附錄ⅩⅢ C 微生物限度檢查法

1、.：.；附錄 C 微生物限制檢查法微生物限制檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、 輔料受微生物污染程度的方法。檢查工程包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。 微生物限制檢查應在環(huán)境干凈度 10000 級下的部分干凈度 100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進展。檢驗全過程必需嚴厲遵守無菌操作， 防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。 單向流空氣區(qū)域、任務臺面及環(huán)境應定期按的現(xiàn)行國家規(guī)范進展干凈度驗證。 供試品檢查時， 假設運用了外表活性劑、 中和劑或滅活劑， 應證明其有效性及對微生物無毒性。 除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培育溫度為 3035；霉菌、酵母菌培育溫度為 2328

2、。 檢驗結(jié)果以 1g、 1ml、 10g、 10ml 或10c為單位報告， 特殊種類可以最小包裝單位報告。 檢驗量檢驗量即一次實驗所用的供試品量g、ml 或 cm2 。除另有規(guī)定外，普通供試品的檢驗量為 10g 或 10ml；膜劑為 100 cm2；貴重藥品、 微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。 要求檢查沙門菌的供試品， 其檢驗量應添加 20g 或 20ml其中 10g或10ml 用于陽性對照實驗。 檢驗時，應從 2 個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于 4丸，膜劑還不得少于 4 片。 普通應隨機抽取不少于檢驗用量兩個以上最小包裝單位的 3 倍量供試品。 供試品溶液的制備 根據(jù)供試品的

3、理化特性與生物學特性， 采取適宜的方法制備供試液。供試液制備假設需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超越 45。供試液從制備至參與檢驗用培育基，不得超越 1 小時。 除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。 1.液體供試品 取供試品 10ml，加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml，混勻，作為110 的供試液。油劑可參與適量的無菌聚山梨酯 80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 2.固體、半固體或黏稠性供試品 取供試品 10g， 加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml， 用勻漿儀或其 他適宜的方法， 混勻， 作為 110 的供試液。

4、 必要時加適量的無菌聚山梨酯 80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。 3.需用特殊方法制備供試液的供試品 (1)非水溶性供試品 方法 1 取供試品 5g或 5ml， 加至含溶化的溫度不超越 45 5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，漸漸參與 45的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為 120 的供試液。 方法 2 取供試品 10g， 加至含 20ml 無菌十四烷酸異丙酯制法見附錄 B 無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下 和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可添加十四烷酸異丙酯的用量

5、，充分振搖，使供試品溶解。 然后參與 45的 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 100ml，振搖 510 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為 110 的供試液。 (2)膜劑供試品 取供試品 100cm2 ，剪碎，加 100ml 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液必要時可添加稀釋液，浸泡，振搖，作為 110 的供試液。 (3)腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品 10g， 加 pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液用于腸溶制劑 或 pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液用于結(jié)腸溶制劑 至 100ml， 置 45水浴中， 振搖， 使溶解， 作為 110 的供試液。 (4)氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供

6、試品， 置冰凍室冷凍約 1 小時， 取出， 迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔， 放至室溫， 并悄然轉(zhuǎn)動容器， 使拋射劑漸漸全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖 液假設含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯 80中，混勻，取相當于 10g或 10ml 的供試品，再稀釋成 110 的供試液。 (5)貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品， 去掉貼膏劑的維護層， 放置在無菌玻璃或塑料片上， 粘貼面朝上。 用適宜的無菌多孔資料如無菌紗布 覆蓋貼劑的粘貼面以防止貼劑粘貼在一同。 然后將其置于適宜體積并含有外表活性劑如聚山梨酯 80 或卵磷脂的稀釋劑中，

7、用力振蕩至少 30 分鐘，制成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。 (6)具抑菌活性的供試品 當供試品有抑菌活性時， 采用以下方法進展處置， 以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。 培育基稀釋法 取規(guī)定量的供試液， 至較大量的培育基中， 使單位體積內(nèi)的供試品含量減少， 至不含抑菌作用。 測定細菌、 霉菌及酵母菌的菌數(shù)時， 取同稀釋級的供試液 2ml， 每 1ml 供試液可等量分注多個平皿， 傾注瓊脂培育基， 混勻，凝固，培育，計數(shù)。每 1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為 1ml的菌落數(shù)， 計算每 1ml 供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計數(shù)規(guī)那么報告菌數(shù)； 控

8、制菌檢查時，可加大增菌培育基的用量。 離心沉淀法 取一定量的供試液， 500 轉(zhuǎn)/分別心 3 分鐘，取全部上清液混合，用于細菌檢查。 薄膜過濾法 見細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)項下的“薄膜過濾法。 中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培育基中。 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 計數(shù)培育基的適用性檢查 細菌、 霉菌及酵母菌計數(shù)用的培育基應進展培育基的適用性檢查， 廢品培育基、由脫水培育基或按培育基處方配制的培育基均應檢查。 菌種 實驗用菌株的傳代次數(shù)不得超越 5 代從菌種保管中心獲得的冷凍枯燥菌種為第 0 代。并采用適宜的

