β連環(huán)素在白血病細(xì)胞株的異常定位研究

1、-連環(huán)素在白血病細(xì)胞株的非常定位研究【摘要】-連環(huán)素是nt信號(hào)通路關(guān)鍵的信號(hào)通報(bào)子，其在細(xì)胞的非常定位引起卑劣靶基因的轉(zhuǎn)錄是多種實(shí)體腫瘤產(chǎn)生的緣故原由之一。由于造血細(xì)胞缺少典范的黏著毗連adherensjuntin,AJ，因此對(duì)-連環(huán)素在血液腫瘤的表達(dá)及定位并無較多的研究。本研究探究4種常見的白血病細(xì)胞株(Daudi,Jurkat,K562和Thp-1)中-連環(huán)素卵白的定位及-連環(huán)素基因RNA的表達(dá)程度，相識(shí)血液腫瘤中是否有-連環(huán)素卵白的定位非常，以期創(chuàng)造白血病新的產(chǎn)生氣制，為探求新的特異治療靶點(diǎn)提供線索。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)-連環(huán)素在白血病細(xì)胞系中的定位，用及時(shí)定量RT-PR法測(cè)定-連環(huán)素R

2、NA表達(dá)程度。效果表白：4種白血病細(xì)胞株有兩種Jurkat、Thp-1存在-連環(huán)素的非常定位，且-連環(huán)素RNA表達(dá)增高，但在Jurkat和Thp-1細(xì)胞中的-連環(huán)素RNA低于Daudi和K562細(xì)胞。這4種白血病細(xì)胞株中-連環(huán)素基因的RNA表達(dá)程度與其非常定位無相干性。結(jié)論：-連環(huán)素定位非常大概到場(chǎng)部門血液腫瘤的產(chǎn)生，引起-連環(huán)素定位非常的機(jī)制并不是產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄程度。【關(guān)鍵詞】-連環(huán)素白血病細(xì)胞株DaudiK562JurkatThp-1AberrantLalizatinf-atenininLeukeiaellLinesAbstrat-ateninplaysaentralrleinntsignal

3、ingpathay.Theaberrantlalizatinf-atenininnuleusausesthetransriptinfdn-streatargetgenes,hihisthepathgenesyfseslidtuurs.Astheexpressinfadherenjuntinnhepietiellsisveryl,thereareafestudiesn-ateninexpressininleukaeia.Thisstudyasaiedtinvestigate-ateninlalizatinand-ateninRNAexpressinlevelsin4leukeiaelllines

4、sastexplreanengeniehanisandtfindutanetherapeutitarget.The-ateninlalizatininleukeiaelllinesasdetetedbyiunytheistry,the-ateninRNAexpressinlevelasassayedbyreal-tiequantitativeRT-PR.Theresultsshedthatthereasaberrantlalizatinf-atenininJurkatandThp-1,and-ateninRNAexpressinlevelasntinreasdinthesetelllines,

5、hever,theRNAexpressinlevelsfJurkatandThp-1erelerthanthsefDaudiandK562.The-ateninRNAexpressinlevelasntrrelatedith-ateninaberrantlalizatininthese4elllines.Itisnludedthattheaberrantlalizatinf-ateninayplayarleinthedevelpentfseleukeia,andtheehanisresultingin-ateninaberrantlalizatinnttakeplaeattransriptin

6、level.Keyrds-atenin；leukeiaellline；Daudi；K562；Jurkat；Thp-1-連環(huán)素-atenin是nt信號(hào)通路關(guān)鍵的信號(hào)通報(bào)子，其在胞漿中的不變、積聚及進(jìn)核是nt信號(hào)通報(bào)的緊張步調(diào)。它通過與胞核中DNA結(jié)合卵白TF/LEF的結(jié)合，配合調(diào)控一系列與細(xì)胞分化、增殖相干的基因如-y、-jun、ylinD11等的表達(dá)。-連環(huán)素在實(shí)體腫瘤中的作用已經(jīng)得到了普及的研究。已證明，-連環(huán)素的非常表達(dá)與多種實(shí)體腫瘤如結(jié)腸癌、肝癌、玄色素瘤2-4等的產(chǎn)生、生長相干。也有研究證明，nt信號(hào)通路在造血干細(xì)胞的生長發(fā)育中起緊張的作用5。因此白血病中也大概存在-連環(huán)素的非常表達(dá)。

