分析化學(xué)高效液相色譜法

1、關(guān)于分析化學(xué)高效液相色譜法第一張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高壓輸送流動(dòng)相，高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，現(xiàn)代液相色譜分析方法。第二張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與經(jīng)典液相色譜法相比 顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。 第三張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范

2、圍廣；可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。 第四張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型 和原理 一、主要類型 四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography）吸附色譜法（adsorption chromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）第五張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理 一、主要類型 四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography）吸附色譜法（

3、adsorption chromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法第六張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月其他色譜類型親合色譜法（affinity chromatography；AC）手性色譜法（chiral chromatography；CC）膠束色譜法（micellar chromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）第七張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、化學(xué)鍵合相色譜法 以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bonded phase chromatography；

4、BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相 第八張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過(guò)程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱第九張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）正相鍵合相色譜法 固定相：極性鍵合相如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） 流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與

5、水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì)第十張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正相鍵合相色譜法分離機(jī)制？ 分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解 吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用分離選擇性：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR 減小。第十一張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠 流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑 常用甲醇水、乙腈水等 應(yīng)用

6、：最廣 非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等） 第十二張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月保留機(jī)制 疏溶劑 （solvophobic theory）溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。第十三張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。 第十四張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、固定相 鍵合烷基的疏水性隨碳

7、鏈的延長(zhǎng)而增 加，溶質(zhì)的k也增大。 硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶 質(zhì)的k越大。 反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素第十五張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素3、流動(dòng)相 極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大 溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑 溶劑比例：水的比例增加，使k增大 中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大 pH：影響弱酸、弱減的離解 流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱堿k變小。第十六張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子抑制色譜法（ion suppression chromatography；ISC ）用少量弱酸、弱堿或緩

8、沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿反相鍵合相色譜法第十七張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子（counter ion）生成中性離子對(duì)，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。 （三）反相離子對(duì)色譜法 paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC第十八張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反相離子對(duì)色譜法離子對(duì)模型33+()+3s3(+固定相+()+

9、B)+B + H+BHRSONaRSO + Na+BHRSORSO)BH離子對(duì)mB+ABAmA(s流動(dòng)相通式第十九張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響容量因子的因素離子對(duì)試劑的種類和濃度：碳鏈長(zhǎng)度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大 流動(dòng)相的pH：有利于組分和離子對(duì)試劑離子化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的k值最大固定相 、流動(dòng)相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。 第二十張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三

10、甲基銨（CTAB）等。分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）。第二十一張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇第二十二張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月固定相應(yīng)符合下列要求：顆粒細(xì)且均勻；傳質(zhì)快；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。第二十三張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類 非極性鍵合相 ：非極性烴基，如C18C8C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載

11、樣量提高，穩(wěn)定性更好。第二十四張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 鍵合相的種類弱極性鍵合相： 醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜極性鍵合相：常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)鍵合硅膠一般用于正相色譜 特殊用途的鍵合相第二十五張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn) 鍵合反應(yīng) 硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng) 如：YWGC18H37，無(wú)定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅膠Spherisorb 上鍵合了ODS。 第二十六張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)鍵合相的

12、性質(zhì)含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù) 覆蓋度 ：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例 封尾（end-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基。 第二十七張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鍵合相的特點(diǎn)使用過(guò)程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大 注意：流動(dòng)相的pH一般應(yīng)在3-8，否則會(huì)引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。 鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)第二十八張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相 對(duì)流動(dòng)相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。對(duì)試樣有適宜的溶解度。使k在110范圍內(nèi)，與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，選

13、用截止波長(zhǎng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動(dòng)相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。 第二十九張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）流動(dòng)相對(duì)分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定，主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。 第三十張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）流動(dòng)相的強(qiáng)度和選擇性溶劑的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng) 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng) 溶劑的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 混合溶劑（二元或多元流動(dòng)相）第三十一張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、分離條件的選擇 （一）HPLC中的速率理論渦流擴(kuò)

14、散A=2dp 球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A?？v向擴(kuò)散=2Dm 可以忽略。 因?yàn)镈l很小，室溫操作，且U大于U最佳，第三十二張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HPLC中的速率理論傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略 ，因df極小流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm 要求： dp小，Dm大第三十三張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：由于部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流動(dòng)相都小HPLC中的速率理論第三十四張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月H =

15、A + Cmu + Csmu 原因：化學(xué)鍵合相，液體流動(dòng)相結(jié)果：HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是：小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；低粘度流動(dòng)相，流速不宜過(guò)快；柱溫適當(dāng)。 HPLC中的速率理論第三十五張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）正相鍵合相色譜法的分離條件 固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等流動(dòng)相烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑第三十六張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）反相鍵合相色譜法的分離條件固定相非極性鍵合相如ODS流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、 乙腈等極性調(diào)節(jié)劑弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑加入0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用 第三十七張，PPT共五十四頁(yè)

16、，創(chuàng)作于2022年6月（四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件 固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相，離子對(duì)試劑 離子對(duì)試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反 流動(dòng)相pH使試樣組分與離子對(duì)試劑全部離子化有機(jī)溶劑及其濃度 同一般HPLC 第三十八張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 第三十九張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動(dòng)相過(guò)程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。 有串聯(lián)式和并聯(lián)式第四十張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月輸液系統(tǒng)輸液泵應(yīng)

17、具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕 第四十一張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月輸液系統(tǒng)輸液泵操作注意事項(xiàng)：防止固體微粒進(jìn)入泵體流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完不超過(guò)規(guī)定的最高壓力流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣第四十二張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置色譜柱（column） 由柱管和固定相組成分析柱、制備柱 性能評(píng)價(jià) H、n、fs、k和的重復(fù)性，或R。 第四十三張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、檢測(cè)系統(tǒng)（一）檢測(cè)器(detector)的主要性能要求： 靈敏

18、度（sensitivity）高（檢測(cè)限低）噪音（noise）低 線性范圍（linear range）寬 重復(fù)性（repeatability）好 適用范圍廣（通用型、專屬型） 第四十四張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector) 檢測(cè)原理： 朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=Cl特點(diǎn)： 靈敏度較高（10-610-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。第四十五張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。 專屬型、濃度型檢測(cè)器第四十六張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月紫外檢測(cè)器固定波長(zhǎng)檢測(cè)器 ：254nm可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：光源：氘燈（和鎢燈）， 200400（800）nm， 單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似 光電二極管陣列檢測(cè)器 (photodiode array detector； PDAD)：一系列光電二極管，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光 第四十七張，PPT共五十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月紫外檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器工作原理：復(fù)光通