9、菌種保藏技術(shù)進展保管，以保證實驗菌株的生物學特性。 大腸埃希菌Escherichia coliCMCCB 44 102 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCCB 26 003 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCMCCB 63 501 白色念珠菌Candida albicansCMCCF 98 001 黑曲霉Aspergillus nigerCMCCF 98 003 菌液制備 接種大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌的新穎培育物至營養(yǎng)肉湯培育基或營養(yǎng)瓊脂培育基中，培育 1824 小時；接種白色念珠菌的新穎培育物至改良馬丁培育基或改良馬丁瓊脂培育基中

10、，培育 2448 小時。上述培育物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新穎培育物至改良馬丁瓊脂斜面培育基中，培育 57 天，參與 35ml 含 0.05ml/ml 聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。 然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)， 用含 0.05ml/ml 聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含孢子數(shù) 50100cfu 的孢子懸液。 菌液制備后假設在室溫下放置，應在 2 小時內(nèi)運用， 假設保管在 28可在 24 小時內(nèi)運用。黑曲霉孢子懸液可保管在 28，在驗證過的儲存期內(nèi)運用。 適

11、用性檢查 取大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌各 50100cfu，分別注入無菌平皿中， 立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培育基， 每株實驗菌平行制備 2 個平皿，混勻， 凝固， 置 3035培育48 小時， 計數(shù)； 取白色念珠菌、黑曲霉各 50100cfu，分別注入無菌平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培育基，每株實驗菌平行制備 2個平皿， 混勻， 凝固， 置 2328培育 72 小時， 計數(shù)； 取白色念珠菌 50100cfu，注入無菌平皿中， 立刻傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基， 平行制備 2 個平皿，混勻， 凝固， 置 2328培育 72 小時， 計數(shù)。 同時， 用相應的對照培育基替代被檢培育基進

12、展上述實驗。 結(jié)果斷定 假設被檢培育基上的菌落平均數(shù)不小于對照培育基上的菌落平均數(shù)的 70%， 且菌落形狀大小應與對照培育基上的菌落一致。 判該培育基的適用性檢查符合規(guī)定。 計數(shù)方法的驗證 當建立產(chǎn)品的微生物限制檢查法時， 應進展細菌、 霉菌及酵母菌計數(shù)方法的 驗證， 以確認所采用的方法適宜于該產(chǎn)品的細菌、 霉菌及酵母菌數(shù)的測定。 假設產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改動能夠影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應重新驗證。 驗證時， 按供試液的制備和細菌、 霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及以下要求進展。對各實驗菌的回收率應逐一進展驗證。 菌種及菌液制備 同計數(shù)培育基的適用性檢查 驗證方法 驗證實驗至少應進展 3

13、次獨立的平行實驗，并分別計算各實驗菌每次實驗的回收率。 1 實驗組 平皿法計數(shù)時， 取實驗能夠用的最低稀釋級供試液 1ml 和 50100cfu 實驗菌， 分別注入平皿中， 立刻傾注瓊脂培育基， 每株實驗菌平行制備 2個平皿， 按平皿法測定其菌數(shù)。 薄膜過濾法計數(shù)時， 取規(guī)定量實驗能夠用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中參與 50100cfu 實驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 2菌液組 測定所加的實驗菌數(shù)。 3供試品對照組 取規(guī)定量供試液， 按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。 4稀釋劑對照組 假設供試液制備需求分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處置時， 應添加稀釋劑

14、對照組， 以調(diào)查供試液制備過程中微生物受影響的程度。 實驗時， 可用相應的稀釋液替代供試品， 參與實驗菌， 使最終菌濃度為每1ml 供試液含 50100cfu，按實驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。 結(jié)果判別 在 3 次獨立的平行實驗中， 稀釋劑對照組的菌回收率稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率應均不低于 70%。假設實驗組的菌數(shù)回收率實驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率均不低于 70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；假設任一次實驗中實驗組的菌回收率低于 70%，應采用培育基稀釋法、離心沉淀法

15、、薄膜過濾法、中和法常見干擾物的中和劑或滅活方法見表 1等方法或結(jié)合運用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進展方法驗證。 表 1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫納 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物QACs、 卵磷脂、聚山梨酯 對羥基苯甲酸酯汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰類 聚山梨酯 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸EDTA 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 -內(nèi)酰胺類抗生素 -內(nèi)酰胺酶 假設沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證實驗中微生物回收