7、為相識(shí)差異白血病細(xì)胞株的-連環(huán)素的表達(dá)狀態(tài)，我們通過免疫細(xì)胞化學(xué)和及時(shí)定量RT-PR技能對(duì)差異白血病細(xì)胞株的-連環(huán)素的定位及轉(zhuǎn)錄程度舉行研究。質(zhì)料和要領(lǐng)細(xì)胞造就白血病細(xì)胞株Daudi人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系、Jurkat急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系、K562慢性髓系白血病細(xì)胞系、Thp-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系均購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。全部細(xì)胞株均用RPI1640造就液含10胎牛血清在37、52、飽和濕度的孵箱內(nèi)造就。重要試劑兔抗人-連環(huán)素抗體購自武漢晶美生物工程、SP免疫構(gòu)造化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢凌飛生物技能開拓，TRIzL總RNA提取液購自ega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購

8、自Prega公司，PR試劑購自武漢天源生物技能，20SYBRGreen染料購自上海再起公司，兔抗人-連環(huán)素抗體為Nearks公司產(chǎn)物，辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG抗體為Santaruz公司產(chǎn)物。-連環(huán)素在白血病細(xì)胞株定位的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)取Daudi、Jurkat、K562、Thp-1細(xì)胞懸液，別離移入10l離心管中600g離心10分鐘，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞1次，再用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)解細(xì)胞密度105/l以上，舉行細(xì)胞涂片載玻片經(jīng)APES處置懲罰，枯燥后浸入-20預(yù)冷的甲醇中結(jié)實(shí)20分鐘，風(fēng)干后4保存。取正凡人外周血Fill密度梯度離心法分散外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌1次，再

9、用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)解細(xì)胞密度105/l以上，舉行細(xì)胞涂片，作為正常比擬組。取各組細(xì)胞涂片，以0.01l/LPBS漂洗3分鐘，共3次；用0.3過氧化氫/甲醇液室溫孵育30分鐘，以撤除內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS漂洗5分鐘，共3次；10正常山羊血清室溫下孵育10分鐘以淘汰配景非特異性染色；棄去血清，不洗，加稀釋的一抗，4濕盒內(nèi)留宿，PBS漂洗5分鐘，共3次；參加辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的通用型二抗，室溫孵育30分鐘，PBS漂洗5分鐘，共3次；DAB顯色，蘇木素比擬染色30秒，自來水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，以中性樹脂封固。油鏡下不雅察效果。-連環(huán)素RNA表達(dá)程度的及時(shí)定量RT-PR檢測(cè)使用

10、SYBRGreen染料在Lightyle熒光定量PR儀上檢測(cè)-連環(huán)素RNA的表達(dá)。取5106個(gè)細(xì)胞，用TRIzL試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。參照文獻(xiàn)5，方案引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為71bp，以GAPDH為內(nèi)參照，擴(kuò)增產(chǎn)物為220bp。引物由上海博亞生物工程技能辦事合成，序列如下：-連環(huán)素：Sense：5-GATGGAAGAAATAGTTGAAG-3；Antisense：5-AATTGGTTGTGAAAT-3GenBankN_001904；GAPDH：Sense：5-GAAGGTGAAGGTGGAGT-3；Antisense：5-GAAGATGGTGATGGGATTT-3；(GenBankAJ0

