分子生物學檢驗技術(shù)：第四、五、六章 檢驗分生

1、1第四章 核酸序列分析 2DNA測序技術(shù)是分子生物學基本技術(shù)之一。測定并分析核酸的序列，是研究其結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系的前提，是分子生物學最基本的課題，并為臨床疾病的分子診斷提供最為精確的判定依據(jù)。3本章內(nèi)容1、第一代DNA測序技術(shù)2、第二代測序技術(shù)3、第三代測序技術(shù)的發(fā)展趨勢41、第一代DNA測序技術(shù)1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術(shù)的誕生。51）雙脫氧鏈末端終止法測序原理生物化學（第3版）圖1 DNA合成原理圖6DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3-OH末端上進行的。由于2，3-雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3-位脫

2、氧而失去游離-OH，當它摻入到DNA鏈后，3-OH末端消失，使DNA鏈的延伸終止。7利用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以4種dNTP為底物，在四組互相獨立的反應(yīng)體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對原則，在測序引物引導下，合成四組有序列梯度的互補DNA鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后直接識讀待測DNA的序列。8圖2 雙脫氧鏈末端終止法測序原理19圖3 雙脫氧鏈末端終止法測序原理2102）測序體系待測模板（單鏈或雙鏈DNA） 測序引物DNA聚合酶（Klenow片段 、測序酶 、Taq DNA聚合酶）dNTP和ddNT

3、P熒光標記 DNA片段的凝膠電泳 113）方法特點該法測定的序列是酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物，其準確性可能受堿基錯誤摻入的影響，并且難以分析有堿基修飾和存在二級結(jié)構(gòu)的DNA樣品。一次反應(yīng)可測500個以上的堿基序列；具有方法簡便快速，便于實現(xiàn)自動化分析，能夠滿足絕大多數(shù)DNA樣品序列分析的需要等特點，在DNA序列分析中得到最廣泛的應(yīng)用。124）自動化測序以全自動化操作系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工操作，以熒光染料標記代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性核素標記，以PCR循環(huán)測序反應(yīng)為主導方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶反應(yīng)方法，以集束化的毛細管電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的凝膠電泳，以高速自動化的序列分析系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工識讀等。具有簡單、安全、精確、并行和高效等特

4、點。13自動化測序系統(tǒng)基于單一熒光染料標記的自動化測序系統(tǒng)基于多種熒光染料標記的自動化測序系統(tǒng)14基于單一熒光染料標記的自動化測序系統(tǒng)15基于多種熒光染料標記的自動化測序系統(tǒng)162、第二代測序技術(shù)盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標志的第二代測序技術(shù)誕生了。1）第2代測序技術(shù)的原理建立文庫產(chǎn)生DNA簇測序（1）Roche公司的454測序技術(shù)待測DN

5、A文庫的構(gòu)建：把待測序列用噴霧法打斷成300-800bp的小片段，構(gòu)建單鏈DNA(ssDNA)文庫。EmulsionPCR：將ssDNA與水油包被的磁珠一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補的寡聚核苷酸序列，ssDNA會特異地連接到磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，因此可以保證每一個與磁珠結(jié)合的小片段都會在各自的孵育體系內(nèi)獨立擴增,擴增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，破壞孵育體系并富集帶有DNA的磁珠。經(jīng)過擴增反應(yīng)，每一個小片段都將被擴增大約100萬倍，從而達到下一步測序反應(yīng)所需的模板量。1819測序：焦磷酸測序技術(shù)測序引物與單鏈DNA模板退火后，通過DNA聚合酶、ATP硫酸化

6、酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等四種酶的級聯(lián)反應(yīng)，將每一個dNTP的摻入與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號的形式實時記錄DNA模板的核苷酸序列。20分子診斷學（第2版） 圖5 焦磷酸測序技術(shù)原理 21Pyrosequencing 圖1. 454測序技術(shù)流程454技術(shù)的主要缺點是無法準確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應(yīng)中會一次加上多個T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結(jié)果不準確。也正是因為這個原因，454技術(shù)主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得