16、的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時闡明該供試品不能被實驗菌污染。 但是，供試品也能夠僅對實驗用菌株具有抑制造用， 而對其他菌株沒有抑制造用。 因此， 根據(jù)供試品須符合的微生物限制規(guī)范和菌數(shù)報告規(guī)那么， 在不影響檢驗結(jié)果判別的前提下， 應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進展方法驗證實驗。 假設驗證實驗符合要求， 應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進展供試品檢驗。 計數(shù)方法驗證時， 采用上述方法假設還存在一株或多株實驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和實驗條件進展供試品的檢驗。 驗證實驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進展。 供試品檢查 計數(shù)方法

17、包括平皿法和薄膜過濾法。 檢查時， 按已驗證的計數(shù)方法進展供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。 按計數(shù)方法的驗證實驗確認的程序進展供試液制備。用稀釋液稀釋成 110、1102 、110 3等稀釋級的供試液。 1.平皿法 根據(jù)菌數(shù)報告法規(guī)那么取相應稀釋級的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中，注入 1520ml 溫度不超越 45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培育基或玫瑰紅鈉瓊脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基，混勻，凝固，倒置培育。每稀釋級每種培育基至少制備 2 個平板。 陰性對照實驗 取實驗用的稀釋液 1ml， 置無菌平皿中， 注入培育基， 凝固，倒置培育。每種計數(shù)用的培育基各制備 2 個平

18、板，均不得有菌生長。 培育和計數(shù) 除另有規(guī)定外， 細菌培育 3 天， 霉菌、 酵母菌培育 5 天。 逐日察看菌落生長情況； 點計菌落數(shù)。 必要時， 可適當延伸培育時間至 7 天進展菌落計數(shù)并報告。 菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。 點計菌落數(shù)后， 計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)， 按菌數(shù)報告規(guī)那么報告菌數(shù)。 假設同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于 15，那么兩個平板的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。 普通營養(yǎng)瓊脂培育基用于細菌計數(shù)； 玫瑰紅鈉瓊脂培育基用于霉菌及酵母菌計數(shù)； 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基用于酵母菌計數(shù)。 在特殊情況下， 假設營養(yǎng)瓊脂培育基上長有霉菌和酵母菌、 玫瑰紅鈉瓊脂培育基上

19、長有細菌， 那么應分別點計霉菌和酵母菌、 細菌菌落數(shù)。 然后將營養(yǎng)瓊脂培育基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培育基上的細菌數(shù)， 與玫瑰紅鈉瓊脂培育基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培育基中的細菌數(shù)進展比較，以菌落數(shù)高的培育基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。 含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培育基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。 菌數(shù)報告規(guī)那么 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu、 霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報告取兩位有效數(shù)字的根據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告 1g、1mL 或 102cm 供試品中所含的菌數(shù)。 如各

20、稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于 1 時，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 2.薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大于 0.45m，直徑普通為 50mm， 假設采用其它直徑的濾膜， 沖洗量應進展相應的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜運用前應采用適宜的方法滅菌。 運用時， 應保證濾膜在過濾前后的完好性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在運用前應充分枯燥。為發(fā)揚濾膜的最大過濾效率， 應留意堅持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜外表。供試液經(jīng)薄膜過濾后， 假設需求用

21、沖洗液沖洗濾膜， 每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超越1000ml，以防止濾膜上的微生物受損傷。 取相當于每張濾膜含 1g、 1ml 或 10cm2 供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾；假設供試品每 1g、1ml 或 10 cm2 所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液 1ml 進展實驗。用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培育基或玫瑰紅鈉瓊脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基平板上培育。每種培育基至少制備一張濾膜。 陰性對照實驗 取實驗用的稀釋液 1ml 照上述

22、薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。 培育和計數(shù) 培育條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應不超越100 cfu。 菌數(shù)報告規(guī)那么 以相當于 1g、 1ml 或 10 cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；假設濾膜上無菌落生長，以1報告菌數(shù)每張濾膜過濾1g、 1ml 或 10 cm2供試品，或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 控制菌檢查 控制菌檢查用培育基的適用性檢查控制菌檢查用的培育基應進展培育基的適用性檢查， 廢品培育基、由脫水培育基或按培育基處方配制的培育基均應檢查。 菌種 對實驗菌種的要求同計數(shù)培育基的適用性檢查。 大腸埃希菌Escherichia coliCMCCB

23、44 102 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCCB 26 003 乙型副傷寒沙門菌Salmonella paratyphi BCMCCB 50 094 銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCCB 10 104 生孢梭菌Clostridium sporogenesCMCCB 64 941 白色念珠菌Candida albicansCMCCF 98 001 菌液制備 接種大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌、 乙型副傷寒沙門菌、 銅綠假單胞菌的新穎培育物至營養(yǎng)肉湯培育基中或營養(yǎng)瓊脂培育基上， 生孢梭菌的新穎培育物至硫乙醇酸鹽流體培育基中，培育 1824