11、05371)。SYBRGreen是一種只與雙鏈DNA結(jié)合的染料，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)適時(shí)，發(fā)出熒光，從DNA雙鏈上開釋出來時(shí)，熒光信號(hào)急劇削弱。因此，隨著PR產(chǎn)物的增長，產(chǎn)物與SYBRGreen結(jié)合的量也增大，其信號(hào)強(qiáng)度代表了產(chǎn)物的量，并做融解曲線對(duì)PR產(chǎn)物的特異性舉行斷定。優(yōu)化的及時(shí)定量RT-PR體系為：10PR緩沖液2l，25l/Lgl22l，10l/LdNTP0.4l，20SYBRGreen1l，10l/L的引物各0.4l，2U/l的Taq酶0.5l，DNA1l，反響總體積20l。反響條件：953分鐘，945秒，545秒，7210秒，共40個(gè)循環(huán)，80網(wǎng)羅熒光信號(hào)。尺度曲線的制作將一次逆轉(zhuǎn)

12、錄的K562細(xì)胞DNA分裝，保存于-80，作為尺度品。每次擴(kuò)增時(shí)拿出1份K562細(xì)胞DNA用水做10倍系列稀釋，別離對(duì)-連環(huán)素和GAPDH舉行及時(shí)定量擴(kuò)增，制作各自的尺度曲線。橫坐標(biāo)相稱于K562細(xì)胞的總RNA量，縱坐標(biāo)為t值指PR擴(kuò)增歷程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。尺度曲線相干系數(shù)r0.99的定量效果以為可靠。按照各自的尺度曲線，可以得出各個(gè)標(biāo)本-連環(huán)素、GAPDH的起始拷貝數(shù)。我們將-連環(huán)素與GAPDH拷貝數(shù)之比的100倍作為尺度化-連環(huán)素-ateninN，即-連環(huán)素N-連環(huán)素RNA拷貝數(shù)/GAPDHRNA拷貝數(shù))100%。效果-連環(huán)素卵白定位闡發(fā)研究，-連

13、環(huán)素在造血細(xì)胞中可定位于胞膜和或胞漿，表達(dá)的強(qiáng)度可高可低，但無胞核的染色5，本研究的正常比擬組僅有胞膜和胞漿的染色，與文獻(xiàn)效果雷同。在本研究中涉及到的幾種細(xì)胞株中可不雅察到Jurkat、Thp-1胞核的強(qiáng)染色為棕玄色，Daudi、K562無胞核的染色，僅有胞膜和胞漿的染色為棕黃色，且差異的細(xì)胞染色的強(qiáng)度也有強(qiáng)弱之分圖1。尺度曲線的創(chuàng)立別離將-連環(huán)素和GAPDH差異濃度的倍比稀釋模板舉行定量PR，所得的定量尺度曲線別離為tGAPDH-4.093lgGAPDH拷貝數(shù)+7.954、t-atenin=-2.711lghTERT拷貝數(shù)+17.99，相干系數(shù)別離為-0.99、-1.00。按照公式盤算4種細(xì)

14、胞株的尺度化-連環(huán)素即-ateninN。上述4種細(xì)胞株的及時(shí)定量RT-PR效果見圖2。討論nt信號(hào)傳導(dǎo)通路是一種既可影響基因表達(dá)又可影響細(xì)胞遷移的信號(hào)通路。-連環(huán)素是該通路中緊張的信號(hào)通報(bào)子，其在胞漿內(nèi)的不變、積聚及進(jìn)核是nt信號(hào)通報(bào)的緊張步調(diào)。-連環(huán)素是一種多成效胞漿卵白，多發(fā)性結(jié)腸腺癌有差異的卵白結(jié)合成效域。在nt信號(hào)通路中，-連環(huán)素與軸卵白axin、腺瘤性結(jié)腸息肉adenatusplypsisli，AP和糖源合酶激酶-3GSK-3彼此作用，形成復(fù)合物。無nt信號(hào)時(shí)，絲/蘇氨酸激酶的GSK-3和酪卵白激酶asEinkinase，K對(duì)-連環(huán)素氨基端雙磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)泛素體系落解-連環(huán)素。而在