7、后繼的序列拼接工作更加高效、準確。（2）Illumina公司的Solexa技術(shù)待測DNA文庫的構(gòu)建把待測序列打斷成200-500bp的小片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構(gòu)建ssDNA文庫。BridgePCR：DNA與流動槽的附著將這些ssDNA隨機地附著在流動槽表面的channel上。流動槽是一種含有8個channel的微纖維板，它的表面固定有很多接頭，能支持ssDNA在其表面以固定的接頭為模板進行橋式擴增。24測序：邊合成邊測序（SBS）向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP。由于這些dNTP的3羥基被化學方法保護，因而每輪合成反應(yīng)都只能

8、添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫。加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，用光學設(shè)備完成熒光信號的記錄，再通過計算機分析轉(zhuǎn)化為測序結(jié)果。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College25圖2. Solexa測序技術(shù)流程Solexa技術(shù)的讀取長度可以達到275bp，相比454技術(shù)，其后續(xù)的序列拼接工作的計算量和難度均大大增加。 Solexa技術(shù)主要的錯誤來源是核苷酸的替換，而不是插入或缺失，目前它的錯誤率大約在1-1.5 %之間。Solexa技術(shù)每個循環(huán)能獲得20.5

9、-25 Gb的測序結(jié)果，耗時約9.5天。Solexa技術(shù)在合成中每次只能添加一個dNTP，因此很好地解決了同聚物長度的準確測量問題。3）ABI公司的SOLiD技術(shù)待測DNA文庫的構(gòu)建把待測序列打斷成很小的片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構(gòu)建ssDNA文庫。EmulsionPCR與454技術(shù)的EmulsionPCR類似，將帶接頭的ssDNA固定在磁珠表面，進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行3端修飾。28測序：連接酶測序向體系中加入DNA連接酶、通用測序引物n和具有3-XXnnnzzz-5結(jié)構(gòu)的八聚核苷酸。在這個八聚核苷酸中，第1和第2位（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在第6

10、-8位（zzz）上加了不同的熒光標記。這種由兩個堿基決定的測序方法被稱為兩堿基測序。當八聚核苷酸由于第1和第2位配對而被連接酶連接上時，會發(fā)出熒光。在記錄下熒光信息后，通過化學方法在第5和第6位之間進行切割，淬滅熒光信號，以進行下個位置的測序。通過這種方法，每次測序的位置都相差五位，即第一次測第1和第2位，第二次測第6和第7位在測到末尾后，將新合成的鏈變性、洗脫。而后用通用測序引物n-1進行第二輪測序。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College29通用測序引物n-1與通用測序引物n的差別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基，

11、即通用測序引物n-1在通用測序引物n配對位置上向3端移動了一個堿基。因此在加入DNA連接酶和八聚核苷酸后，可以測定第0和第1位、第5和第6位第二輪測序完成后，接下來再分別加入通用測序引物n-2、通用測序引物n-3、通用測序引物n-4進行第三輪、第四輪、第五輪測序，最終可以完成全部位置的測定，并且每個位置均被測定了兩次。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College30圖3. SOLiD測序技術(shù)流程SOLiD技術(shù)與Solexa技術(shù)類似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復雜。SOLiD技術(shù)每個循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為10-15 Gb，耗時約為6-7天

12、。SOLiD技術(shù)每個循環(huán)可以測兩個上樣玻片，讀取長度可達250bp，而且由于采用兩堿基測序，該技術(shù)的準確率能達到99.94 %以上。2）第2代測序技術(shù)的特點速度快準確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大3）第2代測序技術(shù)的應(yīng)用高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。 依靠后期強大的生物信息學分析能力，對照一個參比基因組(reference genome)高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence) 。2007年Van Orsouw等人結(jié)合改進的AFLP 技術(shù)和454 測序技術(shù)對玉米基因組進行了重測序，所發(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點能夠用SN

13、PWave技術(shù)驗證，提供了一條對復雜基因組特別是含有高度重復序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。2008年Hillier對線蟲CB4858 品系進行Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴增。 2008年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了RNA 深度測序。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道過的RNA剪切形式、3端非翻譯區(qū)、變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體。而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。高通量測序技術(shù)在全基因組mRNA表達譜

14、，microRNA表達譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40 萬個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。3）第三代測序技術(shù)：單分子測序?qū)捂淒NA片段所有堿基均進行標記，A、T、C、G

