酶免疫分析法

1、免疫分析法(immunoassay, IA)是基于抗原和抗體特征性反應(yīng)的一種技術(shù)。 由于疫分析試劑在免疫反應(yīng)中所體現(xiàn)出的獨特的選擇性和極低的檢測限，使這種 分析手段在臨床、生物制藥和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。1、酶免疫分析(EIA)酶免疫分析是一種非放射性標記免疫分析技術(shù)，以酶標記抗原或抗體作為示 蹤物，由高活性的酶催化底物顯色或發(fā)光，達到定量分析的目的。這種方法是對 細胞融合技術(shù)的一項重要應(yīng)用。因其操作簡便，不需昂貴設(shè)備，不污染環(huán)境，加 之酶標記物相當(dāng)穩(wěn)定，有效期長，應(yīng)用范圍廣泛而受環(huán)境檢驗工作者青睞。最初 應(yīng)用的EIA技術(shù)，多采用HRP標記抗體或抗原，靈敏度不高。后來逐步發(fā)展了 各種放大

2、體系，如底物循環(huán)放大體系、酶聯(lián)級放大體系、生物素-親和素放大體 系、脂質(zhì)體或紅細胞等作為標記物載體以包載大量標記物的放大體系，以及采用 PCR技術(shù)的PCR-EIA分析，使靈敏度有很大改進。生物素-鏈親和素酶免分析(biotin avidin system BAS-EIA)1生物素(botin)廣泛存在于動植物組織中，在生物體內(nèi)是羧化酶的輔酶；親 合素又名抗生物素蛋白，與生物素具有高度的親和性，利用這一點，以生物素和 親和素為中介，可增強抗原-抗體反應(yīng)的結(jié)合提高檢測方法的靈敏度。但親和素 的非特異性結(jié)合高，后又發(fā)現(xiàn)另一種親合素，稱之為鏈親合素(Streptavin，SA)， 克服了親合素非特異性

3、結(jié)合高的缺點。免疫分析技術(shù)中，目前均采用SA供標記 酶或其它示蹤劑。一個完整的SA分子上的4個相同亞基，都可以和一個生物素 分子結(jié)合，其Ka值達1015L/mo1，是抗體抗原反應(yīng)的10100萬倍。又加之一 個抗體或抗原分子結(jié)合多個生物素分子，不改變其免疫活性。脂質(zhì)體免疫分析法(liposome immunoassay， LIA)1脂質(zhì)體是一種生物摸擬膜，它是磷脂分子分散于水相介質(zhì)中形成的密閉的雙 子單層或多層的囊泡。其膜內(nèi)可包容上萬個標記物分子，具有很高的信號放大作 用。因此，將脂質(zhì)體用于免疫分析是提高非放射免疫分析靈敏度的有效途徑之一， 由此所建立起來的方法即為脂質(zhì)體免疫分析法。1.3PCR

4、-EIA 分析1PCR-EIA技術(shù)是運用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應(yīng)的特異性，它 以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接的DNA， 由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。由于PCR的高擴增能力，只需數(shù)百個抗 原分子即可檢測，甚至在理論上可檢測到一至數(shù)個抗原分子。1.4酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）ELISA是一種主要的免疫分析方法，又可分為直接競爭法、接競爭法、雙抗 體夾心法和間接夾心法。直接競爭法是將抗體包被到聚苯乙烯微孔反應(yīng)板上，加 入酶標記農(nóng)藥和待測農(nóng)藥，酶標記農(nóng)藥和待測農(nóng)藥之間與抗體的競爭而發(fā)生結(jié)合 反應(yīng)。由于待測農(nóng)藥多，則反應(yīng)后被吸附到反應(yīng)板上的酶標記

5、農(nóng)藥少，即吸附到 酶反應(yīng)板上的酶標記農(nóng)藥的量與待測液中農(nóng)藥的含量成反比。加入酶底物顯色 后，進行比色，可以測定待測農(nóng)藥含量。間接競爭法的前一部分與抗原包被直接 競爭法相同，只是不用酶標記農(nóng)藥抗體（一抗），而是標記第一抗體，在競爭反 應(yīng)結(jié)束后，加入酶標一抗，發(fā)生一抗與酶標一抗的結(jié)合反應(yīng)，被結(jié)合的酶標一抗 的量與包被抗原結(jié)合的一抗的量的變化趨勢是一致的，即被結(jié)合的酶標一抗的量 與待測農(nóng)藥的含量成反比。此方法的優(yōu)點是一個農(nóng)藥抗體可以結(jié)合多個酶標一 抗，大大提高了方法的靈敏度。雙抗體夾心法是將抗體包被固相載體，加入待測 抗原使其與過量的固相抗體結(jié)合，再加入過量的酶標記相同的抗體，分離固相和 游離相的化