24、 小時；接種白色念珠菌的新穎培育物至改良馬丁培育基或改良馬丁瓊脂培育基中， 培育 2448 小時。 用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 10100cfu 的菌懸液。 菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)運用， 假設保管在 28可在 24 小時內(nèi)運用。 適用性檢查 控制菌檢查用培育基的適用性檢查工程包括促生長才干、抑制才干及指示才干的檢查。各培育基的檢測工程及所用菌株見表 2 。 液體培育基促生長才干檢查 分別接種不大于100cfu 的實驗菌表 2于被檢培育基和對照培育基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培育溫度及最短培育時間下培育。與對照培育基管比較，被檢培育基管實驗菌應生長良好。 固體培育

25、基促生長才干檢查 取實驗菌各 0.1ml含菌數(shù) 50100cfu分別涂布于被檢培育基和對照培育基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培育溫度及最短培育時間下培育。被檢培育基與對照培育基生長的菌落大小、形狀特征應一致。 培育基抑制才干檢查 接種不少于 100cfu 的實驗菌表 2于被檢培育基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培育溫度及最長時間下培育，實驗菌應不得生長。 固體培育基指示才干檢查 取實驗菌各 0.1ml含菌數(shù)不大于100cfu表 2分別涂布于被檢培育基和對照培育基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培育溫度及時間下培育。被檢培育基上實驗菌生長的菌落大小、形狀特征、指示劑反響情況等應與對照培育基一致。 液

26、體培育基指示才干檢查 分別接種不大于 100cfu 的實驗菌表 2于被檢培育基和對照培育基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培育溫度及最短培育時間下培育。與對照培育基管比較，被檢培育基管實驗菌生長情況、指示劑反響等應與對照培育基一致。 控制菌檢查方法的驗證 當建立藥品的微生物限制檢查法時，應進展控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適宜于該藥品的控制菌檢查。假設藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改動能夠影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應重新驗證。 驗證時， 依各種類項下微生物限制規(guī)范中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證實驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及

27、以下要求進展。 菌種及菌液制備 同控制菌檢查用培育基的適用性檢查 驗證方法 取規(guī)定量供試液及10100cfu 實驗菌參與增菌培育基中，依相應控制菌檢查法進展檢查。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，實驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培育基或取出濾膜接入增菌培育基中。 表 2 控制菌檢查用培育基的促生長才干、抑制才干及指示才干檢查 控制菌檢查 培育基特性實驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培育基 4-甲基傘形酮葡糖苷酸培育基曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂培育基 促生長才干抑制才干促生長才干+指示才干促生長才干+指示才干 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌大腸埃希菌大腸菌群 乳糖膽鹽發(fā)酵

28、培育基乳糖發(fā)酵培育基曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂培育基促生長才干 抑制才干促生長才干+指示才干促生長才干+指示才干大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌大腸埃希菌沙門菌營養(yǎng)肉湯培育基四硫磺酸鈉亮綠培育基膽鹽硫乳瓊脂培育基或沙門、志賀菌屬瓊脂培育基 曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂培育基三糖鐵瓊脂培育基促生長才干促生長才干抑制才干促生長才干+指示才干 促生長才干+指示才干指示才干乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培育基溴化十六烷基三甲銨瓊脂培育基綠膿菌素測定用培育基促生長才干抑制才干促生長才干抑制才干促生長才干+指示才干銅綠假單

29、胞菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培育基卵黃氯化鈉瓊脂培育基或甘露醇氯化鈉瓊脂培育基促生長才干抑制才干促生長才干+指示才干抑制才干金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培育基哥倫比亞瓊脂培育基促生長才干促生長才干生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培育基沙氏葡萄糖瓊脂培育基念珠菌顯色培育基1%聚山梨脂80-玉米瓊脂培育基促生長才干促生長才干+指示才干促生長才干+指示才干抑制才干促生長才干+指示才干白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌白色念珠菌結(jié)果判別 假設上述實驗檢出實驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進展供試品的該控制菌檢查；

30、假設未檢出實驗菌， 應采用培育基稀釋法、 離心沉淀集菌法、 薄膜過濾法、 中和法等方法或結(jié)合運用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進展方法驗證。 驗證實驗也可與供試品的控制菌檢查同時進展。 供試品檢查 供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進展。 陽性對照實驗 陽性對照實驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量為 10100cfu，陽性對照實驗應檢出相應的控制菌。 陰性對照實驗 取稀釋液 10ml 照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。 1 大腸埃希菌Escherichia coli 取供試液 10ml相當于供試品 1g、1ml、10cm ，直接或處置后接種至適量不少于 1