15、分別標上不同的熒光基團，標記好的單鏈DNA分子吸附在微球體上并置于液流系統(tǒng)中，然后用核酸外切酶逐個快速切斷DNA中標記的核苷酸，液流系統(tǒng)載著切下的核苷酸依次通過檢測器，收集分析熒光信號，便可直接得到DNA序列。3839通過一種電子檢測器，探測單鏈DNA分子通過納米微孔時，輕微的電流變化（不同的堿基產(chǎn)生不同的電流），從而迅速確定長鏈DNA的序列。41第五章 生物芯片技術(shù)42生物芯片技術(shù)是指通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬密集排列的分子微陣列，以實現(xiàn)對組織、細胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物分子進行高效、準確、高通量檢測的技術(shù)。生物芯片（biochip）包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織

16、芯片等。43一、基因芯片基因芯片又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray)。將大量的DNA片段(寡核苷酸、cDNA或基因組DNA片段)有序地、高密度地固定排列在載體(玻璃片、硅片或纖維膜等)上制成點陣，稱之為基因芯片。 44基因芯片的原理基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種 高效、快速的 核酸序列分析手段。 45基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray46圖1 生物芯片分析步驟芯片設(shè)計芯片制作PCR擴增靶基因標記原位合成點樣方法實際應(yīng)用樣品處理芯片雜交數(shù)據(jù)分析信號

17、檢測放射顯影光化學電化學酶促反應(yīng)47（一）芯片微陣列制備基因芯片的核心技術(shù)是如何在一個有限的固相載體表面固定大量的探針陣列。481、載體 玻片 固體片狀 硅片 瓷片 硝酸纖維素膜 膜性材料 尼龍膜 聚丙烯膜 49載體材料表面不具備活性基團，需經(jīng)活化后才能用于在載體上合成探針和固定已經(jīng)合成的寡核苷酸探針。載體表面的活化主要是涂布多聚賴氨酸或者包被氨基硅烷偶聯(lián)試劑，使載體表面帶有羥基或者氨基等活性基團。502、探針在載體表面的固定 光去保護并行合成法原位合成 分子印章原位合成法 噴印合成法（壓電打印法） 合成點樣：通過特定的高速點樣機器人直接將探針點在芯片上的技術(shù)。 51A、原位合成基因芯片的原位

18、合成法是基于組合化學的合成原理。它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯(lián)位點和次序，如要合成AGCT四種堿基所有序列組合的四聚體(256種)，其基本構(gòu)成可以見下圖。 基因芯片原位合成原理示意圖 圖2 原位合成原理圖分子診斷學（第2版） 53B、合成點樣 由具有多個微細加樣孔的陣列復制器或陣列器及由電腦控制的機器人來完成。機器人準確、快速地將不同探針樣品定量(0.251.0l)點樣于預處理好的基板相應(yīng)位置上，在基板上產(chǎn)生直徑為100150m斑點，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。 54（二）樣品的制備及標記樣品的制備：提取、純化，也可對樣品進行適當程度的擴增，以提高閱讀靈

19、敏度。 待測樣品的標記：大多采用Cy3、Cy5進行單色或雙色熒光標記，對于陣列密度較小的基因芯片可以用同位素（如33P）標記。55（三）樣品與基因芯片的雜交 cDNA基因芯片與靶基因的雜交過程與常規(guī)的分子雜交過程基本相同，相當于一種反相斑點雜交。用于檢測基因表達，需要在低溫、高鹽濃度下進行較長時間的反應(yīng) 。用于突變檢測，需要在高溫、低鹽濃度下進行較短時間的反應(yīng) 。 56（四）雜交結(jié)果的檢測及分析 檢測方法很多，如熒光顯影法、質(zhì)譜法、化學發(fā)光和光導纖維等，使用最廣泛的是熒光顯影法。 熒光檢測器主要有激光共聚焦顯微掃描系統(tǒng)和高性能的電荷偶聯(lián)照相機(CCD) 。57芯片激光光源電子束分裂器聚焦小孔檢