6、合物，加入底物，據(jù)顯色程度來求出樣品中抗原的含量。間接夾心法 是將樣品中的抗原結(jié)合于過量的固相抗體，加入過量的同種抗體（一抗），洗滌 后加入酶標一抗，最后加入底物反應(yīng)，據(jù)顯色程度確定待測抗原的含量。2、免疫分析技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用1960，Yalow和Berson年第一次應(yīng)用免疫分析技術(shù)檢測血清中的胰島素。 隨后，免疫分析技術(shù)迅速發(fā)展起來，但主要集中在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。 直到20世紀80年代免疫分析技術(shù)對環(huán)境化學(xué)物質(zhì)檢測的應(yīng)用才受到了重視。1971年，Ercegovich首先提出了將免疫化學(xué)方法應(yīng)用到環(huán)境領(lǐng)域。他建議用 免疫學(xué)的篩選方法快速檢測農(nóng)藥殘留。1975年，殺蟲劑、艾氏劑和狄

7、氏劑的放 射免疫分析作為免疫分析應(yīng)用于環(huán)境污染物檢測領(lǐng)域第一次報道出來。在初始階 段，研究者將注意力集中在了農(nóng)藥的免疫學(xué)分析中，他們做了大量的工作，所用 的技術(shù)主要是放射免疫法（RIA）。1972年，Vanweemen和Engavall等人建立了 酶免疫測定方法（enzyme immunoassay， EIA）。1975 年，Koh ler 和 Mil-stein 利 用雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（McAb）。但是由于各方面條件的限制，這兩項 技術(shù)在環(huán)境檢測領(lǐng)域中的研究應(yīng)用未引起足夠的重視。進入20世紀80年代， EIA首先應(yīng)用到農(nóng)藥的檢測中，1982年Huner和Wie分別報道了對硫磷和除蟲

8、 脲的EIA法檢測。此后，EIA和McAb被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域的環(huán)境污染物的 免疫分析。1989年，美國環(huán)境保護局、農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗司和美國分析化學(xué)家組織 共同制定了農(nóng)藥殘留免疫學(xué)檢驗商品試劑盒評定和認可的建議準則。免疫分析得 到了大多數(shù)科學(xué)團體和執(zhí)法機構(gòu)的認可。目前，至少有十幾種商業(yè)免疫試劑盒被 EPA認可。2.1免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用免疫測定技術(shù)在環(huán)境污染物上的應(yīng)用首先是在農(nóng)藥方面的檢測。最初，大多 數(shù)學(xué)者研究農(nóng)藥免疫分析技術(shù)的目的只是用于臨床檢測農(nóng)藥中毒病人血清、尿樣 和組織中的農(nóng)藥殘留水平。后來逐漸被環(huán)境研究者重視開始用于環(huán)境領(lǐng)域。在環(huán) 境方面的應(yīng)用最早的是美國，他們把這

9、一方法應(yīng)用于地下水和河水中除草劑的檢 測分析中?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出幾十種農(nóng)藥的免疫測定技術(shù)。EIA技術(shù)可以用于檢測水、土壤、食品中的各種農(nóng)藥殘留，方法簡便：決速 前處理程序簡化（不需凈化），反應(yīng)既可在試管中進行，也可在微孔板上進行； 若在96孔板上，每次可分析幾十個樣品，A可同時作出標準曲線。目前應(yīng)用最 多的是酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定法。Seliske等采用競爭ELISA法用兔抗白草枯抗體包被磁株固相檢測百草枯， 從各種水果和蔬菜中提取百草枯只用30 min，檢出限為10 ng L-1，平均回收率 達99%，而用分光光度計法樣品提取則擊5 h，兩種檢測方法相關(guān)系數(shù)達0.994。 Schlae