31、00ml的膽鹽乳糖培育基中，培育 1824 小時，必要時可延伸至 48 小時。 取上述培育物 0.2ml， 接種至含 5ml MUG 培育基的試管內(nèi)， 培育， 于 5 小時、24 小時在 366nm 紫外線下察看，同時用未接種的 MUG 培育基作本底對照。假設管內(nèi)培育物呈現(xiàn)熒光， 為 MUG 陽性； 不呈現(xiàn)熒光， 為 MUG 陰性。 察看后， 沿培育管的管壁參與數(shù)滴靛基質(zhì)試液， 液面呈玫瑰紅色， 為靛基質(zhì)陽性； 呈試劑本性， 為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為 MUG 陰性和靛基質(zhì)陰性。 如 MUG 陽性、 靛基質(zhì)陽性， 判供試品檢出大腸埃希菌； 如 MUG 陰性、 靛基質(zhì)陰性， 判供試品未檢出大腸埃

32、希菌； 如 MUG 陽性、 靛基質(zhì)陰性， 或 MUG 陰性、 靛基質(zhì)陽性， 那么應取膽鹽乳糖培育基的培育物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培育基或麥康凱瓊脂培育基的平板上，培育 1824 小時。 假設平板上無菌落生長、 或生長的菌落與表 3 所列的菌落形狀特征不符， 判供試品未檢出大腸埃希菌。 假設平板上生長的菌落與表 3 所列的菌落形狀特征相符或疑似， 應進展分別、 純化、 染色鏡檢和適宜的鑒定實驗， 確認能否為大腸埃希菌。 表 3 大腸埃希菌菌落形狀特征 培 養(yǎng) 基 菌 落 形 態(tài) 曙紅亞甲藍瓊脂 呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，外表光滑

33、， 潮濕，常有金屬光澤麥康凱瓊脂 鮮桃紅色或微紅色， 菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，外表光滑，潮濕 2大腸菌群Coliform 取含適量不少于 10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培 養(yǎng)基管 3 支，分別參與 110 的供試液 1ml含供試品 0.1g 或 0.1ml、1100的供試液 1ml含供試品 0.01g 或 0.01ml、11000 的供試液 1ml含供試品0.001g 或 0.001ml，另取 1 支乳糖膽鹽發(fā)酵培育基管參與稀釋液 1ml 作為陰性對看管。培育 1824 小時。 乳糖膽鹽發(fā)酵管假設無菌生長、 或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 判該管未檢出大腸菌群； 假設產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 應將發(fā)酵管

34、中的培育物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培育基或麥康凱瓊脂培育基的平板上，培育 1824 小時。 假設平板上無菌落生長， 或生長的菌落與表 4 所列的菌落形狀特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌， 判該管未檢出大腸菌群； 假設平板上生長的菌落與表 4 所列的菌落形狀特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應進展確證實驗。 表 4 大腸菌群菌落形狀特征 培育基菌藥形狀曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，外表光滑，潮濕麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，外表光滑，潮濕確證實驗 從上述分別平板上挑選 45 個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培育

35、 2448 小時。假設產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否那么判未檢出大腸菌群。 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表 5 報告 1g 或 1ml 供試品中的大腸菌群數(shù)。 表 5 能夠的大腸菌群數(shù)表 各供試品量的檢出結(jié)果能夠的大腸菌群數(shù) N個/g或ml0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+103+-102N103+-10N102-10注：+代表檢出大腸菌群；-代表未檢出大腸菌群。3沙門菌Salmonella 取供試品 10g 或 10ml，直接或處置后接種至適量不少于 200ml 的營養(yǎng)肉湯培育基中， 用勻漿儀或其他適宜方法混勻， 培育 1824 小時。 取

36、上述培育物 1ml， 接種于 10ml 四硫磺酸鈉亮綠培育基中， 培育 1824 小時后， 分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂或沙門、 志賀菌屬瓊脂 培育基和麥康凱瓊脂或曙紅亞甲藍瓊脂培育基的平板上，培育 1824 小時必要時延伸至4048 小時。 假設平板上無菌落生長， 或生長的菌落不同于表 6 所列的特征， 判供試品未檢出沙門菌。 假設平板上生長的菌落與表 6 所列的菌落形狀特征相符或疑似， 用接種針挑選23 個菌落分別于三糖鐵瓊脂培育基高層斜面上進展斜面和高層穿刺接種，培育 1824 小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。 否那么， 應取三糖鐵瓊脂培育

37、基斜面的培育物進展適宜的鑒定實驗，確認能否為沙門菌。 表 6 沙門菌菌落形狀特征 培育基 菌落形狀膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或 無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑潮濕的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色4銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa 取供試液 10ml相當于供試品 1g、1ml、10cm ，直接或處置后接種至適量不少于 100ml的膽鹽乳糖培育基中，培育 1824 小時。取上述培育物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培育基

