成的濾餅移走，提高過(guò)濾速率，濾液質(zhì)量好，操作方便，但剪切力可能使蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)失活（見(jiàn)圖7-5）。3.2細(xì)胞破碎（cell disruption）大多數(shù)目的產(chǎn)物是胞外產(chǎn)物，如微生物胞外多糖、胞外酶等，發(fā)酵液經(jīng)離心分離或過(guò)濾分離以后，除去微生物細(xì)胞，得到含有活性物質(zhì)的清液或?yàn)V液，即可進(jìn)行下一步的分離純化工作。但也有一些目的產(chǎn)物是胞內(nèi)產(chǎn)物，特別是基因工程產(chǎn)品大多存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，就必須在預(yù)處理和固液分離以后進(jìn)行細(xì)胞破碎，使目的產(chǎn)物釋放到胞外，再進(jìn)行固液分離，對(duì)液相進(jìn)行分離純化。 基因工程產(chǎn)品的分離更有其特殊的困難之處，因?yàn)樽鳛槟康漠a(chǎn)物的蛋白質(zhì)常常互相交聯(lián)在

23、一起，形成不溶性聚集物，在分離工程中稱為包涵體（inclusion body）。存在于包涵體中的重組蛋白質(zhì)（recombination protein）在大多數(shù)情況不溶于水也不具備生物活性，因?yàn)槠浞肿觾?nèi)和分子間的二硫鍵搭錯(cuò)了位置。這也許是自然界保護(hù)物種免受外來(lái)基因侵襲的本能行為，使外來(lái)基因即使復(fù)制了也沒(méi)有生物活性。因此對(duì)于基因工程產(chǎn)品的分離除了細(xì)胞破碎以外，還要進(jìn)行包涵體的分離、溶解和蛋白質(zhì)復(fù)性等操作。圖7-5 錯(cuò)流過(guò)濾設(shè)備1-泵驅(qū)動(dòng)的料液入口；2-膜濾器；3-濾液出口；4-濃縮液3.2.1 常用的細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法有機(jī)械和非機(jī)械2類，機(jī)械類包括珠磨法、高壓勻漿法、超聲波法等，非機(jī)械類包

24、括酶溶性、化學(xué)滲透法等。機(jī)械破碎時(shí)，機(jī)械能轉(zhuǎn)化為熱量而使溶液溫度升高，因此必須采取冷卻措施，以免生物活性物質(zhì)失活。（1）珠磨法（bead mill）：細(xì)胞破碎常用珠磨機(jī)（見(jiàn)圖7-6）。在珠磨機(jī)中細(xì)胞懸浮液與直徑小于1mm的玻璃珠、石英砂等快速研磨，使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。一般采用夾套冷卻和攪拌軸冷卻使懸浮液冷卻。珠磨法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可連續(xù)生產(chǎn)，破碎率高，但溫度升高較多，對(duì)熱敏感的成分易失活，細(xì)胞碎片較小，給后續(xù)操作增加難度。（2）高壓勻漿法（high pressure homogenization）：高壓勻漿機(jī)由高壓泵和勻漿閥組成（見(jiàn)圖7-7），細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形孔，在高壓驅(qū)使下高

25、速運(yùn)動(dòng)并發(fā)生劇烈沖擊，使細(xì)胞破裂。高壓勻漿法操作簡(jiǎn)便，可連續(xù)操作，但細(xì)胞破碎率不如珠磨法，不適合于絲狀真菌和含有包涵體的基因工程菌的破碎作業(yè)。高壓勻漿法如果和酶溶法相結(jié)合，效果會(huì)更好。圖7-6 珠磨機(jī)1-帶冷卻夾套的磨室；2-帶冷卻系統(tǒng)的攪拌軸；3-料液入口；4-料液出口；5-冷卻劑進(jìn)口；6-冷卻劑出口圖7-7高壓勻漿機(jī)閥座；2-撞擊環(huán)；3-閥桿；4-調(diào)節(jié)手柄；5-料液入口；6-料液出口 具體操作方法，一般采用50-70MPa壓力，循環(huán)勻漿2-3次，即可使細(xì)胞破碎率達(dá)到70%左右。增加勻漿壓力和增加勻漿循環(huán)，可以提高細(xì)胞破碎率，但壓力超過(guò)一定值以后，繼續(xù)增加壓力的效果并不顯著。（3）超聲破碎法

26、（ultrasonication）：超聲波形成的空穴產(chǎn)生壓力對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生沖擊。常用的超聲波為10-200kHz的超聲波，超聲破碎機(jī)操作簡(jiǎn)便，可連續(xù)操作，但超聲振蕩會(huì)使懸浮液溫度升高，并使敏感的生物活性物質(zhì)失活，因而使用受到限制。 （4）酶溶法（enzymatic lysis）：酶溶法是非機(jī)械類細(xì)胞破碎法。微生物生長(zhǎng)到一定階段，即能產(chǎn)生溶胞酶，將自身的細(xì)胞壁溶解。因此控制發(fā)酵懸浮液的溫度、pH等條件，即可使細(xì)胞自溶。但在細(xì)胞壁水解的同時(shí)，作為目的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)也可能被水解變性。而且自溶法得到的懸浮液有較大的粘度，使過(guò)濾速率下降。因此可向懸浮液中添加專門的能水解胞壁的酶，如溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白