20、測器濾光鏡聚光鏡物鏡圖5 熒光顯影法5859基因芯片的數(shù)據(jù)分析基因芯片的數(shù)據(jù)分析，就是把原始數(shù)據(jù)按一定標準精簡、歸類，然后從歸類數(shù)據(jù)中尋找有實際生物學意義的過程。合理選擇數(shù)據(jù)分析方法，是充分發(fā)揮基因芯片功能的必要條件。60芯片數(shù)據(jù)分析的步驟 標準化，也稱歸一化，用來消除不同芯片、不同標記物之間的差異；數(shù)據(jù)精簡，在大量的芯片數(shù)據(jù)中去掉那些不能提供一個顯要意義的信息數(shù)據(jù)；統(tǒng)計學分析，利用聚類法或分類法等對所得到的芯片數(shù)據(jù)進行分析歸類，對分類結(jié)果進行進一步的統(tǒng)計學檢驗，以保證其準確性；生物學意義分析，在統(tǒng)計學分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，對其所代表的生物學意義進行研究，以得到相應(yīng)的結(jié)論。61（五）基因芯片的應(yīng)用

21、 定量分析（主要指測序和突變檢測）定性分析（主要指對基因表達的研究） 62圖6 基因芯片的用途分子診斷學（第2版） 63（五）基因芯片的應(yīng)用基因表達水平的檢測DNA序列測定基因突變和多態(tài)性的檢測基因芯片在疾病診斷中的應(yīng)用基因芯片在藥物研究中的應(yīng)用 64二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指固定于支持介質(zhì)上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種快捷、高效、并行、高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片適用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-小分子物質(zhì)間相互作用的分析。65蛋白質(zhì)芯片的原理支持物表面高度密集排列探針蛋白點陣（探針蛋白可選用抗體、抗原

22、、受體、酶等具有生物活性的蛋白質(zhì)，單抗是較好的探針蛋白），測定時，探針蛋白特異性地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性及定量分析。66蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用 疾病診斷與療效判定 新藥的研制與開發(fā) 蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用進行高靈敏的蛋白表達分析和抗原-抗體及配體-受體特異性篩選；生物分子的識別與檢測，及時地觀察生物分子之間的相互作用；酶底物的識別與檢測，揭示酶與底物的作用過程；進行蛋白樣品的分離及分析；研究蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)的相互作用。第六章 蛋白質(zhì)組學技術(shù) 68主要內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（自學）第二節(jié) 雙向凝膠電泳第三節(jié) 生物質(zhì)譜技術(shù)69基因組告訴你，理論上能夠發(fā)生什么？轉(zhuǎn)錄組告訴

23、你，可能發(fā)生什么？蛋白質(zhì)組告訴你，正在發(fā)生什么？70蛋白質(zhì)組（proteome） ： 1994年由Marc Wilkins首次提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)(PROTein)。71蛋白質(zhì)組學（proteomics）： 以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。72蛋白質(zhì)組學研究的特點： 多樣-蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目。 可變-蛋白質(zhì)隨時間與空間變化。73蛋白質(zhì)組學研究的基本流程蛋白質(zhì)組學研究的經(jīng)典策略：第一是樣品的預處理；第二是蛋白質(zhì)的分離

24、（雙向凝膠電泳或液相色譜分離）；第三是蛋白質(zhì)的鑒定及其性質(zhì)和功能的研究。 7475基于凝膠的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程2-DE & MS第二節(jié) 雙向凝膠電泳技術(shù)（一）雙向凝膠電泳分離前的樣品處理樣品來源：細胞、組織、體液等?？刹捎萌鞍?； 或進行預分級（線粒體、高爾基體、葉綠體、膜蛋白、核蛋白、細胞骨架、核仁等） 提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量及檢測靈敏度。76School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College77激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capture microdissection, LCM） 可用于組

25、織水平上的樣品制備，能從臨床病理切片標本中切下病變細胞，獲得純凈的細胞群。 （二）雙向凝膠電泳技術(shù) 雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）： 第一向的等電聚焦（IEF）電泳與第二向 SDS 聚丙烯凝膠電泳（SDS）組成的分離系統(tǒng)。IEF是基于蛋白質(zhì)等電點（pI）的差異進行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進行分離。 7879第一向等電聚焦酸堿IPG膠條pH梯度高分子量低分子量第二向 SDS80 第一向電泳IPG等電聚焦電泳 (IEF) 1等電聚焦電泳的基本原理81電泳基質(zhì)在電場中形成pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負電荷的蛋白