15、有nt信號(hào)時(shí)，信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，激活胞漿內(nèi)的散亂卵白dishevelledprtein，Dsh，按捺GSK-3的活性，-連環(huán)素不克不及落解，而在胞內(nèi)大量積聚并進(jìn)入核內(nèi)，與DNA結(jié)合卵白TFTellfatr/LEF(lyphidenhanerfatr)的結(jié)合，啟動(dòng)靶基因如-y、-jun、ylinD11等的表達(dá)。研究效果表白：多種實(shí)體腫瘤的產(chǎn)生生長歷程中常有非常的nt信號(hào)通路激活，而-連環(huán)素的非常定位在實(shí)體腫瘤的產(chǎn)生中起緊張的、直接的作用。在多種實(shí)體腫瘤中如結(jié)腸癌、前線腺癌、卵巢癌、玄色素瘤、肝細(xì)胞癌中均可見到-連環(huán)素在胞核的非常定位。業(yè)已證明實(shí)體腫瘤中-連環(huán)素在胞核的非常定位與實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖、

16、黏附等生物學(xué)活性相干3。由于在造血細(xì)胞上缺少典范的黏著毗連adherensjuntin，-連環(huán)素在血液腫瘤的表達(dá)及定位并沒有得到較多的研究，但已經(jīng)證明，nt信號(hào)通路確實(shí)到場(chǎng)到造血細(xì)胞的發(fā)育和增殖歷程6。由此可以推測(cè)，血液腫瘤細(xì)胞中大概存在nt信號(hào)通路的非常活化，大概有-連環(huán)素的非常定位。本研究選擇了4種常見的血液腫瘤細(xì)胞株舉行研究，創(chuàng)造-連環(huán)素在Daudi、K562細(xì)胞中表達(dá)在胞膜及胞漿，但在胞核并沒有不雅察到-連環(huán)素的表達(dá)，而Jurkat、Thp-1細(xì)胞中可不雅察到-連環(huán)素在胞核的表達(dá)?？梢酝茢嘣贘urkat、Thp-1細(xì)胞株中，-連環(huán)素在胞核非常表達(dá)，進(jìn)而引起其卑劣一系列影響細(xì)胞周期的靶基

17、因的過分表達(dá)大概在Jurkat、Thp-1細(xì)胞株的產(chǎn)生生長中起必然的作用。在部門血液腫瘤中存在有nt信號(hào)通路的非?；罨?，-連環(huán)素在胞漿內(nèi)落解/積聚調(diào)治失控、非常定位引起卑劣靶基因的轉(zhuǎn)錄是部門血液腫瘤產(chǎn)生的緣故原由之一。研究已證明，在實(shí)體腫瘤中引起-連環(huán)素非常表達(dá)的因素包羅：-連環(huán)素自己表達(dá)程度的增高7；通過按捺-連環(huán)素落解，進(jìn)而上調(diào)-連環(huán)素的途徑，包羅AP卵白、-連環(huán)素、GSK-3的突變。AP基因是一種典范的腫瘤按捺基因，與結(jié)腸癌產(chǎn)生的干系極為嚴(yán)密。在大多數(shù)結(jié)腸直腸癌中均創(chuàng)造AP基因突變，它的突變導(dǎo)致AP卵白“去頂改變，使其喪失與-連環(huán)素、軸卵白彼此作用的成效，AP卵白的失活可直接導(dǎo)致-連環(huán)素在核內(nèi)的積聚8。在玄色素瘤、無AP基因突變的結(jié)腸癌和別的范例的腫瘤，如肝細(xì)胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前線腺癌等9腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到-連環(huán)素TNNB1基因的突變(重要產(chǎn)生在第3外顯子)其氨基端的Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)突變可影響其落解歷程，造成-連環(huán)素胞內(nèi)程度升高。本研究進(jìn)一步接納及時(shí)定量RT-PR要領(lǐng)定量檢測(cè)4種細(xì)胞株中-連環(huán)素基因