酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)第一部分: 基本實(shí)驗(yàn)原理基本原理 先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分，然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行抗原或抗體的定性或定量檢測。第二部分: 常用實(shí)驗(yàn)方法一、間接法 此法常用于測抗體。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗抗體）和底物顯色進(jìn)行測定（圖1）。圖1: 間接法測抗體示意圖固相抗原待測標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)酶標(biāo)抗抗體第二部分: 常用實(shí)驗(yàn)方法二、雙抗體夾心法 此法常用于測

2、抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗體和底物顯色進(jìn)行測定（圖2）。 圖2: 雙抗體夾心法測抗原示意圖第二部分: 常用實(shí)驗(yàn)方法三、競爭法 此法常用于測抗原和半抗原，也用于測抗體。以測抗原為例，將特異抗體吸附于固相載體，加入待測抗原和酶標(biāo)已知抗原，使兩者競爭與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)，即待測抗原和酶標(biāo)抗原顏色反應(yīng)的差數(shù)是待測抗原的含量（圖3）。圖3: 競爭法測抗原示意圖第三部分: 方法的特點(diǎn)和進(jìn)展 ELISA方法由于靈敏、特異，操作簡便、快速，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較為簡單，應(yīng)用范圍廣泛，無放射性污染等優(yōu)

3、點(diǎn)，成為目前普及應(yīng)用最廣，發(fā)展最快的免疫學(xué)技術(shù)之一。生物素-親合素系統(tǒng)（BAS）是在ELISA中應(yīng)用的常見技術(shù)（BAS-ELISA），其中ABC- ELISA法更為常用，其基本原理為，固相抗體+待測抗原+生物素化抗體+親合素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物+底物顯色。第四.一部分: 人TNF-檢測實(shí)驗(yàn)原理基本實(shí)驗(yàn)原理: 雙抗體夾心ABC-ELISA法。抗人TNF-單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的人TNF-會(huì)與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。同時(shí)加入生物素化的抗人TNF-抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合；抗人TNF-抗體與結(jié)合在單抗上的人TNF-結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去

4、。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有人TNF-，辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測A值，人TNF-濃度與A450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人TNF-濃度。第四.二部分: 實(shí)驗(yàn)試劑、材料和儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本試劑盒及其內(nèi)容物實(shí)驗(yàn)材料儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本人外周血(血清)1.收集血液的試管應(yīng)為無熱源和內(nèi)毒素試管2.血漿抗凝劑為EDTA3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明, 如有懸浮物應(yīng)離心除去4.避免溶血, 高血脂5.標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測,按一次用量分裝,凍存于-20,避免反復(fù)凍融6.可根據(jù)實(shí)際情況, 將標(biāo)本作適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn), 以確定稀釋倍數(shù))試劑盒及其內(nèi)容物1a 標(biāo)準(zhǔn)品

5、1支(4000pg，凍干)4 1b 標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液(粉紅色) 1瓶(15ml)4 2a 濃縮生物素化抗體2/1支*(60l)4 2b 生物素化抗體稀釋液（綠色）（15ml）4 3a 濃縮酶結(jié)合物2/1支*(60l)4(避光) 3b 酶結(jié)合物稀釋液(黃色)1瓶(15ml)4 4 濃縮洗滌液 20(蘭色)1瓶(15ml)4 5 顯色劑1瓶(6ml)4 6 終止液1瓶(12ml)4 抗體包被板條812 或 86 4 封板膠紙1張 說明書1份 *:96/48 Test實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1.加樣器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 200-1000ul2.吸頭: 10ul, 20

6、0ul,1000ul3.酶標(biāo)儀: 450nm4.雙蒸水或去離子水, 坐標(biāo)紙等第四.三部分: 實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。 2、將濃縮洗滌液（4）用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4。 3、標(biāo)準(zhǔn)品:以標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液復(fù)溶凍干標(biāo)準(zhǔn)品(1a), 靜置15分鐘后混勻，按說明稀釋至所需濃度，再進(jìn)行倍比稀釋至所需濃度。未用完的復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品放入-20保存, 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品不應(yīng)重復(fù)使用。4、可根據(jù)實(shí)際情況，將標(biāo)本做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(可做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。第四.三部分: 實(shí)驗(yàn)方法和步驟5、從密封袋中取出所需板條，其它板條密封放回46、除空白孔外，分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)

7、本100ul/孔加入板條的相應(yīng)孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本應(yīng)作雙復(fù)孔或三復(fù)孔。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37孵育90分鐘。7、洗板4次。8、除空白孔外，加入1:100稀釋的生物素化抗體(2a)工作液 100ul/孔，封住板孔， 37孵育60分鐘。第四.三部分: 實(shí)驗(yàn)方法和步驟9、洗板4次。10 、除空白孔外，加入1：100稀釋的酶結(jié)合工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37孵育30分鐘.11 、洗板4次.12、各孔加入顯色劑100 ul/孔,避光37孵育10-20分鐘。13、各孔加入終止液100ul/孔,混勻后即刻測A450值(5分鐘內(nèi))。標(biāo) 準(zhǔn) 品 稀 釋 方 法2000pg/ml1000pg/ml5

8、00pg/ml250pg/ml125pg/mlpg/mlpg/ml500lstd.500l500l500l500l500l第四.四部分: 結(jié)果判斷與計(jì)算1、每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。3、若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。4、試劑盒靈敏度：最小可測人TNF-a達(dá)4pg/ml。第四.五部分: 注意事項(xiàng)(1)1、手工洗板時(shí)，甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350l，靜止30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干，洗4次。2、冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象