27、酶、甘露糖酶、殼聚糖酶等，溶解胞壁而不分解目的蛋白質(zhì)。酶種類的選擇應(yīng)根據(jù)微生物種類和目的產(chǎn)物的性質(zhì)而定。此法成本太高，因而使用受到限制。 自溶法的具體操作方法，發(fā)酵液調(diào)整濃度為3%，調(diào)整懸浮液pH，加熱至20-60，保溫?cái)嚢?0min，自溶即基本完成。添加酶溶法的具體操作方法，將菌體懸液于pH7.0，0.031mol/L磷酸緩沖液中，菌體濃度為50g/L，加入穩(wěn)定劑聚乙二酸或蔗糖溶液，每升懸浮液加入50-500mg溶菌酶，在36下作用30min，酶溶即完成。 3.2.2 包涵體的處理（treatment of inclusion body）與一般微生物細(xì)胞相比，基因工程菌的細(xì)胞破碎要復(fù)雜得多。

28、細(xì)胞破碎后先分離出包涵體，將包涵體溶解在變性劑中。再加入還原劑，還原蛋白質(zhì)中的半胱氨酸，使二硫鍵斷裂，得到單體肽鏈，再?gòu)?fù)性重新折疊。因此基因工程菌的細(xì)胞破碎包括包涵體的分離、包涵體的溶解、蛋白質(zhì)的復(fù)性3個(gè)步驟。（1）包涵體的分離(separation of inclusion body)首先將基因工程菌懸浮于緩沖液中，用溶菌酶法和（或）超聲波法處理基因工程菌，使菌體細(xì)胞破碎，離心（2 000-20 000r/min,15min），棄去上清液，得包涵體。再用蔗糖溶液、低濃度弱變性劑尿素緩沖液或溫和的表面活性劑0.4%Triton -100緩沖液等沖洗包涵體，清除附著在包涵體上的雜蛋白、DNA、R

29、NA和酶，得到較純的包涵體。（2）包涵體的溶解（solution of inclusion body）首先用弱變性劑尿素（或鹽酸脲）和表面活性劑十二烷基磺酸鈉溶解包涵體，使蛋白質(zhì)肽鏈分離。然后加入還原劑二巰基蘇糖醇（DTT）或二巰基乙醇（ME）、或還原型谷胱甘肽（GSH）等，使二硫鍵可逆地?cái)嗔?。此時(shí)重組蛋白呈可溶解和單體肽鏈的狀態(tài)。（3）蛋白質(zhì)的復(fù)性（reactivation of protein）變性蛋白質(zhì)經(jīng)初步純化濃縮以后，透析去除變性劑和還原劑。大部分蛋白質(zhì)即重新折疊，被空氣中的氧氧化，在正確位置上重建二硫鍵，恢復(fù)其活性。在此過(guò)程中加入微量的金屬離子（如Ca2+），可加速折疊蛋白的氧化。

30、4初步純化（primary purification)發(fā)酵液等生物材料經(jīng)預(yù)處理及固液分離和細(xì)胞破碎以后，得到了可供進(jìn)一步分離純化的液相。此液相仍是一個(gè)混合物，它既包含所需的目的產(chǎn)物，也包含各種雜質(zhì)，而且雜質(zhì)的種類和數(shù)量大大超過(guò)目的產(chǎn)物的數(shù)量。雜質(zhì)既有大分子，也有小分子；既有有機(jī)化合物，也有無(wú)機(jī)化合物。因此必需通過(guò)初步純化的多項(xiàng)單元操作，把目的產(chǎn)物與大部分雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，使雜質(zhì)數(shù)量低于目的產(chǎn)物的數(shù)量，供精細(xì)加工之用。初步純化的單元操作有萃取、吸附、沉淀、離心等，大多數(shù)情況下只使用其中的1種操作。4.1 萃?。╡xtraction）目標(biāo)物質(zhì)在發(fā)酵液或提取液中的濃度較低，必須通過(guò)萃取把目標(biāo)物質(zhì)與大多數(shù)

31、雜質(zhì)從混合物中分離出來(lái)。萃取包括溶劑萃取、超臨界流體萃取、雙水相萃取、反膠束萃取、凝膠萃取等。溶劑萃取和超臨界萃取用于小分子物質(zhì)的萃取，雙水相萃取和反膠束萃取用于蛋白質(zhì)等大分子的萃取。溶劑萃?。╯olvent extraction）溶質(zhì)在溶劑中的溶解度取決于兩者分子結(jié)構(gòu)和極性的相似性，相似則相溶。通常選擇萃取能力強(qiáng)、分離程度高的溶劑，并要求溶劑的安全性好、價(jià)格低廉、易回收、粘度低、界面張力適中。在用有機(jī)溶劑萃取水相中的目標(biāo)組分時(shí)，應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH、溫度、鹽濃度等，以提高萃取效果。用有機(jī)溶劑萃取水相中的有機(jī)酸時(shí)，應(yīng)先將水相酸化，反之亦然。萃取時(shí)水相溫度應(yīng)為室溫或低于室溫。在水相中加入氯化鈉等鹽類