10、ppi等運用直接競爭ELISA法和間接競爭ELISA法分別檢測土壤中的異內(nèi) 甲草胺，產(chǎn)生的抗異內(nèi)甲草胺單克隆抗體有極強特異性，與其代謝產(chǎn)物無交義反 應(yīng)，直接和間接競爭ELISA法對土壤中異內(nèi)甲草胺的回收率分別為98%和89%。 Brandon等在1994年制備了一種可以與苯并咪葉類藥劑（內(nèi)硫多菌靈、芬苯達 葉、奧芬達葉及它們的代謝物）結(jié)合的單克隆抗體，該抗體也可與甲基苯并咪 Ash氨基甲酸醋（苯菌靈的一種代謝物）結(jié)合。新的半抗原5 （6）-（烴基戊基 硫代）-2-苯并咪葉氨基甲酸醋可在大鼠體內(nèi)得到，這種改進了的ELISA法可以 檢測苯并咪葉及多種農(nóng)藥，檢出限為1-8 . gkg-1。我國的研究

11、者也自行開發(fā)了許多EIA檢測方法：成功地合成了對硫磷人 工抗原，并在免疫的兔了體內(nèi)獲得高效抗血清。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用了 ELISA法 對梨、蘋果中的對硫磷殘留量進行檢測，并以GC法驗證，充分說明其具有良好 的重現(xiàn)性。通過化學(xué)方法，將殺蟲瞇偶聯(lián)到載體蛋白上制成抗原，然后免疫 BA LB/ C小鼠。經(jīng)細胞融合、篩選、克隆等步驟，獲得了抗殺蟲瞇的特異性抗 體，并以該抗體建立了大米中殺蟲瞇殘留量的單克隆抗體ELISA檢測方法。 應(yīng)用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，研制出特異性強的T-2毒素的單克隆抗體，并建立 了小麥T-2毒素的ELISA檢測方法。農(nóng)業(yè)中應(yīng)用舉例：酶聯(lián)免疫吸附分析法測定水樣中的阿特拉津趙銀麗等利用

12、免疫學(xué)原理合成恩諾沙星的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠, 然后應(yīng)用細胞融合技術(shù)將小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤，通過酶聯(lián)免 疫試驗篩選分泌恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并以抗恩諾沙星的單克隆 抗體(ENR mAb)為基礎(chǔ)研制檢測恩諾沙星殘留的競爭ELISA試劑盒(competitive ELISA ENR-Kit)，并測定其性能。結(jié)果表明:篩選出的2株雜交瘤細胞，單抗亞類均 為IgG1型，其中4G1-B3株的ENR mAb間接ELISA效價為1:1.024X 106，親 和常數(shù)(Ka)為9X1010L/mol；競爭ELISA試劑盒的線性檢測范圍為0.05101.6 M g/L、靈

13、敏度0.05p g/L、半數(shù)抑制濃度(IC50)1.川g/L,與其他化合物的交叉反 應(yīng)率(CR%0小于0.01 %，雞肉樣、雞肝樣、魚肉樣和牛奶樣的平均添加回收率 分別為81.5%、87.6%、84.3%和95%，不同基質(zhì)添加恩諾沙星標準品做競爭ELISA 對ENR-Kit檢測結(jié)果影響小，試劑盒保存期6個月以上。檢測所有樣品的平均 變異系數(shù)均小于10%，并且不同基質(zhì)中添加標準品所建立的標準曲線非常相似, 對檢測結(jié)果影響小。所以該試驗建立的競爭ELISA方法可以對恩諾沙星在多種 動物性產(chǎn)品中的殘留進行檢測,符合國家的檢測標準。結(jié)果說明該競爭ELISA試 劑盒具有快速、敏感、特異、簡便等特點，適用

14、于ENR殘留的快速檢測。2.2免疫分析技術(shù)在工業(yè)污染物上的應(yīng)用工業(yè)污染物的免疫測定研究始于20世紀80年代，進入20世紀90年代后， 研究者在前人的基礎(chǔ)上進行了進一步的研究。2002年，西班牙人Patricia Noguera， Rosa Puchades等改進了五氯酚(PCP)的酶免疫檢測技術(shù)，他們將PCP的檢測 限提高到 0.1ng mg-1。1997 年，Harrion R O， Carlson R E， Carlson R E 制備 了 2, 3, 7, 8-TCDD的單克隆抗體，用競爭性抑制法建立了 2種測定方法，一 種是酶聯(lián)管，檢測靈敏度100pg 管-1，另一種是酶聯(lián)板，檢測靈敏