26、質(zhì)向正極移動，帶正電荷的蛋白質(zhì)向負極移動，當分子運動到各自的pI處時，所帶凈電荷為零，停止在該位置上。1098765432pHpI8.0蛋白質(zhì)pI4.0蛋白質(zhì)+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10等電聚焦過程82 2IPG（immobilized pH gradient，固定pH梯度）等電聚焦電泳 Immobiline 是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，將其摻入聚丙烯酰胺凝膠聚合單體中，形成固定化 pH 梯度，不容易變動。CH2 = CH-C-N-ROH=（R代表羧基或第三氨基）Immobilin

27、e分子式83 第二向電泳SDS- PAGE SDS的原理 SDS是一種陰離子去垢劑，蛋白質(zhì)-SDS復合物在PAGE系統(tǒng)中的遷移率主要取決于分子量大小。 84圖片來自網(wǎng)絡(luò)（三）凝膠上蛋白質(zhì)的檢測 85 蛋白質(zhì)樣品經(jīng) 2-DE 分離后，凝膠上的蛋白質(zhì)斑點須用一定的方法使其顯現(xiàn)出來，讓儀器或人眼檢測到。 1. 考馬斯亮藍染色（ R-250 ） 最常用的蛋白質(zhì)染色方法，與蛋白質(zhì)的堿性基團可逆結(jié)合，使之著色。86優(yōu)點：染色重復性好，操作簡便，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。缺點：靈敏度低于銀染和熒光染色，不能滿足對低豐度蛋白質(zhì)的檢測要求，樣品用量大。2. 銀染色（不含戊二醛） 在酸性硝酸銀溶液中蛋白質(zhì)與銀離子發(fā)生

28、作用，然后在堿性pH條件下，銀離子被甲醛還原成銀顆粒沉淀在蛋白質(zhì)上而呈顯棕黑色。優(yōu)點：靈敏度高，是考馬斯亮藍染色法的100倍缺點：操作繁瑣，重復性不如考馬斯亮藍染色，對糖蛋白、鈣結(jié)合蛋白的染色效果差。8788 熒光染色 利用結(jié)合于蛋白質(zhì)的熒光染料發(fā)出的熒光來檢測蛋白質(zhì)。目前商品化的熒光染料有SYPRO Ruby, Cy3, Cy5等。優(yōu)點：染色方法操作簡便，靈敏度高達110ng，染色線性范圍寬，對糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。缺點：價格較昂貴，熒光易淬滅。 89圖片來自網(wǎng)絡(luò)（四）雙向凝膠電泳圖譜的計算機分析確定蛋白質(zhì)斑點的位置、大小、染色深淺、pI 和分子量；圖譜間的比較、差

29、異蛋白質(zhì)斑點的確定；圖譜質(zhì)量的優(yōu)化、數(shù)據(jù)的儲存管理、數(shù)據(jù)庫分析等。90 1. 數(shù)字化雙向凝膠電泳圖譜的獲取 利用圖像掃描儀、數(shù)碼照像系統(tǒng)、激光密度儀等將凝膠（或轉(zhuǎn)印膜）上的蛋白質(zhì)斑點圖像轉(zhuǎn)化成數(shù)字化的圖像文件，這是進行計算機分析的前提。91 2. 圖像加工 對數(shù)字化電泳圖譜作增強對比度、背景消減等處理，以消除背景染色。同時對圖像的大小及方向進行調(diào)整，利于圖譜間的比較。 923. 蛋白質(zhì)斑點的檢測 圖像分析軟件自動進行蛋白質(zhì)斑點的識別，再經(jīng)手工修正。 檢測完成后，分析系統(tǒng)給出關(guān)于每個蛋白質(zhì)斑點的編號、量值、峰值和位置等方面的信息。 934. 凝膠匹配（斑點匹配） 凝膠匹配是指通過比較兩塊（或多塊