38、的平板上，培育 1824 小時。 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、 無定形、 周邊分散、 外表潮濕， 灰白色， 周圍時有藍綠色素分散。 如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形狀特征不符， 判供試品未檢出銅綠假單胞菌。 如平板生長的菌落與上述菌落形狀特征相符或疑似， 應挑選 23 個菌落， 分別接種于營養(yǎng)瓊脂培育基斜面上， 培育 1824小時。取斜面培育物進展革蘭染色、鏡檢及氧化酶實驗。 氧化酶實驗 取干凈濾紙片置于平皿內(nèi)， 用無菌玻棒取斜面培育物涂于濾紙片上，滴加新配制的 1二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在 30 秒內(nèi)假設培育物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶實驗陽性，否那么為陰性。 假設斜面培育

39、物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶實驗陰性， 均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否那么，應進展綠膿菌素實驗。 綠膿菌素Pyocyanin 實驗 取斜面培育物接種于 PDP 瓊脂培育基斜面上，培育 24 小時， 加三氯甲烷 35ml 至培育管中， 攪碎培育基并充分振搖。 靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，參與 1mol/L 鹽酸試液約 1ml，振搖后，靜置片刻， 察看。 假設鹽酸溶液呈粉紅色， 為綠膿菌素實驗陽性， 否那么為陰性。 同時用未接種的 PDP 瓊脂培育基斜面同法作陰性對照，陰性對照實驗應呈陰性。 假設上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、 氧化酶實驗陽性及綠膿菌素實驗陽性， 判供試品檢出銅綠假單胞

40、菌。 假設上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、 氧化酶實驗陽性及綠膿菌素實驗陰性，應繼續(xù)進展適宜的鑒定實驗，確認能否為銅綠假單胞菌。 5金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 取供試液 10ml相當于供試品 1g、1ml、10cm ，直接或處置后接種至適量不少于 100ml的亞碲酸鈉鉀 肉湯或營養(yǎng)肉湯 培育基中， 培育 1824 小時， 必要時可延伸至 48小時。 取上述培育物， 劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培育基或甘露醇氯化鈉瓊脂培育基的平板上， 培育 2472 小時。假設平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表 7所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 表 7 金黃色葡萄球菌菌落形狀特征

41、 琣養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色， 圓形凸起， 邊緣整齊， 外圍有黃色環(huán)， 菌落直徑 0.71mm 卵黃氯化鈉瓊脂金黃色， 圓形凸起， 邊緣整齊， 外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑 12mm假設平板上生長的菌落與表 7 所列的菌落特征相符或疑似，應挑選 23 個菌落， 分別接種于營養(yǎng)瓊脂培育基斜面上， 培育 1824 小時。 取營養(yǎng)瓊脂培育基的培育物進展革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培育基中，培育 1824 小時，作血漿凝固酶實驗。 血漿凝固酶實驗 取滅菌小試管 3 支，各參與血漿和無菌水混合液110.5ml，再分別參與可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培育物或由營養(yǎng)瓊脂培育基斜面培育物制備的濃菌懸

42、液0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培育物或由營養(yǎng)瓊脂培育基斜面培育物制備的濃菌懸液 0.5ml、營養(yǎng)肉湯或 0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為實驗管、陽性對看管和陰性對看管。將 3 管同時培育，3 小時后開場察看直至 24 小時。陰性對看管的血漿應流動自若，陽性對看管血漿應凝固，假設實驗管血漿凝固者為血漿凝固酶實驗陽性， 否那么為陰性。 如陽性對看管或陰性對看管不符合規(guī)定時，應另制備血漿，重新實驗。 假設上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、 血漿凝固酶實驗陰性， 判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 6梭菌Clostridium 取供試液 10ml相當于供試品 1g、1ml2 份，其中 1 份置 80

43、保溫 10 分鐘后迅速冷卻。 上述 2 份供試液直接或處置后分別接種至 100ml 的梭菌增菌培育基中，置厭氧條件下培育 48 小時。取上述每一培育物 0.2ml， 分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培育基平板上， 置厭氧條件下培育 4872 小時。假設平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；假設平板上有菌落生長，應挑選 23 個菌落分別進展革蘭染色和過氧化氫酶實驗。 過氧化氫酶實驗 取上述平板上的菌落，置干凈玻片上，滴加 3%過氧化氫試液，假設菌落外表有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶實驗陽性，否那么為陰性。 假設上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌， 有或無卵圓形或球形的芽孢， 過氧化氫酶陰性，判供試品檢出

44、梭菌，否那么判供試品未檢出梭菌。 7白色念珠菌Candida albicans 取供試液 10ml相當于供試品 1g、1ml、10cm 直接或處置后接種至適量不少于 100ml的沙氏葡萄糖肉湯培育基中，培育 4872 小時。取上述培育物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板上，培育 2448 小時必要時延伸至 72 小時。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培育基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色， 外表光滑有濃酵母氣味， 培育時間稍久那么菌落增大， 顏色變深、 質(zhì)地變硬或有皺摺。假設平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形狀特征不符， 判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形狀特征相符或疑似

