分子克隆的內(nèi)涵和方式

1、分子克隆的內(nèi)涵和方式克隆的概念純系、無性系一種人工誘導的無性繁殖方式DNA克隆目的：建立繁殖目的基因的細胞系含義：建立目的DNA分子繁殖體系的過程三個要素: 目的基因、載體、受體細胞涉及DNA分子體外重組；轉(zhuǎn)化受體細胞分子克隆步驟 DNA分子體外重組 轉(zhuǎn)化 篩選將核酸分子(DNA)插入到可在原核或真核細胞中無性繁殖的載體中，攜帶外源DNA的載體在宿主細胞內(nèi)大量復制的過程經(jīng)過篩選獲得單一克隆2.2 克隆載體要能夠獨立地在宿主細胞中復制載體的功能為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的表達提供條件載體的功能及其特征載體的特征（應具備的條件）具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性具有與特定受體細胞相適應的復制

2、位點或整合位點長度盡可能小，以提高其載裝能力具有多種單一的酶切位點具有合適的選擇性標記 載體類型 克隆載體 表達載體 質(zhì)粒 噬菌體 粘粒 酵母人工染色體 細菌F因子；P因子目的DNA在宿主細胞中復制目的基因在宿主細胞中復制、表達質(zhì)粒質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。分子量在1-200kb之間。一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的基本特性自主復制性攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori） 一個控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因； 能獨立

3、于宿主細胞的染色體DNA而自主復制拷貝數(shù)少則幾個，多則幾百個不等，需要使用宿主細胞復制染色體DNA的多種酶群質(zhì)粒 復制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質(zhì)粒 p15A 10212 pSC101 及其衍生質(zhì)粒 pSC101 5 ColE1 ColE1 1520 質(zhì)粒按復制方式可分為兩類： 松弛型復制 嚴謹型復制少于10個拷貝 可擴增性氯霉素擴增：在蛋白質(zhì)合成中斷時，質(zhì)粒復制能持續(xù)合成，這樣當用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColEI復制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大

4、量復制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。質(zhì)粒psc101和p15A的復制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復制。pMB1或ColEI類質(zhì)粒復制子的復制完全依靠宿主細胞提供的半衰期較長的復制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物）可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，有些天然質(zhì)粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)要素：移動基因mob 轉(zhuǎn)移基因tra 轉(zhuǎn)移起始位點bom 內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點 nic順式元件 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點 nic，mob基因、t

5、ra基因都由質(zhì)粒提供）人工構(gòu)建的載體質(zhì)粒多拷貝 復制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上穿梭質(zhì)粒 含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制表達載體 裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內(nèi)的高效表達實驗室常用質(zhì)粒 pBR322該質(zhì)粒具有以下優(yōu)點分子大小4363bp，容易純化;含有2個抗生素抗性基因，可以作為選擇標記;受體細胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內(nèi)可達到15個，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，可達

6、到1000-3000拷貝，如氯霉素?？梢援a(chǎn)生大量的重組pBR322分子。 質(zhì)粒小、轉(zhuǎn)化率高質(zhì)粒大、拷貝數(shù)低15kb 轉(zhuǎn)化率成為限制因素pBR322該質(zhì)粒具有以下優(yōu)點分子大小4363bp含有2個抗生素抗性基因，可以作為選擇標記。而且每一個標記基因都含有單一的酶切位點，可以插入DNA，amp基因內(nèi)可被Pst I, Pvu I, Sac I切開，而四環(huán)素抗性基因可被BamH I, Hind III切開，通過插入失活篩選重組子。受體細胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內(nèi)可達到15個，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下如氯霉素，可達到1000-3000拷貝。 實驗室常用質(zhì)粒 pUC系列載體 puc

7、系列載體包括4個組成部分：來自質(zhì)粒pBR322的復制起點 氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌-半乳糖苷酶基因(1acz)的啟動子及編碼-肽鏈的DNA序列（1acZ基因）1acz基因5端帶有一段MCS，但它并不破壞lacZ基因的功能。在特定的受體細胞中可表現(xiàn) -互補作用，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。這兩個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點的排列方向相反Figure 4.10. Map of plasmid vector pUC19. The origin of replication (ori) was derived originally from a ColE1-li

8、ke plasmid, pMB1. The ampicillin resistance gene (ApR) was derived originally from the plasmid RSF 2124 and permits selection for cells containing the vector molecule. A portion of the lacZ gene is included and is expressed to give an amino-terminal fragment of -galactosidase. This is complemented b

9、y a mutant lacZ gene in the host cell: the products of the vector and host cell lacZ sequences, although individually inactive, can associate to form a functional product. The 54 bp polylinker multiple cloning site (capital letters) is inserted into the vector lacZ (lower case letters) component in

10、such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However, cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and absence of -galactosidase activity. 在特定的受體細胞中可表現(xiàn) -互補作用，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z, 2743bppGEM-4Z, 2746bp