32、，可降低有機(jī)化合物在水相中的溶解度，增加其在有機(jī)溶劑相中的量。在溶劑萃取時(shí)加入去乳化劑可防止操作引起的乳化現(xiàn)象和分離困難，常用的去乳化劑為陽(yáng)離子表面活性劑溴代十五烷基吡啶或陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉。溶劑萃取方法有單級(jí)萃取、多級(jí)錯(cuò)流萃取和多級(jí)逆流萃取3種。萃取設(shè)備有攪拌罐、脈動(dòng)篩板塔、轉(zhuǎn)盤塔等。溶劑萃取法可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)物回收率中等，但使用溶劑量大，安全性較差。(2) 超臨界二氧化碳流體萃?。╯upercritical fluid extraction）超臨界流體萃取用于從固體或液體物料中萃取高沸點(diǎn)、熱敏性組分。目前常用超臨界二氧化碳為萃取溶劑。二氧化碳無(wú)毒、無(wú)臭，價(jià)格低廉，

33、對(duì)很多溶質(zhì)有較大的溶解能力，臨界溫度接近室溫（31.1），臨界壓力適當(dāng)（7.38MPa）。在萃取罐物料中的目的物質(zhì)被超臨界二氧化碳流體萃取，經(jīng)升溫氣體和溶質(zhì)分離，溶質(zhì)從分離罐下部取出，氣體經(jīng)壓縮冷卻又成為超臨界流體，反復(fù)使用（見(jiàn)圖7-8）。圖7-8 超臨界二氧化碳流體萃取裝置1-萃取罐；2-加熱器；3-分離罐；4-壓縮泵；5-冷卻器溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度取決于兩者的化學(xué)相似性、超臨界流體的密度、流體夾帶劑等因素?；瘜W(xué)上越相似，溶質(zhì)的溶解度越大。流體的密度越大，非揮發(fā)性溶質(zhì)的溶解度越大，而流體的密度可通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和壓力來(lái)控制。二氧化碳流體中加入少量（1%-5%）夾帶劑即可有效地改變流體的相行

34、為。常用的夾帶劑有乙醇、異丙醇、丙酮等。用超臨界二氧化碳流體萃取魚(yú)油中的多不飽和脂肪酸可按下法進(jìn)行。魚(yú)油水解成脂肪酸，再合成為沸點(diǎn)較低的脂肪酸乙酯，加入尿素除去飽和脂肪酸乙酯和單烯脂肪酸乙酯，再用二氧化碳流體萃取C20以下的組分，剩余的即為EPA和DHA等多烯酸。超臨界二氧化碳流體萃取無(wú)毒、無(wú)臭，有較高選擇性，但設(shè)備昂貴，目前仍少大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。雙水相萃取(partition of two phases system)兩種親水性高聚物溶液混合后靜止分層為兩相（雙水相），生物大分子在兩相中有不同的分配而實(shí)現(xiàn)分離，而且生物大分子在上相和下相中濃度比為一常數(shù)。溶質(zhì)的分配總是趨向于系統(tǒng)能量最低的相或

35、相互作用最充分的相。常用的雙水相體系有聚乙醇（PEG）/葡聚糖（Dextran），PEG/Dextran硫酸鹽體系，PEG/磷酸鹽體系。聚乙二醇/葡聚糖體系常用于蛋白質(zhì)、酶或核酸的分離，聚乙醇胺/鹽體系則用于生長(zhǎng)素、干擾素的萃取。雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)在于可以從發(fā)酵液中把目的產(chǎn)物酶與菌體相分離，還可把各種酶互相分離。具體操作方法，Candida Bodinii的發(fā)酵液的濕細(xì)胞含量調(diào)整在20%-30%，加入PEG/Dextran雙水相，即可把菌體中的甲醛脫氫酶、過(guò)氧化氫酶等提取出來(lái)，酶分配在上層，菌體在下層。兩種酶分配系數(shù)不同，可進(jìn)一步用雙水相萃取法分離。但雙水相萃取使用的Dextran較昂貴，因此較

36、多使用PEG/鹽體系。（4）反膠束萃取（reversed micell extraction）32在水和有機(jī)溶劑構(gòu)成的兩相體系中，加入一定量的表面活性劑，使之存在于水相和有機(jī)相之間的界面。表面活性劑能不斷包圍水相中的蛋白質(zhì)，形成直徑為20nm-200nm的球形“反膠束”，并引導(dǎo)入有機(jī)相中，完成對(duì)蛋白質(zhì)的萃取和分離（見(jiàn)圖7-9）。在反膠束中蛋白質(zhì)并不與有機(jī)溶劑接觸，而是通過(guò)水化層與表面活性劑的極性頭接觸，因而蛋白質(zhì)在萃取過(guò)程中是安全的。1圖7-9反膠束萃取1-水相；2-有機(jī)相；3-反膠束反膠束萃取中常用的有機(jī)溶劑為辛烷、異辛烷、庚烷、環(huán)己烷、苯，以及混合的有機(jī)溶劑乙醇/異辛烷、三氯甲烷/辛烷、乙

