BMPbFGF生物活性材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究

1、BMP/bFGF生物活性質(zhì)料修復(fù)樞紐軟骨損傷的實(shí)行研究林佳聲，趙承斌，李華哲【摘要】目的探究骨形態(tài)產(chǎn)生卵白(bnerphgenetiprtEin,BP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basifibrblastgrthfatr,bFGF)生物質(zhì)料在樞紐軟骨缺損修復(fù)歷程中的作用,為內(nèi)源性修復(fù)樞紐軟骨缺損提供實(shí)行基矗要領(lǐng)取24只14齡成年明白兔隨機(jī)分成4組，每只動(dòng)物于雙側(cè)膝樞紐股骨臏股樞紐面制備直徑5全層樞紐軟骨缺損模子。鉆通骨髓腔。A組應(yīng)用BP/bFGF生物活性質(zhì)料，B組應(yīng)用BP生物活性質(zhì)料，組應(yīng)用bFGF生物活性質(zhì)料，D組單純應(yīng)用生物卵白膠質(zhì)料。于8、12、24周在大要，光鏡及電鏡下不雅察損傷修復(fù)結(jié)

2、果，構(gòu)造學(xué)評(píng)分。結(jié)果A組于8、12周時(shí)，軟骨缺損被白色半透明穩(wěn)固構(gòu)造平滑修復(fù)，富有光芒，24周時(shí)修復(fù)構(gòu)造正常軟骨界限模糊，毗連精細(xì)，質(zhì)地穩(wěn)固，外貌平滑光潤(rùn)。B、組于8、12、24周時(shí)間均未見(jiàn)軟骨缺損完全修復(fù)，界限清楚，中心凹陷顯著殘留。D組全程均未見(jiàn)軟骨修復(fù)。構(gòu)造學(xué)中分A組顯著優(yōu)于B、D組，而B(niǎo)、組之間無(wú)差異。結(jié)論BP/bFGF生物活性質(zhì)料可以有用修復(fù)兔大面積樞紐軟骨損傷，療效顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用骨形態(tài)產(chǎn)生卵白或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，為樞紐軟骨損傷治療提供新的治療要領(lǐng)?！娟P(guān)鍵詞】骨形態(tài)產(chǎn)生卵白；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；軟骨缺損；生物卵白Keyrds：bnerphgenetiprtein;fibr

3、blastgrthfatr;basidefetsfartilage;fibringlue樞紐軟骨缺損是臨床常見(jiàn)疾病，病人會(huì)出現(xiàn)樞紐疼痛及活動(dòng)停滯，終極引起骨性樞紐炎。樞紐軟骨缺損的修復(fù)是骨科研究的熱門(mén)。如今常用的是外源性修復(fù)要領(lǐng)，如鉆孔術(shù)、骨膜和軟骨膜移植、細(xì)胞移植、骨軟骨移植等，只管軟骨細(xì)胞移植在理論上更為有利，但按照國(guó)表里現(xiàn)實(shí)環(huán)境，自體軟骨細(xì)胞回植的治療要領(lǐng)在取材，造就，防范污染和經(jīng)費(fèi)方面都有困難，并且療效也并不美滿(mǎn)1。隨著分子生物學(xué)研究的希望，創(chuàng)造軟骨缺損的修復(fù)歷程是一個(gè)多種因子到場(chǎng)的龐大歷程。以是本研究基于臨床現(xiàn)實(shí)環(huán)境，使用有用生物活性質(zhì)料，為內(nèi)源性軟骨修復(fù)提供實(shí)行參考。1實(shí)行要領(lǐng)1.

4、1實(shí)行質(zhì)料14周齡哈爾濱明白兔24只，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)隸屬第一病院動(dòng)物實(shí)行中心提供；醫(yī)用生物卵白膠，廣州倍繡生物技能；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，美國(guó)invitrgen生物；牛自然骨形態(tài)產(chǎn)生卵白，天津中津生物生長(zhǎng)；戊巴比妥鈉，上?；瘜W(xué)試劑廠。1.2BP和bFGF生物卵白膠復(fù)合質(zhì)料的制備2溶解60g/l纖維卵白原(50000u/l和500g/l)1l，預(yù)備凝血酶原溶液(500u/l)1l。革新共推注射器，操縱其微量出液。纖維卵白原和凝血酶原組通過(guò)“Y形針頭混淆后立即成為固體狀態(tài)。30g骨形態(tài)產(chǎn)生卵白溶于2L4l/L鹽酸胍、10.05l/L氯化鈣溶液中,兌水透析24h，備用。假設(shè)必要保存，將稀釋液