11、在多克隆位點的兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子，如 Sp6 和 T7 噬菌體的啟動子pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差別在于二者互換了兩個啟動子的位置。作用：體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的制備實驗室常采用堿法制備質(zhì)粒堿裂解法將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加NaOH與SDS的混合溶液，去膜、釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分 蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì) 及核酸酶 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 無DNase的RNase處理殘余RNA 二 DNA載體噬菌體是大腸桿菌的噬菌體裂解途徑溶原途徑噬菌體由外殼蛋白和-DNA組成；

12、-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長。5GGGCGGCGACCTNN NN3 3NN NNCCCGCCGCTGGA5cos 48502 bp cos DNA進入宿主細胞后，粘性末端連接，形成環(huán)型分子 ; 噬菌體含基因50個以上，功能相近的聚集成簇Figure 4.12. Map of the genome, showing positions of genes (vertical bars). In replacement vectors, the nonessential region is removed by restrictio

13、n endonuclease digestion, leaving a left arm and a right arm. A foreign DNA fragment can be ligated to the two arms in place of the original stuffer fragment, providing maximal insert sizes of over 20 kb. Genes required for lysogenic function are located in a central segment of the genome.噬菌體通過特殊的生物

14、學方式將其DNA導入宿主細胞吸附： 注入DNA：吸附于大腸桿菌外膜上的LamB受體（正常功能是運轉(zhuǎn)麥芽糖進入細胞內(nèi)），麥芽糖可誘導這些受體的合成，故它也可促進噬菌體的吸附與感染（尾部吸附）噬菌體 DNA 進入宿主細胞后，其兩端互補單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀 DNA 分子此時，噬菌體可選擇進入：裂解生長狀態(tài)（lytic growth） 溶源狀態(tài)（lysogenic state）將噬菌體基因組 DNA 通過位點專一性重組整合到宿主的染色體 DNA 中，并隨宿主的繁殖傳給子代細胞。 大量復制并組裝成子代噬菌體顆粒，導致宿主細胞裂解。經(jīng)過 4045min 的生長循環(huán)，釋放出約 100 個感染性噬菌體顆粒

15、（每個細胞）；包裝： 包裝蛋白在宿主細胞內(nèi)合成，包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復合物，因此cos區(qū)對包裝是至關(guān)重要的。包裝時由一個蛋白因子將cos區(qū)切開，從而保證只有一個DNA 線狀分子被包裝，每個宿主細胞可包裝多達100個成熟的-DNA分子。包裝與DNA本身的性質(zhì)無關(guān)，但對其大小要求比較嚴格，它只能包裝-DNA分子的75%-105%，也就是說可以包裝范圍內(nèi)的DNA，包裝好了的-DNA便形成成熟的噬菌體顆粒。裂解每個細胞內(nèi)容納了多達100個成熟的噬菌體，這時兩種負責裂解宿主細胞的蛋白被合成，細菌細胞被裂解，成熟的噬菌體釋放出去，又去感染另外的宿主細胞，直至大腸桿菌細胞全部被裂解

16、。 Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage protein coat can be performed using a mixed lysate of two mutated lysogens. Normal in vivo packaging of DNA involves first making pre-heads, structures composed of the major capsid protein encoded by gene E. A unit length of DNA is inserted in the pre

17、-head, the unit length being prepared by cleavage at neighboring cos sites. A minor capsid protein D is then inserted in the pre-heads to complete head maturation, and the products of other genes serve as assembly proteins, ensuring joining of the completed tails to the completed heads. A defect in

18、producing protein E, resulting from an amber mutation introduced into gene E (Eam), prevents pre-heads being formed by BHB2688. An amber mutation in gene D (Dam) prevents maturation of the pre-heads, with enclosed DNA, into complete heads. The components of the BHB2688/BHB2690 mixed lysate, however,

19、 complement each others deficiency and provide all the products for correct packaging. Some of the gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells. 噬菌體生活周期的決定噬菌體: 溶原周期；裂解周期 prophage stateLytic statecI激活自身的表達；關(guān)閉cro基因的表達；多數(shù)基不因表達Cro激活自身的表達;關(guān)閉cI基因；多數(shù)基因表達In normally

20、growing host cells, the lysogenic state is favored and the genome replicates along with the host chromosomal DNA.cells favors Damage to host a transition to the lytic cycle, enabling the virus to escape the damaged cell and infect new cellsThe decision to enter the lytic cycle or the lysogenic state

21、 is controlled by two regulatory genes, cI and cro. DNA載體載體的應用得益于體外包裝系統(tǒng)J基因到N基因之間的DNA序列對噬菌體的生長不是絕對必需的 ，可以缺失或被外源基因取代，P基因與Q基因之間的序列缺失也仍然可以作為噬菌體使用。插入型載體 經(jīng)改造后的長度為37 kb，為包裝的下限，它本身也能被包裝，其允許的插入片段最大為（）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標記基因。Insertion vectorsLambda vectors used for making cDNA libraries do not require a large insert capacity (most cDNAs are 300 kb). The resulting recombinants can be transferred with considerable efficien