實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)甘油凍存菌、引物、質(zhì)粒的保存

1、隨著科研的深入、課題的進(jìn)展，我們會(huì)從商家購(gòu)買質(zhì)粒菌種訂購(gòu)引物，我們自己也會(huì)構(gòu)建許 許多多的克隆載體。幾乎實(shí)驗(yàn)室所有人都會(huì)產(chǎn)生很多凍存菌、引物及質(zhì)粒。那么如何保存以 及管理這么多的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物呢？很多人一定見過上面的白色凍存盒，對(duì)于條件好點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室其使用的凍存盒可能更高檔。一 般凍存盒都是9*9格的，可以先對(duì)盒子進(jìn)行編號(hào)，1，2, 3.等，再對(duì)每個(gè)盒子內(nèi)部每小格 進(jìn)行編號(hào)，如A1,A2,B1.等。這個(gè)任何一個(gè)盒子的任意一格都有了唯一的編號(hào)對(duì)應(yīng)，如3C8, 指的是第三號(hào)盒子的C8格。建立好編號(hào)之后，再在標(biāo)準(zhǔn)的Excel表格中，建立起位置和凍存物的對(duì)應(yīng)關(guān)系。還應(yīng)記錄下 凍存菌/引物/質(zhì)粒的信息（如名稱，

2、序號(hào)，狀態(tài)，凍存時(shí)間等）。填寫好相關(guān)信息后，再將凍 存菌/引物/質(zhì)粒放于凍存盒的預(yù)定位置，保存到合適溫度的冰箱或液氮罐中。這樣大家就可 以有條不紊的管理自己的“小金庫(kù)”了，下面我們針對(duì)不同類型的凍存物，具體看看其保存 方法。一、甘油凍存菌的保存與復(fù)蘇簡(jiǎn)介按照菌種類型（如DH5a或者表達(dá)菌）的不同，分盒保存。凍存盒中的凍存管，可按凍存時(shí)間 排列。凍存菌保存在-800冰箱或液氮罐中。材料（MATERIALS）50%（v/v）滅菌甘油2 mL無菌凍存管1 mL已滅菌的槍頭無菌接種環(huán)或滅菌槍頭，含有合適抗生素或無抗的LB板實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）甘油菌的凍存：一般保種用的菌液要求濃一些，因此培養(yǎng)

3、時(shí)間可以比平時(shí)長(zhǎng)一些，一般過夜即可在無菌操作條件下，分別向已滅菌的2mL凍存管中，加入500uL菌液和500uL50%甘油溶液， 輕輕混勻，務(wù)必充分混勻；甘油凍存菌可以直接保存在-80C中，有時(shí)為了減少菌體因冰晶形成而死亡，也會(huì)使用液氮 速凍之后在放到-80 C冰箱保存。該凍存菌可在此條件下保存數(shù)年之久。隨后的凍存和融化 操作將會(huì)減少保存年限。（注意：與菌液接觸的物品，如槍頭、凍存管、50%甘油溶液均需要處于無菌狀態(tài)，并保證操作在無菌條件下進(jìn)行。）甘油菌的復(fù)蘇：從甘油凍存菌中復(fù)蘇細(xì)菌，在無菌條件下，打開蓋子，使用無菌接種環(huán)或滅菌槍頭從凍存管 中刮取適量?jī)龃婢?，劃線接種到LB板（含有合適抗生素或

4、無抗）上。操作應(yīng)適當(dāng)快一些， 以減少凍存管內(nèi)的融化。在合適的溫度條件下，將劃線接種的LB板進(jìn)行過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，挑取單個(gè)克隆進(jìn)行 后續(xù)操作。（注意：所有東西準(zhǔn)備完全后，再去-80 r冰箱取出保種菌，劃線動(dòng)作要快，時(shí)間拖得太長(zhǎng) 會(huì)融化凍存菌，而這導(dǎo)致保種菌死亡。）參考鏈接：/recipient-instructions/create-glycerol-stock/二、引物保存簡(jiǎn)介按照用途，引物分為PCR引物，測(cè)序引物。而按照存在狀態(tài)，引物則分為干粉/薄膜狀態(tài)、 100 uM稀釋狀態(tài)、10 uM稀釋狀態(tài)（10 uM為PCR的通常使用濃度）等三種狀態(tài)。材料（MATERIALS）1.5 mL EP

5、 管無菌蒸餾水實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）引物一般有兩管（均為干粉狀態(tài)），其中一管可直接保存，而另外一管可稀釋其中引物的濃 度至10uM （使用濃度）。兩管放置可在同一個(gè)凍存盒中的相鄰位置，按引物序號(hào)排列。PCR引物則根據(jù)引物的濃度不同（一般只有100uM和10uM兩種）進(jìn)行分盒保存。在每一 個(gè)凍存盒中，按照引物序號(hào)依次排列。引物保存在-200冰箱中。引物稀釋：先將裝有引物的EP管進(jìn)行離心，12000g離心1分鐘，將干粉或薄膜狀態(tài)的引物離心至管 底。然后，根據(jù)引物管上指示的體積，加入對(duì)應(yīng)量的無菌蒸餾水，使用槍頭吹打混勻，即可 得到濃度為100uM的引物。對(duì)其進(jìn)行10倍稀釋，即可得到濃度為10uM的引物。三、質(zhì)粒保存簡(jiǎn)介按照用途，質(zhì)粒一般分為PCR模板型質(zhì)粒（用于擴(kuò)增目的基因片段）和蛋白表達(dá)型質(zhì)粒（用 于表達(dá)目的蛋白）?？砂凑沼猛镜牟煌?，分盒保存。經(jīng)常使用的質(zhì)粒可以保存在-200冰箱中， 長(zhǎng)期保存建議放在-80C冰箱