5、在-20條件下貯存。先用0.1%胎牛血清卵白1l溶解0.1g堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子防范堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子粘附于安瓶?jī)?nèi)，將稀釋液溶解于1lTris液備用。假設(shè)必要保存，將稀釋液在-20條件下貯存。1.3模子制備1.4不雅察指標(biāo)2結(jié)果2.1BP/bFGF生物卵白膠的制備在20擺布的室溫條件下，bFGF及BP溶液可以很好的溶解于纖維卵白原中成為透明液體，與凝血酶混淆后，于5s內(nèi)敏捷凝聚，成為固態(tài)膠體。質(zhì)料白色半透明，富于光芒，質(zhì)地松軟而脆弱，充填于軟骨缺損部可以很好的順應(yīng)軟骨的曲線(xiàn)，并可將修飾得非常平滑。注射歷程應(yīng)該勻稱(chēng)而快速，注于缺損部后待凝膠成型后，留意休整外貌與正常樞紐面同等。2.2大要形

6、態(tài)和一樣平常狀態(tài)全部動(dòng)物均無(wú)膝樞紐熏染和積液產(chǎn)生。A組只，B組只，組只動(dòng)物跛行4周擺布，樞紐活動(dòng)受限。余全部動(dòng)物均未見(jiàn)跛行，其膝樞紐活動(dòng)范疇較術(shù)前無(wú)顯著改變，表示活潑，食欲佳。大要不雅察，A組：軟骨缺損區(qū)均為修復(fù)構(gòu)造所充填，外貌平滑，半透明狀而有光芒。術(shù)后8周修復(fù)構(gòu)造成白色，質(zhì)地穩(wěn)固，與四周構(gòu)造團(tuán)結(jié)精細(xì)，但可清楚的表現(xiàn)界限，外貌平滑與樞紐面曲線(xiàn)共同美滿(mǎn)；術(shù)后12周修復(fù)構(gòu)造仍成白色穩(wěn)固構(gòu)造，與四周構(gòu)造融為一體，界限趨與模糊，外貌更趨平坦；術(shù)后24周修復(fù)構(gòu)造成為白色半透明軟骨樣構(gòu)造，與四周軟骨團(tuán)結(jié)為一體，外貌細(xì)微凹陷，樞紐外貌平滑，穩(wěn)固。B組，組：術(shù)后8、12、24周均未出現(xiàn)完備平滑樞紐面修復(fù)征象

7、，外貌凹凸不服，只是在缺損邊沿有部門(mén)修復(fù)構(gòu)造出現(xiàn)，中心缺損恒久存在，被暗赤色疏松結(jié)締構(gòu)造充填，修復(fù)構(gòu)造與正常軟骨界限清楚。D組也完全沒(méi)有出現(xiàn)修復(fù)征象出現(xiàn)。2.3構(gòu)造學(xué)不雅察A組：術(shù)后8周，HE染色見(jiàn)缺損已經(jīng)被顯著修復(fù)，大量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，圓形和橢形胞核清楚，有軟骨陷凹出現(xiàn)，修復(fù)構(gòu)造與樞紐缺損邊沿軟骨團(tuán)結(jié)精細(xì)，PAS染色見(jiàn)基質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)染，糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)開(kāi)始大量沉積；術(shù)后12周，修復(fù)構(gòu)造厚于正常軟骨，修復(fù)構(gòu)造與其團(tuán)結(jié)精細(xì)，以類(lèi)透明軟骨細(xì)胞為主，大量增殖，軟骨陷窩大量出現(xiàn)，表層軟骨細(xì)胞希罕體積小，而底層細(xì)胞量多且較為宏大，出現(xiàn)分層漫衍的特點(diǎn)，基質(zhì)PAS染色見(jiàn)顯著藍(lán)染，糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)沉積更為顯著；術(shù)后24

8、周，軟骨厚度稍變薄，軟骨陷窩顯著，修復(fù)構(gòu)造與正常軟骨界限模糊，團(tuán)結(jié)精細(xì)，卵白多糖類(lèi)物質(zhì)顯著沉積，部門(mén)地區(qū)出現(xiàn)纖維軟骨特點(diǎn)。B組、組：術(shù)后缺損未被有用修復(fù)，中心凹陷外貌恒久殘留，缺損內(nèi)部被大量肉芽構(gòu)造添補(bǔ)，邊壁出現(xiàn)骨板，基質(zhì)染色見(jiàn)少數(shù)靠近骨板的局部出現(xiàn)軟骨基質(zhì)沉積。D組：8、12、24周術(shù)后軟骨缺損恒久存在，缺損處被大量肉芽構(gòu)造所添補(bǔ)。質(zhì)地松軟，與四周無(wú)顯著毗連，HE染色未見(jiàn)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，PAS染色未見(jiàn)糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)沉積。2.4電鏡下不雅察A組術(shù)后8、12周電鏡下表層可見(jiàn)縱行擺列的軟骨細(xì)胞、軟骨囊,軟骨細(xì)胞之間可見(jiàn)間隙及成熟的軟骨基質(zhì)，部門(mén)軟骨鈣化；術(shù)后24周組:電鏡下軟骨基質(zhì)膠原擺列規(guī)矩，軟骨