30、）凝膠圖譜，將圖譜上對應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點（代表同一種蛋白質(zhì)）標識出來，稱為匹配斑點；只在一塊膠上出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點也標識出來，稱為未匹配斑點，代表可能的差異表達蛋白質(zhì)。 945. 數(shù)據(jù)分析 分析軟件根據(jù)凝膠匹配的結(jié)果，對蛋白斑點進行分析，找出不同凝膠圖譜間存在質(zhì)變和量變的蛋白質(zhì)斑點。9596976. 雙向凝膠圖譜數(shù)據(jù)庫 雙向凝膠圖譜分析產(chǎn)生成千上萬的數(shù)據(jù)信息，現(xiàn)行的 2-DE 圖像分析軟件具有數(shù)據(jù)庫支持功能，一個蛋白質(zhì)在圖譜中標示出來，即可在數(shù)據(jù)庫中查到其相應(yīng)的描述信息，如該蛋白質(zhì)的名稱、分子量、等電點等；反之，如果蛋白質(zhì)的名稱及其它信息已知，也可在圖譜上顯示斑點位置。9899圖片來自網(wǎng)絡(luò)（六）雙向

31、凝膠電泳的分辨率、重復性及局限性 2-DE系統(tǒng)有很高的分辨率。 商品化的 IPG 膠條以及標準化的實驗操作使得 2-DE 具有較高的重復性，可在不同實驗室間進行圖譜的比較。100 2-DE 存在不足和缺陷：分辨率仍不能完全滿足蛋白質(zhì)組學研究的需要。難以有效分離極酸、極堿性蛋白質(zhì)，極大、極小蛋白質(zhì)，及低豐度蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難以與質(zhì)譜實現(xiàn)自動化聯(lián)用。101第三節(jié) 生物質(zhì)譜技術(shù)102 一、質(zhì)譜（Mass spectrometry, MS）的基本原理 將樣品分子汽化并電離成離子，通過測定離子的質(zhì)荷比（m/z）和強度來進行定性和定量分析。103104InletIonizationMass

32、 AnalyzerMass Sorting (filtering)Ion DetectorDetectionIon SourceSolidLiquidVaporDetect ionsForm ions(charged molecules)Sort Ions by Mass (m/z)1330134013501007550250Mass Spectrum圖片來自網(wǎng)絡(luò)有機分子受到電子轟擊后，會斷裂形成不同的多種離子，得到的質(zhì)譜圖稱為標準質(zhì)譜圖，也叫棒圖。 10 0806040200204010 08060分子離子峰基峰相對強度（）質(zhì)荷比（m/z)105強度最大的質(zhì)譜峰稱為基峰，設(shè)其強度為100，其

33、它質(zhì)譜峰與基峰比較，得到相對強度。質(zhì)譜圖中由分子失去一個電子形成的離子的峰稱為分子離子峰，據(jù)此可直接得知樣品的分子量。二、生物質(zhì)譜 （biological mass spectrometry, BMS）離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。ESI 和 MALDI 為離子源的質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，因此被稱為生物質(zhì)譜。 106（一）離子源 使樣品分子電離成離子，并把離子加速后引入質(zhì)量分析器。 107MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) 基質(zhì)輔助激光解吸電離ESI ( electrosp

34、ray ionisation ) 電噴霧電離1.MALDI 離子源 將樣品與過量基質(zhì)混合加于樣品靶上，待溶劑揮發(fā)后樣品分子與基質(zhì)形成共結(jié)晶，激光照射樣品，基質(zhì)吸收激光能量后，均勻地傳遞給樣品分子，使樣品分子氣化并離子化。 108109MALDI2. ESI 離子源 待測分子以液相方式通過毛細管到達噴口，在高電壓作用下形成帶電荷的霧滴，隨著霧滴中溶劑的蒸發(fā)，其表面電荷密度不斷變大，到達某一臨界點時，樣品以離子方式蒸發(fā)進入氣相，從而實現(xiàn)離子化。110N2霧化氣4000V樣品溶液大氣壓真空TOF質(zhì)量分析器（二） 質(zhì)量分析器 質(zhì)量分析器的作用是把從離子源出來、具有不同 m/z 的離子分開，按先后順序到達檢測器，是質(zhì)譜儀的主體結(jié)構(gòu)。 生物質(zhì)譜中使用的質(zhì)量分析器主要有四極桿質(zhì)量分析器