15、度25 pg 孔 -1。1999 年，Mei Liu，QingX Li，Garry A Rechnitz建立了 PAHs 的流動注射免疫 測定技術(shù)。Y su gawarea等用ELISA法測定2,3,7,8-TCDD的IC50值是12 pg孔 管-1，可測定的濃度范圍是2-240 pg 孔槽-1,即40-480 pg mg-1。B E Watkins 等制備的單克隆抗體測定TCDD的IC50是200 pg 孔槽-1。Y W Chiu等開發(fā)了 共面 PCB、3, 4, 3，4-PCB ； 3, 4, 3，4，5-PCB 的 ELISA 測定方法。2.3免疫分析技術(shù)在重金屬上的應(yīng)用理論上只要能夠產(chǎn)

16、生特異性的抗體，就可以采用免疫技術(shù)。隨著免疫技術(shù)在 環(huán)境有機污染物方面的應(yīng)用，重金屬研究者一也把目光轉(zhuǎn)移到免疫技術(shù)上。1991 年，Dwane E Wylie Larry D Carlson等制備出了汞的單克隆抗體，建立了 ELISA 檢測方法，檢測的范圍在0.5-10p gL-1該方法與原子吸收方法的相關(guān)系數(shù)大于 0.99。1998 年，Mehraban Khosraviani Diane ABlake 等制備了 Cd-EDTA 特異性單 隆抗體，能夠檢測7-500p gL-1濃度的Cd (II)。2.4問題與展望環(huán)境殘留物質(zhì)免疫分析方法尚處在研究和開發(fā)階段，目前在我國還沒有得到 普遍的認可

17、。由于環(huán)境污染殘留物的種類多，既有化學(xué)工業(yè)污染物又有農(nóng)藥和重 金屬等，因此免疫檢測分析系統(tǒng)的建立也不相同。目前主要存在以下問題：環(huán)境污染物都為小分子物質(zhì)，不具有免疫原性，需要與大分子物質(zhì)(如 BSA, OVA, KLH等)結(jié)合后才能被動物的免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生抗體，這就需 要環(huán)境污染物半抗原制備要經(jīng)過仔細的設(shè)計，既保留環(huán)境污染物分子的基木特 征，又要能夠很好地與大分子結(jié)合。因此，對半抗原的合成提出了很高的要求?？贵w的產(chǎn)生機理還不是很明確，這對抗體的特異性有很大的影響，而 環(huán)境污染物的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，許多工業(yè)污染物結(jié)構(gòu)相似，許多農(nóng)藥是通過修飾同 一母體結(jié)構(gòu)上的特定集團衍生出來的，這樣在免疫分析過程中

18、這些結(jié)構(gòu)類似的化 合物往往會產(chǎn)生很強的交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測人員只能確定是某類化 合物的殘留，因此人們大多把免疫分析作為一項初檢的技術(shù)來應(yīng)用。(2) 一般1種特異性的抗體只能檢測1種或者幾種結(jié)構(gòu)相似的少數(shù)化合物， 如果是多殘留檢測，這就給分析增加了成本。(4)免疫分析依賴的是抗原和抗體的反應(yīng)，該反應(yīng)受外界的影響很大(pH 值、離子強度、有機溶劑的干擾、反應(yīng)的時一間、反應(yīng)的溫度等)。而環(huán)境樣品 又非常復(fù)雜，涉及土壤、水和植物等。因此，免疫檢測技術(shù)的建立要詳盡考慮十 擾因素。免疫技術(shù)在40年的發(fā)展中不斷出現(xiàn)新方法和新手段，有力地推動了環(huán)境污 染物免疫分析技術(shù)的快速發(fā)展，相繼出現(xiàn)了脂質(zhì)體免疫測定法、流動注射免疫分 析、克隆酶給子體免疫測定法、控溫相分離免疫測定法等新技術(shù)，此外免疫技術(shù) 與其他技術(shù)聯(lián)用，利用各種技術(shù)的特點，彌補相互之間的不足，可以更好地應(yīng)用 十環(huán)境中的各種污染物的分析，如免疫分析與流動注射系統(tǒng)相結(jié)合形成流動注射 免疫分析，免疫分析與傳感器結(jié)合形成免疫傳感器，免疫技術(shù)與氣相、液相色譜 聯(lián)用等。未來免疫分析技術(shù)的發(fā)展將主要集中在多殘留組分免疫測定法、