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文檔簡介

1、紫外分光光度法測定免疫球蛋白A摘要:本文建立了用紫外分光光度計測定免疫球蛋白A的方法,分別考察了五個條件下在283nm處對測定IgA的影響。在選定的實驗條件下,IgA濃度在0.20400卩gML范圍內(nèi)均與283nm處的吸光度呈線性關(guān)系,該法已用于人血清中IgA的測定,結(jié)果滿意。關(guān)鍵詞:免疫球蛋白A(IgA)羊抗人免疫球蛋白A吸收光譜測定血清中免疫球蛋白A的含量對診斷和指導治療肝臟疾病、結(jié)締組織疾病和腎病有實際的臨床意義1。目前檢測IgA的方法主要有酶免疫分析法、免疫熒光法、免疫比濁法、共振散射法2等。本文將吸收光譜與高選擇性的免疫反應相結(jié)合,建立了一種定量檢測人血清中免疫球蛋白A的新方法。本法

2、具有操作簡便、快速,所用儀器簡單等特點,用于樣品分析,結(jié)果滿意。1實驗方法在10mL比色管中分別加入0.4mLpH值為6.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,0.30mL經(jīng)過適當比例稀釋的羊抗人IgA溶液,0.60mL的PEG4000一定量的IgA溶液,用二次純水定容至3mL,搖勻,靜置30分鐘。用紫外可見分光光度計掃描得到體系的吸收光譜,測定283nm波長處的吸光強度A;不加IgA作空白,測其吸光強度Ib;計算A=AAb。2結(jié)果與討論根據(jù)免疫反應原理,lgA抗原與IgA抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-抗體復合物微粒。PEG為一種無電荷的線性分子的多糖,能夠解除抗原抗體周圍的電子云和水化層,促進兩者靠

3、近并結(jié)合成大復合物,加快反應速度。IgA在一定濃度范圍內(nèi)隨其濃度的增加,在283nm處的吸收強度呈線性增強,據(jù)此可建立IgA的免疫吸收光譜分析法。2.1吸收光譜IgA和羊抗人IgA血清在283nm處都有1個吸收峰,隨著IgA濃度增大該吸收峰強度呈線性大大增強。本實驗未采用試劑廠家推薦波長340nm,因為在340nm處吸光度值變化幅度小,為了增加靈敏度,本實驗采用283nm為測定波長。2.2pH值、緩沖溶液用量的選擇分別測定了pH值為5.88.0范圍內(nèi)體系在Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中A283nm的波動變化。結(jié)果表明,當pH值為6.2時,A283nm達到最大值,增加靈敏度的效果達到最好,所以

4、本文選擇了pH值為6.2的Na2HPO4希檬酸緩沖溶液;又考察了緩沖溶液的用量從00.8mL對A283nm的影響。結(jié)果表明,當緩沖溶液的用量在0.400.8mL時A變化不大,免疫復合物結(jié)合較穩(wěn)定,故選用0.40mL緩沖液。2.3聚乙二醇的選擇聚乙二醇簡稱PEG因分子量不同,對體系的影響不同。分別考察了PEG-4000、PEG-6000PEG-10000用量01mL對體系A(chǔ)283nm的影響。隨著PEG用量的增加,AA顯著增加,但Ab也有明顯增加,當PEG用量為0.8mL時空白值已上升的相當大嚴重影響了靈敏度。要提高靈敏度就必須得降低空白值,所以本實驗選取用0.6mL的PEG4000濃度為60mg

5、mL-1。2.4羊抗人IgA用量的選擇分別試驗了羊抗人IgA用量為0-0.8mL時對A283nm的影響變化情況。當羊抗人IgA用量為0.30mL時,體系的AA達到最大值。隨著羊抗人IgA用量的繼續(xù)增加,AA呈降低趨勢,故本文選取羊抗人IgA血清的最佳用量為0.30mL。2.5溫度及反應時間的影響考察了不同溫度下對體系的影響。結(jié)果表明,室溫下AA較大,條件容易簡單,容易控制,且靈敏度也較高。同時考察了反應時間的影響,室溫條件下30分鐘后,反應已完全且實驗結(jié)果比較穩(wěn)定,在30分鐘內(nèi)基本無變化。故本文選擇在室溫條件下進行,反應時間為30分鐘。2.6線性關(guān)系在選定的實驗條件下,分別測定不同濃度ClgA(卩g的吸光強度A283nm并繪制工作曲線,發(fā)現(xiàn)濃度在卩gML范圍內(nèi)與A283nm之間存在良好的線性關(guān)系;回歸方程為:A283nm=0.1869ClgA+0.0204耳關(guān)系數(shù)為0.998。2.7樣品的測定取正常人血清5份,用移樣器準確移取100L用水稀釋至5mL;再移取100L按實驗方法測定,測定結(jié)果與人體正常血清中IgA的含量基本一致3。樣品由商丘市第一人民醫(yī)院提供。參考文獻姚春艷,俯偉靈.人免疫球蛋白功能及臨床診斷方法J.中國新醫(yī)藥,2004,3(3):55.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志,2004,7(1

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