37、醇/環(huán)乙烷等。表面活性劑的選擇是反膠束萃取的關(guān)鍵，常用的表面活性劑有丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉（AOT）、CTAB、TOMAC、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等。表面活性劑的濃度約為0.5 mmol/L。反膠束萃取不能用于萃取相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)如牛血清蛋白（68 000），最適宜于萃取相對(duì)分子質(zhì)量較小或中等的蛋白質(zhì)如-糜蛋白（25 000）。在使用陰離子表面活性劑時(shí)，在萃取前應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH至比目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI值低2-4個(gè)單位，以增加蛋白質(zhì)分子的表面電荷，提高萃取效果。在使用陽(yáng)離子表面活性劑時(shí)，應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH至高于蛋白質(zhì)pI值，使蛋白質(zhì)凈電荷為負(fù)值。反膠束萃取操作簡(jiǎn)單，萃取能力大，選擇性

38、中等，但前期選擇表面活性劑的研究工作量大，使用受限制。4.2 吸附（absorption）在生物活性物質(zhì)分離中常用固體吸附劑吸附溶液中的目的物質(zhì)，稱為正吸附；也可吸附雜質(zhì)，稱為負(fù)吸附。（1）普通吸附劑吸附(general absorbent absorption)普通吸附劑有活性炭、磷酸鈣、白陶土、硅藻土、聚酰胺等。活性炭是最常用的吸附能力很強(qiáng)的非極性吸附劑，對(duì)帶有極性基團(tuán)的化合物的吸附力較大，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量大的化合物吸附力大于相對(duì)分子質(zhì)量小的化合物，對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物?；钚蕴吭谒嵝匀芤褐形搅^強(qiáng)，因此吸附前應(yīng)調(diào)節(jié)水相pH在5左右。活性炭分2-3次加入效果比1次加入好，加

39、入后攪拌并靜止20min，再加入第二次。磷酸鈣由濃磷酸和氫氧化鈣反應(yīng)制成，呈凝膠狀，用以吸附目的蛋白質(zhì)或雜蛋白。白陶土為硅酸鋁，使用前應(yīng)加熱活化處理，常用來(lái)脫色、吸附相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，以及有機(jī)酸和胺類化合物。硅藻土為無(wú)定形的二氧化硅，化學(xué)穩(wěn)定，吸附力較弱。聚酰胺粉對(duì)黃酮類酸性物質(zhì)有選擇性的可逆吸附，分離效果很好。合成沸石分子篩為強(qiáng)極性吸附劑，常用于吸附細(xì)胞色素C等。用普通吸附劑吸附操作簡(jiǎn)便，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活，但專一性較差。（2）離子交換吸附(ion exchange absorption)離子交換吸附利用樹(shù)脂上的離子性功能團(tuán)與溶液中的離子進(jìn)行吸附，而將呈離子狀態(tài)的目的物質(zhì)或

40、雜質(zhì)從溶液中分離出來(lái)。常用的樹(shù)脂有強(qiáng)酸性、弱酸性、強(qiáng)堿性、弱堿性4類。強(qiáng)酸性樹(shù)脂為聚苯乙烯骨架上接磺酸基，如Dowex 50。弱酸性樹(shù)脂為聚丙烯骨架上接羧基，如Amberlite IRC 50。強(qiáng)堿性樹(shù)脂為聚苯乙烯骨架上接季胺堿性基團(tuán)，如Dowex 1和2。弱堿性樹(shù)脂為酚醛樹(shù)脂骨架上接伯胺、仲胺和叔胺。樹(shù)脂的吸附能力取決于交聯(lián)度、膨脹度和交換容量。交聯(lián)度小，則樹(shù)脂柔軟，容易溶脹，對(duì)較大離子易吸附。交換容量是指單位樹(shù)脂所含交換基團(tuán)的數(shù)量，取決于樹(shù)脂的種類、組成、交聯(lián)度、溶液pH、交換基團(tuán)性質(zhì)等。樹(shù)脂在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，強(qiáng)酸性樹(shù)脂用強(qiáng)酸處理，弱酸性樹(shù)脂用稀酸處理，強(qiáng)堿性樹(shù)脂用強(qiáng)堿處理，弱堿性樹(shù)脂

41、用稀堿處理。強(qiáng)酸性樹(shù)脂和強(qiáng)堿性樹(shù)脂在所有pH范圍內(nèi)都能吸附，但弱酸樹(shù)脂要求溶液pH調(diào)整為7，弱堿性樹(shù)脂要求溶液pH7，在選定的pH，目的物質(zhì)或雜質(zhì)呈陽(yáng)離子或陰離子而被吸附。根據(jù)目的物質(zhì)的性質(zhì)決定樹(shù)脂的種類。強(qiáng)堿性物質(zhì)選用弱酸性樹(shù)脂，弱堿性物質(zhì)用強(qiáng)酸性樹(shù)脂，強(qiáng)酸性物質(zhì)用弱堿性樹(shù)脂，弱酸性物質(zhì)用強(qiáng)堿性樹(shù)脂。溶液加入經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂后即進(jìn)行吸附，吸附了目的物質(zhì)的樹(shù)脂從溶液中分離出來(lái)，再把目的物質(zhì)從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。洗脫條件和吸附條件相反。在酸性條件吸附的在堿性條件下洗脫，在堿性條件下吸附的在酸性條件下洗脫。如pH緩沖液不能將目的物質(zhì)洗脫下來(lái)，就用含水的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫。用過(guò)的樹(shù)脂再生后可繼續(xù)使用。強(qiáng)酸性