45、，應挑選 23個菌落分別接種至念珠菌顯色培育基平板上，培育 2448 小時必要時延伸至 72 小時。假設平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。 假設平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于 1%聚山梨酯 80-玉米瓊脂培育基上，培育 2448 小時。取培育物進展染色，鏡檢及芽管實驗。 芽管實驗 挑取 1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培育基上的培育物， 接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置潮濕的平皿內(nèi)，置 3537、13 小時，置顯微鏡下察看孢子長出短小芽管。 假設上述疑似菌為非革蘭陽性菌， 顯微鏡未見厚膜孢子、 假菌絲、 芽管， 判供試品未檢出白色念珠菌

46、。 結(jié)果判別 供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再復試。 供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該種類項下的規(guī)定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試兩次，以 3 次結(jié)果的平均值報告菌數(shù)。 假設供試品的細菌數(shù)、 霉菌和酵母菌數(shù)、 控制菌三項檢驗結(jié)果均符合該種類項下的規(guī)定， 判供試品符合規(guī)定； 假設其中任何一項不符合該種類項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。 稀釋液 稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。 1.pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 照無菌檢查法附錄 B)制備。 2.pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液 按緩沖液附錄 D配制后，過

47、濾，分裝，滅菌。 如需求，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后參與外表活性劑或中和劑等。 3. 0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉 9.0g，加水溶解使成 1000ml，過濾，分裝、滅菌。 培育基及其制備方法 培育基可按以下處方制備，也可運用按該處方消費的符合要求的脫水培育基。配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。 1.營養(yǎng)瓊脂培育基、營養(yǎng)肉湯培育基、硫乙醇酸鹽流體培育基、改良馬丁培育基及改良馬丁瓊脂培育基 照無菌檢查法附錄 B制備。 2.玫瑰紅鈉瓊脂培育基 胨 5.0g 玫瑰紅鈉 0.0133g 葡萄糖 10.0g 瓊脂 14.0g 磷酸二氫鉀 1.0g 水 1000ml 硫酸鎂 0.5g 除葡萄糖、

48、 玫瑰紅鈉外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 濾過， 參與葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。 3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培育基YPD 胨 10.0g 瓊脂 14.0g 酵母浸出粉 5.0g 水 1000ml 葡萄糖 20.0g 除葡萄糖外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 濾過， 參與葡萄糖， 分裝， 滅菌。 4.膽鹽乳糖培育基BL 胨 20.0g 磷酸二氫鉀 1.3g 乳糖 5.0g 牛膽鹽 2.0g 氯化鈉 5.0g 或去氧膽酸鈉 0.5g 磷酸氫二鉀 4.0g 水 1000ml 除乳糖、 牛膽鹽或去氧膽酸鈉 外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 調(diào)理pH 值使滅菌后為 7.40.2，

49、煮沸，濾清，參與乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。 5.乳糖膽鹽發(fā)酵培育基 蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25ml 乳糖 10.0g 水 1000ml 牛膽鹽 5.0g 除 0.04%溴甲酚紫水溶液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使 滅菌后為 7.40.2， 參與 0.04%溴甲酚紫指示液， 根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規(guī)格應保證產(chǎn)氣結(jié)果的察看。 6.曙紅亞甲藍瓊脂培育基EMB 營養(yǎng)瓊脂培育基 100ml 曙紅鈉指示液 2ml 20乳糖溶液 5ml 亞甲藍指示液 1.31.6ml 取營養(yǎng)瓊脂培育基， 加熱溶化后， 冷至 60， 按無菌操

50、作參與滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。 7.麥康凱瓊脂培育基MacC 胨 20.0g 1% 中性紅指示液 3ml 乳糖 10.0g 瓊脂 14.0g 牛膽鹽 5.0g 水 1000ml 氯化鈉 5.0g 除乳糖、1%中性指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.20.2，參與瓊脂，加熱溶化后，再參與其他各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約 60，傾注平皿。 8.4-甲基傘形酮葡糖苷酸4-methylumbelliferyl- -D-glucuronide，MUG培育基 胨 10.0g 磷酸二氫鉀無水 0.9g 硫酸錳 0.5mg 磷酸氫二鈉無水 6.2

51、g 硫酸鋅 0.5mg 亞硫酸鈉 40mg 硫酸鎂 0.1g 去氧膽酸鈉 1.0g 氯化鈉 5.0g MUG 7 5mg 氯化鈣 50mg 水 1000ml 除 MUG 外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.30.1，參與 MUG，溶解，每管分裝 5ml，滅菌。 9.三糖鐵瓊脂培育基TSI 胨 20.0g 硫酸亞鐵 0.2g 牛肉浸出粉 5.0g 硫代硫酸鈉 0.2g 乳糖 10.0g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10.0g 瓊脂 12.0g 葡萄糖 1.0g 水 1000ml 氯化鈉 5.0g 除三種糖、 0.2%酚磺酞指示液、 瓊脂外， 取上述