9、厚度勻稱(chēng)，軟骨下方為擺列規(guī)矩的骨髓腔圖111。2.5構(gòu)造學(xué)評(píng)分雙盲法測(cè)定，結(jié)果表現(xiàn)，A組1.920.69顯著優(yōu)于B組3.580.67，組(3.330.89)及D組(12.451.05)。SPSS13.0軟件舉行方差闡發(fā)，A組和B、D3組均存在明顯性差異(P0.05)；B、D組存在明顯性差異(P0.05)；而B(niǎo)組和組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。圖1BP/bFGF生物活性質(zhì)料組術(shù)后8周大要不雅察圖2BP/bFGF生物活性質(zhì)料組術(shù)后12周大要不雅察圖3BP/bFGF生物活性質(zhì)料組術(shù)后24周大要不雅察圖4BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后8周HE染色40圖5BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后12周HE染

10、色40圖6BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后24周HE染色40圖7BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后8周PAS40圖8BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后12周PAS40圖9BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后24周PAS40圖10BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后24周電鏡程度掃描1000圖11BP/bFGF生存活性質(zhì)料組術(shù)后24周電鏡縱向掃描10003討論創(chuàng)傷、骨樞紐病等多種疾病均可造成樞紐軟骨缺損。由于樞紐軟骨不克不及自身修復(fù)，怎樣修復(fù)樞紐軟骨缺損是骨科的研究熱門(mén)之一。很多學(xué)者應(yīng)用軟骨生長(zhǎng)板移植、軟骨膜移植、骨膜移植及軟骨細(xì)胞移植等多種外源性修復(fù)要領(lǐng)舉行實(shí)行及臨床研究。肌腱和筋膜瓣插入樞紐成形術(shù)重要應(yīng)

11、用于上肢樞紐，特殊對(duì)付改進(jìn)拇指成效有較好結(jié)果。1992年趙距才等報(bào)道動(dòng)物實(shí)行術(shù)后3個(gè)月，移植的筋膜退變，成形的樞紐嚴(yán)峻退變。Knight以為成形術(shù)只能提供一個(gè)無(wú)痛或微痛的有必然活動(dòng)度的樞紐，不適于必要一個(gè)不變、安穩(wěn)、機(jī)動(dòng)樞紐的病人。自體骨軟骨移植治療樞紐軟骨缺損的遠(yuǎn)、近期結(jié)果較好，但自體移植取材有限；同種異體移植遠(yuǎn)期有退變、易熏染、易被汲取等題目。骨膜和軟骨膜移植也是一種較好的修復(fù)樞紐軟骨缺損的要領(lǐng)。骨膜生發(fā)層中的未分化間充質(zhì)細(xì)胞可分化為骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，在樞紐腔內(nèi)無(wú)血液供給低氧環(huán)境中分化為軟骨細(xì)胞。但再生軟骨有退變大概，連續(xù)被動(dòng)活動(dòng)(P)有利于骨膜再生軟骨，并低落退變率。軟骨膜再生軟骨本領(lǐng)強(qiáng)

12、，但泉源少，再生軟骨較正常軟骨耐壓本領(lǐng)差，并隨時(shí)間延伸逐退變。構(gòu)造工程要領(lǐng)造就軟骨細(xì)胞移植得當(dāng)修復(fù)種種外形的軟骨缺損，具有必然上風(fēng)，但其缺點(diǎn)是自體有活性的軟骨網(wǎng)絡(luò)困難，同種異體細(xì)胞又有流傳病毒的傷害。隨著細(xì)胞因子研究的深化，創(chuàng)造多種細(xì)胞因子通過(guò)自排泄和旁排泄2種方法調(diào)治骨和軟骨的天生,此中重要有骨形態(tài)產(chǎn)生卵白(BP)、bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(TGF-)、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍生因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等。這些因子的創(chuàng)造使內(nèi)源性修復(fù)樞紐軟骨缺損成為大概。BP具有誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化形成軟骨和新生骨的生物學(xué)作用，在體外能誘導(dǎo)骨髓腔內(nèi)骨髓源性干細(xì)胞，樞紐腔內(nèi)的脂肪構(gòu)