42、樹(shù)脂用過(guò)量的強(qiáng)酸再生，弱酸性樹(shù)脂用稀酸再生，強(qiáng)堿性樹(shù)脂用過(guò)量的強(qiáng)堿再生，弱堿性樹(shù)脂用稀堿再生。離子交換吸附操作簡(jiǎn)便，選擇性較強(qiáng)，應(yīng)用較廣。（3）大網(wǎng)格聚合物吸附（macro-reticular polymer absorption）大網(wǎng)格聚合物為非離子樹(shù)脂，能從低濃度溶液中吸附有機(jī)化合物。大網(wǎng)格樹(shù)脂分為非極性、中極性、極性三種，分別以苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酰胺為骨架。根據(jù)類似物吸附類似物的原則，從極性溶液中吸附非極性溶質(zhì)應(yīng)選用非極性樹(shù)脂，從非極性溶液中吸附極性溶質(zhì)應(yīng)選用極性樹(shù)脂。上述兩種情況也都可選用中極性樹(shù)脂。樹(shù)脂在使用前應(yīng)用石油醚浸泡和水蒸汽處理以除去原料中的溶劑等，再用1 mol/

43、L氫氧化鈉或鹽酸處理，再用甲醇或含水甲醇淋洗，再用蒸餾水洗滌。被吸附的目的物質(zhì)能很容易地從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。通常用對(duì)被吸附物質(zhì)溶解度大的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的水溶液作為洗脫劑。弱酸性物質(zhì)在酸性條件下被吸附，應(yīng)在堿性條件下被洗脫。弱堿性物質(zhì)在堿性條件下被吸附，應(yīng)在酸性條件下被洗脫。使用過(guò)的樹(shù)脂用酸堿處理后，再用甲醇浸泡、蒸餾水淋洗，即可再生。大網(wǎng)格聚合物吸附操作簡(jiǎn)便，條件溫和，選擇性中等，有一定的應(yīng)用。4.3沉淀(precipitation)沉淀是將溶液中的目的產(chǎn)物或主要雜質(zhì)以無(wú)定形固相形式析出再進(jìn)行分離的單元操作。沉淀法有等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法。等電點(diǎn)沉淀法(isoelectric

44、precipitation)等電點(diǎn)沉淀法是調(diào)節(jié)溶液pH使兩性溶質(zhì)溶解度下降而析出。具體操作方法，先將發(fā)酵液在70 真空濃縮，然后降低物料液溫度至30，緩慢加入酸堿液至目的物質(zhì)的等電點(diǎn)，出現(xiàn)晶核，緩慢攪拌育晶2h，靜止沉降約4h，離心分離得到目的物質(zhì)。等電點(diǎn)沉淀法操作簡(jiǎn)便，成本較低，給分離體系引入的雜質(zhì)較少，但生物大分子即使在等電點(diǎn)仍有一定的溶解度，使沉淀不完全。而且許多生物大分子的等電點(diǎn)很接近，在沉淀目的產(chǎn)物的同時(shí)雜質(zhì)也相伴沉淀。因此等電點(diǎn)沉淀法應(yīng)結(jié)合其它方法一起使用，才能得到好的效果。還應(yīng)注意，生物大分子在結(jié)合離子后等電點(diǎn)將發(fā)生偏移，蛋白質(zhì)分子結(jié)合陽(yáng)離子后等電點(diǎn)升高，結(jié)合陰離子后等電點(diǎn)下降。

45、等電點(diǎn)沉淀法的另一缺點(diǎn)是目標(biāo)蛋白質(zhì)或酶在等電點(diǎn)處很不穩(wěn)定，容易被水解失活或鹽溶。（2）鹽析（salting out）鹽析是向溶液中加入大量中性鹽，中性鹽的離子中和生物大分子的表面電荷，破壞分子外圍的水化層，從而使生物大分子聚集沉淀。所使用的中性鹽為硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等，以硫酸銨為最常用。硫酸銨加入量根據(jù)欲沉淀的目的蛋白質(zhì)種類而定，以飽和度表示。飽和的硫酸銨溶液為100%飽和度，1L水在25時(shí)溶入767g硫酸銨溶液為100%飽和度，如溶入383.5g硫酸銨即為50%飽和度。具體操作方法，鹽析時(shí)硫酸銨應(yīng)磨細(xì)，邊緩緩攪拌邊緩緩加入，容器底部不應(yīng)沉積未溶解的固體鹽，避免局部過(guò)濃