52、成分， 混合， 微溫溶解， 調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.30.1， 參與瓊脂， 加熱溶化后， 再參與其他各成分， 搖勻，分裝，滅菌，制成高底層23cm短斜面。 10.四硫磺酸鈉亮綠培育基TTB 胨 5.0g 硫代硫酸鈉 30.0g 牛膽鹽 1.0g 水 1000ml 碳酸鈣 10.0g 取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。 臨用前，取上述培育基，每 10ml 參與碘試液 0.2ml 和亮綠試液 0.1ml，混勻。 11.沙門、志賀菌屬瓊脂培育基SS 胨 5.0g 硫代硫酸鈉 8.5g 牛肉浸出粉 5.0g 中性紅指示液 2.5ml 乳糖 10.0g 亮綠試液 0.33ml 牛膽鹽 8.5g 瓊

53、脂 16.0g 枸櫞酸鈉 8.5g 水 1000ml 枸櫞酸鐵銨 1.0g 除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH值使滅菌后為 7.20.1，濾過，參與瓊脂，加熱溶化后，再參與其他各成分，搖勻，滅菌，冷至 60，傾注平皿。 12.膽鹽硫乳瓊脂培育基DHL 胨 20.0g 枸櫞酸鈉 1.0g 牛肉浸出粉 3.0g 枸櫞酸鐵銨 1.0g 乳糖 10.0g 中性紅指示液 3ml 蔗糖 10.0g 瓊脂 16.0g 去氧膽酸鈉 1.0g 水 1000ml 硫代硫酸鈉 2.3g 除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.20.1，參與瓊

54、脂，加熱溶化后，再參與其他成分，搖勻，冷至 60，傾注平皿。 13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培育基 胨 10.0g 溴化十六烷基三甲銨 0.3g 牛肉浸出粉 3.0g 瓊脂 14.0g 氯化鈉 5.0g 水 1000ml 除瓊脂外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.50.1，參與瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至 60，傾注平皿。 14.亞碲酸鹽肉湯培育基 臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培育基，每 100ml 中參與新配制的 1%亞碲酸鈉鉀試液 0.2ml，混勻，即得。 15.卵黃氯化鈉瓊脂培育基 胨 6.0g 10%氯化鈉卵黃液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 瓊脂

55、 14.0g 氯化鈉 30.0g 水 650ml 除 10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.60.1，滅菌，待冷至約 60，以無菌操作參與 10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。 10%氯化鈉卵黃液的制備取新穎雞蛋 1 個，以無菌操作取出卵黃，放入 10%無菌氯化鈉溶液 100ml 中，充分振搖，即得。 16.甘露醇氯化鈉瓊脂培育基 胨 10.0g 酚磺酞指示液 2.5ml 牛肉浸出粉 1.0g 瓊脂 14.0g 甘露醇 10.0g 水 1000ml 氯化鈉 75.0g 除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理pH 值使滅菌后

56、為 7.40.2，參與瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至 60，傾注平皿。 17.乳糖發(fā)酵培育基 胨 20.0g 乳糖 10.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水 1000ml 除 0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.20.2，參與指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管 3ml。滅菌。 18.綠膿菌素Pyocyanin測定用培育基PDP 瓊脂培育基 胨 20.0g 甘油 10ml 氯化鎂無水 1.4g 瓊脂 14.0g 硫酸鉀無水 10.0g 水 1000ml 取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.30

57、.1，參與甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面。 19.梭菌增菌培育基 牛肉浸出粉 10.0g 鹽酸半胱氨酸 0.5g 胨 10.0g 氯化鈉 5.0g 酵母浸出粉 3.0g 醋酸鈉 3.0g 可溶淀粉 1.0g 瓊脂 0.5g 葡萄糖 5.0g 水 1000mL 取上述成分， 混合， 加熱煮沸使溶解， 調(diào)理 pH 值使滅菌后為 6.80.2， 加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。 20.哥倫比亞瓊脂培育基 酪蛋白胰酶消化物 10.0g 肉胃酶消化物 5.0g 心胰酶消化物 3.0g 酵母浸出粉 5.0g 玉米淀粉 1.0g 瓊脂 15.0g 瓊脂 15.0g 水 1000ml 除瓊脂外， 取上述成分， 混合， 微溫溶解， 調(diào)理 pH 值使滅菌后為 7.30.2，參與瓊脂， 加熱溶化， 濾過， 分裝， 滅菌， 冷至 4550， 參與相當于 20mg 慶大霉素的無菌硫酸慶大霉素，混勻，傾注平皿。 21. 沙氏葡萄糖液體培育基胨 10g 葡萄糖 40g 水 1000ml 除葡萄糖外。取上述成分，混