13、造、髕韌帶構(gòu)造和滑膜構(gòu)造的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞3。BP能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞不成逆地分化形成軟骨和骨，但BP僅是骨天生的啟動(dòng)因子，對(duì)已分化的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞無(wú)進(jìn)一步促進(jìn)其增殖作用。而軟骨細(xì)胞形成后的進(jìn)一步生長(zhǎng)、增殖、分化是由別的骨生長(zhǎng)因子調(diào)治的。bFGF普及存在于人體構(gòu)造中,對(duì)骨和軟骨的修復(fù)起緊張的作用，特殊它是一種毛細(xì)血管增殖刺激劑，促進(jìn)毛細(xì)血管向骨移植物中長(zhǎng)入，使軟骨天生早期的構(gòu)造中軟骨島數(shù)目增多。以是它增長(zhǎng)BP成骨量的原理大概促進(jìn)了必要血供的軟骨內(nèi)化骨，加快了軟骨的成熟和骨化。因此BP啟動(dòng)骨形成歷程后，為bFGF提供了大量靶細(xì)胞。另一方面，bFGF無(wú)異位誘導(dǎo)成骨活性，BP的異位

14、骨誘導(dǎo)作用又可補(bǔ)充bFGF的不敷，從而使BP和bFGF在生物學(xué)成效上形成互補(bǔ)，進(jìn)而加快骨誘導(dǎo)、軟骨形成歷程。只管BP和bFGF的作用有著明顯的差異，但它們?cè)诠钦T導(dǎo)、軟骨形成中的調(diào)治是必不成少的。二者在差異水安然平靜差異環(huán)節(jié)上到場(chǎng)對(duì)骨誘導(dǎo)、軟骨形成歷程的調(diào)治。在相宜的劑量下，二者存在著顯著的協(xié)同作用4。醫(yī)用生物卵白膠具有精良生物相容性，可以完全被落解。由于其特有的三維網(wǎng)架布局營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，以是是樞紐內(nèi)軟骨修復(fù)的精良載體。有人用生物卵白膠作為IGF-1的操縱載體，用于治療馬的樞紐軟骨損傷，獲得精良的結(jié)果5。本實(shí)行生長(zhǎng)了這種自然質(zhì)料，接納BP/bFGF生物卵白膠團(tuán)結(jié)應(yīng)用修復(fù)樞紐軟骨缺損。結(jié)果表白，

15、其樞紐軟骨缺損修復(fù)結(jié)果顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用此中一種因子，可見(jiàn)12例膝樞紐軟骨缺損均愈合精良，樞紐面平滑、完備、無(wú)裂隙、富有彈性，與四周軟骨界限不清，缺損區(qū)內(nèi)軟骨細(xì)胞富厚，擺列趨于正常，軟骨下骨進(jìn)一步改建，軟骨厚度根本到達(dá)正常?；|(zhì)PAS染色見(jiàn)顯著藍(lán)染，糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)沉積更為顯著。而單獨(dú)接納BP/生物卵白膠或bFGF/生物卵白膠修復(fù)樞紐軟骨缺損，由于成效較單一，大概在體內(nèi)被落解后才可以被使用，較低的生物使用度限定了BP及bFGF應(yīng)用療效的發(fā)揮。以是，軟骨缺損均未愈合精良，樞紐面凹凸不服、外貌不完備、裂隙清楚、基質(zhì)PAS染色藍(lán)染較淡，糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)沉積不顯著6。綜上所述，以為:1)BP及bFGF具有誘導(dǎo)形成軟骨的活性,能促進(jìn)樞紐內(nèi)透明軟骨再生，但本領(lǐng)較弱，無(wú)誘導(dǎo)樞紐軟骨形成作用；2)BP/bFGF生物復(fù)合物能促進(jìn)樞紐軟骨形成,較單獨(dú)應(yīng)用BP、bFGF結(jié)果好,是生物學(xué)修復(fù)樞紐軟骨缺損的精良要領(lǐng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1何川，楊慶銘.骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的根本觀點(diǎn)和在骨科的相干應(yīng)用研究J.中國(guó)矯形外科雜志，2022，5：389-3922呂昌偉，胡蘊(yùn)玉，白建平，等.注射型軟骨構(gòu)造工程活性質(zhì)料修復(fù)樞紐軟骨缺損的實(shí)行研究J.骨與樞紐損傷雜志,2022,10:68