46、使蛋白質(zhì)變性。加到所需飽和度以后，攪拌1h，再靜止一段時(shí)間，使沉淀“老化”。一般情況下鹽析應(yīng)在0-10進(jìn)行，減少蛋白質(zhì)或酶的失活。熱穩(wěn)定性的酶可在常溫下鹽析。在鹽析前應(yīng)調(diào)節(jié)溶液的pH至酶蛋白的等電點(diǎn)，但必須顧及在等電點(diǎn)處，目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。鹽析得到的沉淀可采用過(guò)濾法或離心法與鹽溶液相分離。鹽濃度較高時(shí)，鹽溶液比重大而粘度較小，可用過(guò)濾法。鹽濃度較小時(shí)，鹽溶液比重小而粘度大，可用離心法。沉淀中殘余的鹽可用透析法去除。鹽析法操作簡(jiǎn)便，常用于蛋白質(zhì)的分級(jí)沉淀分離，回收率中等。但廢水中鹽濃度太高，對(duì)環(huán)境不利，而且大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)很難進(jìn)行透析脫鹽。（3）有機(jī)溶劑沉淀法（solvent precipita

47、tion）生物大分子溶液中加入一定量的親水性有機(jī)溶劑，使溶質(zhì)的溶解度降低而沉淀析出，即有機(jī)溶劑沉淀法。常用的有機(jī)溶劑為乙醇、丙酮、甲醇、異丙醇等。其中乙醇最為常用，乙醇價(jià)格較低，酶蛋白在乙醇中的溶解度較低。乙醇用量應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)種類而定，通常應(yīng)經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定。丙酮的介電常數(shù)比乙醇小，沉淀能力比乙醇強(qiáng)。因此用丙酮代替乙醇時(shí)，可減少用量。即在乙醇濃度達(dá)70%時(shí)才能將目的產(chǎn)物沉淀下來(lái)的情況下，在丙酮濃度達(dá)50%-60%時(shí)即可達(dá)到相同的效果。具體操作方法，加入有機(jī)溶劑時(shí)應(yīng)分批不斷攪拌，以免局部過(guò)濃引起蛋白質(zhì)變性。降低操作溫度可減少蛋白質(zhì)變性和提高收率，因此在操作前應(yīng)將乙醇和蛋白質(zhì)溶液分別預(yù)冷至-10

48、為好。在操作前應(yīng)調(diào)節(jié)溶液pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，自然也必須顧及在等電點(diǎn)處目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。有時(shí)加入少量的高嶺土或硅藻土作酶沉淀的載體，以便離心收集酶沉淀。用離心法將蛋白質(zhì)沉淀和醇溶液分開(kāi)后，應(yīng)立即向沉淀中加入緩沖液或水，稀釋沉淀物內(nèi)的乙醇濃度，避免蛋白質(zhì)變性。（4）聚合物絮凝劑沉淀（polymer agglutinin precipitation）水溶性非離子型多聚物絮凝劑有脫水作用，加入蛋白質(zhì)溶液中可使蛋白質(zhì)沉淀。常用的多聚物絮凝劑有聚乙二醇（PEG）、壬苯乙烯化氧（NPEO）、右旋糖苷硫酸酯、葡聚糖等。聚乙二醇在水中的濃度達(dá)到50%時(shí)，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)可沉淀下來(lái)，操作可在常溫

49、下進(jìn)行。聚乙二醇廣泛用于遺傳工程中質(zhì)粒DNA的分離純化，在0.01mol/L磷酸緩沖液中加入相對(duì)分子質(zhì)量為60 000的聚乙二醇，使?jié)舛冗_(dá)到20%，可將相對(duì)分子質(zhì)量在106范圍的質(zhì)粒DNA沉淀下來(lái)。所得的沉淀物中含有較多的聚合物沉淀劑，可用鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法分離。沉淀物溶于磷酸緩沖液中，加入35%飽和度硫酸銨將蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，聚乙醇留在上清液中?；蛟诰彌_液中加入乙醇，離心沉淀蛋白質(zhì)，聚乙二醇則留在上清液中。聚合物絮凝沉淀法操作較復(fù)雜，應(yīng)用不廣泛。（5）其它氨基酸類沉淀劑：在氨基酸混合液中提取特定氨基酸時(shí)可用特殊沉淀劑。如用鄰二甲基苯磺酸鹽沉淀亮氨酸，用苯偶氮苯磺酸沉淀丙氨酸和絲氨酸，用2，

50、4-二硝基萘酚-7-磺酸沉淀精氨酸，用二氨合硫氰化鉻氨沉淀脯氨酸和羥脯氨酸。核酸類沉淀劑：用酚或三氯乙醛、氯仿、十二烷基磺酸鈉可沉淀核蛋白中的蛋白質(zhì)，使核酸游離出來(lái)。粘多糖類沉淀劑：粘多糖溶液中加入十六烷基三甲基季胺溴化物CTAB，季胺基的陽(yáng)離子與粘多糖的陰離子形成絡(luò)合物而沉淀，在與其它雜質(zhì)分離后加入鹽類，絡(luò)合物即解離，粘多糖重新溶解。親和沉淀劑：在溶液pH4時(shí)加入N-丙烯酰-對(duì)氨基苯脒，胰蛋白酶與對(duì)氨基苯脒配基發(fā)生親和沉淀。洗滌后調(diào)節(jié)pH可使胰蛋白酶重新游離出來(lái)。4.4離心（centrifugation）離心不僅用于固液分離步驟，也用于初步純化步驟。主要的離心純化技術(shù)包括制備型超速離心、密度

51、梯度離心、差分離心等。（1）制備型超速離心(ultraspeed centrifuge for preparation)根據(jù)轉(zhuǎn)速，離心機(jī)可分為普通離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)。普通型轉(zhuǎn)速在5000r/min以下；高速離心在5000-50 000r/min，一般都帶有制冷系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)；超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速在60 000r/min以上，最高可達(dá)160 000r/min，相對(duì)離心力為1 000 000g以上。相對(duì)離心力是離心力與重力的比值。根據(jù)用途，離心機(jī)可分為分析型、制備分析型、制備型和工業(yè)型等。制備型超速離心機(jī)由轉(zhuǎn)子、驅(qū)動(dòng)馬達(dá)、速度控制系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)組成。離心機(jī)的轉(zhuǎn)子最為貴重，分

52、為角度轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子、垂直管轉(zhuǎn)子、連續(xù)離心轉(zhuǎn)子、細(xì)胞洗脫轉(zhuǎn)子。角度轉(zhuǎn)子最常用，離心管中心線與轉(zhuǎn)軸呈15-35角，適宜分離細(xì)胞顆粒。水平轉(zhuǎn)子離心管中心線與轉(zhuǎn)軸平行，適宜于密度梯度離心。區(qū)帶轉(zhuǎn)子無(wú)離心管，用于大樣品密度梯度離心。垂直管轉(zhuǎn)子能進(jìn)行慢加速慢減速程序控制，用于差速離心。連續(xù)離心轉(zhuǎn)子在低速運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)加樣，高速運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)排出清液。制備型超速離心操作簡(jiǎn)便，但設(shè)備昂貴，大多數(shù)情況下不能連續(xù)操作。密度梯度離心（density gradient centrifugation）密度不同的生物物質(zhì)在密度梯度溶液中離心，被分布于不同位置而分離。制備密度溶液的材料應(yīng)粘度低、穩(wěn)定、不與樣品發(fā)生反應(yīng)、離心后易

53、與樣品分離、純度高、價(jià)廉。最常用的材料為蔗糖、甘油、氯化銫（CsCl）等，蔗糖應(yīng)用范圍最廣，氯化銫用于DNA、RNA和核蛋白的分離，蔗糖-葡萄糖用于染色體的分離，甘油用于膜片段、核片段和蛋白質(zhì)的分離，山梨醇用于病毒和酵母的分離，右旋糖苷用于微粒體的分離。具體操作方法，以蔗糖為例，首先將蔗糖配制成不同濃度的溶液，取相同容量的溶液依照濃度減小的順序加入離心管中，形成不連續(xù)的密度梯度，在20靜止2h，形成連續(xù)的密度梯度。加樣后離心，不同密度的組分被分配到不同密度梯度的溶液上。用22號(hào)注射針在離心管底部穿一小孔，不同密度的溶液可分部收集。密度梯度離心操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，選擇性較高。差分離心(diffe

54、rential centrifugation)差分離心是依次提高離心力，將各組分逐級(jí)進(jìn)行分離和純化的方法。先將樣品溶液在某一離心力場(chǎng)下離心，得到沉淀和上清，沉淀淘洗離心后為較純的粗顆粒組分。上清在加大的離心力場(chǎng)下離心，又得到沉淀和上清，這部分沉淀淘洗離心后為中等顆粒組分。依次類推。差分離心主要用于從細(xì)胞勻漿中分離各種細(xì)胞器。細(xì)胞勻漿（在0.25mol/L蔗糖溶液中）在1 000g時(shí)離心10 min得到細(xì)胞核，在3 300g時(shí)離心10 min得到線粒體，在16 300g時(shí)離心20 min得到溶酶體，在100 000g時(shí)離心30 min得到微粒體。差分離心操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，選擇性中等。4.5 膜

55、分離（membrane separation）膜分離是用不同孔徑的濾膜把不同相對(duì)分子質(zhì)量和體積的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)的方法。膜分離分為透析、微濾、超濾、納濾、反滲透5種。微濾膜孔徑為20 nm -10000nm，超濾膜為2-20nm，納濾膜為1-2nm，反滲透膜為0.1 nm -1nm（見(jiàn)圖7-10）。（1）透析（dialysis）超濾微濾納濾反滲濾細(xì)胞碎片、懸浮顆粒蛋白質(zhì)、多糖大分子多肽、糖、有機(jī)酸、二價(jià)鹽氨基酸、一價(jià)鹽、有機(jī)酸水在實(shí)驗(yàn)室條件下最早使用和最常用的膜分離是透析，透析能把相對(duì)分子質(zhì)量相差較大的兩類物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。常用的透析膜為玻璃紙、硝化纖維薄膜等。透析膜制成管狀。膜的孔徑也可用化學(xué)處理進(jìn)

56、行調(diào)節(jié)，經(jīng)乙?；幚砗竽さ目讖娇s小，用64%氯化圖7-10膜分離的種類鋅溶液浸泡后膜的孔徑增大，直至允許135 000相對(duì)分子質(zhì)量的大分子通過(guò)。透析膜在使用前應(yīng)在50%乙醇中煮沸1h，再依次用0.01 mol/L碳酸氫鈉溶液、0.01mol/L EDTA溶液、蒸餾水洗滌，除去雜質(zhì)。具體操作方法，先將待透析液裝入透析袋內(nèi)，扎緊兩端，液體占袋內(nèi)空間約一半，圖7-11旋轉(zhuǎn)透析器1-旋轉(zhuǎn)裝置；2-透析袋；3-玻璃珠；4-緩沖液或水以免透析袋吸水后脹裂。透析袋置于透析缸中，不斷更換溶劑（水或緩沖液），直至小分子物質(zhì)被透析至袋外。如使用旋轉(zhuǎn)透析器，透析效果可提高2-3倍（見(jiàn)圖7-11）。透析法操作簡(jiǎn)便，不

57、需要附加壓力，成本低廉，應(yīng)用廣泛，但選擇性較低。（2）微濾膜分離（microfiltration）微濾膜是由纖維素、聚砜、聚酰胺、全氟羧酸組成的管式或中空纖維式膜組件。在微濾膜分離時(shí)，在壓差推動(dòng)下，溶劑和小于膜孔的顆粒透過(guò)膜，大于膜孔的顆粒被截留。壓差由原料液側(cè)壓或透過(guò)液側(cè)抽真空形成。用于微濾分離的壓力較低，壓差一般小于100kPa。根據(jù)需要，選擇不同膜孔的微濾膜。膜孔的大小可用“截留相對(duì)分子質(zhì)量”來(lái)表示，用以測(cè)定膜孔的標(biāo)準(zhǔn)化合物為蔗糖（342）、棉子糖（594）、桿菌肽（1 400）、維生素B12（1 350）、胰島素（5 700）、細(xì)胞色素C（12 400）、肌紅蛋白（17 800）、胃蛋

58、白酶（35 000）、卵白蛋白（45 000）、血清蛋白（67 000）等。微濾膜分離主要用于細(xì)胞分離或產(chǎn)品消毒。微濾膜分離操作簡(jiǎn)單，使用壓力較低，但選擇性較差。（3）超濾膜分離（ultrafiltration）超濾膜由表皮層和支撐層組成，表皮層厚0.1-1m(100-1000nm)；支撐層厚125m，為多孔海綿層。起篩分作用的是表皮層，孔隙率60%，孔密度1011/cm2，截留相對(duì)分子質(zhì)量103106，操作壓力0.30.7MPa（見(jiàn)圖7-12）。圖7-12 管式超液膜組件1-料液入口；2-濃縮液出口；3-透過(guò)液出口；4-不銹鋼管；5-管式超濾膜超濾操作方法有重過(guò)濾和錯(cuò)流過(guò)濾兩種。其中重過(guò)濾使

59、用較多。重過(guò)濾時(shí)，原料液經(jīng)超濾后體積減少至原體積1/5，再加水至原體積，反復(fù)操作，脫除小分子雜質(zhì)，得到純度較大的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的溶液。錯(cuò)流過(guò)濾是將經(jīng)超濾的截留液再次通過(guò)超濾管式膜組件，得到大分子物質(zhì)的濃縮液，此時(shí)雜質(zhì)也被濃縮了。超濾膜過(guò)濾主要用于蛋白質(zhì)和酶的初步純化和濃縮，以及成品加工時(shí)去除熱原，操作簡(jiǎn)便，能耗低，效果佳，但容易造成膜污染和濃差極化，濃差極化是指膜表面截留組分濃度過(guò)分高于該組分在料液中的濃度。（4）納濾分離（nanofiltration）鈉濾分離和超濾分離極為接近，僅是孔徑變得更?。?-2nm）。納濾膜是用醋酸纖維、聚酰胺、聚乙烯醇、磺化聚砜組成的管式膜，像超濾膜一樣由表皮

60、層和支撐層組成。納濾的相對(duì)分子質(zhì)量截留范圍為100-250。因此能把小分子有機(jī)物截留濃縮，把水和無(wú)機(jī)鹽脫除。納濾的操作壓力低于反滲透。納濾分離主要用于肽的分離純化和濃縮、乳清的脫鹽和濃縮，或者食品工廠有機(jī)廢水的處理等，在分離純化工程中應(yīng)用較超濾少。（5）反滲透（reverse osmosis）反滲透膜材是帶皮層的不對(duì)稱膜，反滲透膜有高壓反滲透膜和低壓反滲透膜2種。高壓反滲透膜為三醋酸纖維素、直鏈或交聯(lián)全芳族酰胺、交聯(lián)聚醚等，操作壓力10MPa。低壓反滲透膜的皮層為芳烷基聚酰胺或聚乙烯醇，非皮層為直鏈或交鏈全芳族聚酰胺，操作壓力為1.42.0MPa。物料在壓力下通過(guò)反滲透膜構(gòu)建的中空纖維組件或卷