細(xì)菌耐藥機(jī)制

1、細(xì)菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院從屬第一醫(yī)院俞云松第1頁第2頁第3頁一、外膜孔蛋白降低或丟失細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度降低膜孔蛋白(OprD): 第4頁細(xì)胞外膜上一些特殊蛋白是一個非特異性、跨越細(xì)胞膜水溶性物質(zhì)擴(kuò)散通道。膜 孔 蛋 白第5頁革 蘭 陰 性 細(xì) 菌 細(xì) 胞 膜第6頁一些細(xì)菌本身存在膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使一些抗菌藥品不能進(jìn)入菌體內(nèi)部，稱為“內(nèi)在性耐藥”或“固有性耐藥”（intrinsically resistant），即這種耐藥并非是因為任何染色體突變或是耐藥質(zhì)粒取得所致。如銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜上沒有大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌所含有經(jīng)典高滲透性孔蛋白，它孔蛋白通道對小分子物質(zhì)滲透速度僅為經(jīng)

2、典孔蛋白通道1%。 “先天不足”第7頁一些含有高滲透性外膜且反抗菌藥品敏感細(xì)菌能夠經(jīng)過降低外膜滲透性而發(fā)展成為耐藥菌，即原有孔蛋白通道因為細(xì)菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關(guān)閉或消失，則細(xì)菌就會對該抗菌藥品產(chǎn)生很高耐藥性。 亞胺培南是一個非經(jīng)典-內(nèi)酰胺類抗菌藥品，主要是經(jīng)過一個特殊孔蛋白通道OprD2擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌，一旦這一孔蛋白通道消失，則產(chǎn)生耐藥性。 “后天取得”第8頁產(chǎn)氣腸桿菌從亞胺培能敏感株變?yōu)槟退幹甑?頁亞胺培南敏感及耐藥產(chǎn)氣腸桿菌PFGE圖C1 C2:亞胺培南敏感C3 C4:亞胺培南耐藥第10頁亞胺培南敏感及耐藥產(chǎn)氣腸桿菌SDS圖C1 C2:亞胺培南敏感C3 C4:亞胺培南耐藥第11頁P(yáng)C

3、R擴(kuò)增Omp36全長及序列分析IS903 98%（約1000bp)第12頁插入序列引發(fā)OprD2缺失（銅綠）ISPa1328約bpOprD2第13頁細(xì)菌產(chǎn)生一個或各種水解酶或鈍化酶來水解或修飾進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗菌藥品，使之抵達(dá)靶位之前失去活性細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶主要有： -內(nèi)酰胺酶 氨基糖苷類鈍化酶 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 MLS鈍化酶二、 產(chǎn)生滅活酶第14頁超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）高產(chǎn)AmpC酶碳青霉烯酶最主要耐藥原因?qū)?內(nèi)酰胺抗生素造成威脅-內(nèi)酰胺酶臨床上最主要-內(nèi)酰胺酶第15頁是質(zhì)粒介導(dǎo)能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基-內(nèi)酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制一類

4、-內(nèi)酰胺酶。ESBLs在分子生物學(xué)分類中屬于A類酶，在Bush分類中屬于2be類酶。超廣譜-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum -lactamases，ESBLs）第16頁ESBLs分類依據(jù)基因同源性不一樣分為：TEM型 80SHV型 46CTX-M型 37OXA型 18其它型 20/studies/webt.htm.CTX-M-1組CTX-M-2組CTX-M-8組CTX-M-9組第17頁中國400株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型分布第18頁32家醫(yī)院 1994-年大腸桿菌及肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs百分率第19頁頭孢菌素酶 大部分腸桿菌科細(xì)菌如腸桿菌屬菌種、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根

5、菌、普魯菲登菌屬菌種粘質(zhì)沙雷菌等都能產(chǎn)生染色體介導(dǎo)AmpC酶。第20頁 陰溝腸桿菌第21頁ACT-1,DHA-1,CMY (Peking)DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai) DHA-1 (Zhejiang)DHA-1,ACT-1 (GuangZhou)DHA-1 is The Predominant Type in ChinaMap of China第22頁克隆片段PCR產(chǎn)物1100bp共6432bp ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1 DHA-1 ampR qacE1 sul15232 bp第23頁指全部能顯著水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯

6、類抗生素一類內(nèi)酰胺酶分別屬于Ambler分子分類中A類、B類、D類酶 。 碳青霉烯酶 第24頁天然起源碳青霉烯酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌L1酶取得性碳青霉烯酶（Ambler分子分類）B類酶（金屬酶）：IMP、VIM類及SPM-1A類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其起源可分為第25頁金屬酶染色體編碼金屬酶：BC ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多起源于環(huán)境寄生菌。取得性金屬酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可轉(zhuǎn)移基因元件上，造成區(qū)域性傳輸。第26頁IMP型金屬酶IMP型金屬酶GenB

7、ank上已公布21種，比較它們相互之間序列表明：IMP型金屬酶大致能夠分為兩組： 1）IMP-1、IMP3-7、IMP911、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20 第27頁中國IMP-4 20香港 鮑曼 20廣州 楊格枸櫞酸桿菌 、銅綠IMP-1 12月 江蘇無錫 銅綠IMP-8 2001 臺灣 銅綠第28頁VIM型金屬酶VIM型金屬酶 與IMP類金屬酶同源性40，但兩類金屬酶動力學(xué)性質(zhì)相同，編碼基因都位于整合子上。 當(dāng)前VIM型金屬酶GenBank上已公布12種，比較它們相互之間序列可將VIM金屬酶大致分為三組： 1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3

8、、6、8、9、10、11b 3）VIM-7第29頁VIM型金屬酶分布VIM-1 1999年 意大利 銅綠 氧化木糖產(chǎn)堿桿菌 惡臭假單胞 希臘 大腸 肺克 法國 肺克VIM-2 2000 法國 銅綠 意大利 希臘 日本 韓國 葡萄牙 西班牙 波蘭 克羅地亞 智利 阿根廷 美國 中國VIM-3 臺灣地域 銅綠VIM-4 年 希臘 銅綠 瑞典 銅綠 意大利 肺克 陰溝 波蘭 銅綠第30頁VIM-5 土耳其 肺克 銅綠VIM-6 新加坡 惡臭假單胞VIM-7 美國 銅綠VIM-8 哥倫比亞 銅綠VIM-9，10 英國VIM-11 阿根廷 意大利VIM型金屬酶分布第31頁亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌金屬酶檢

9、測結(jié)果北京（27）上海（32）杭州（27）廣州（32）成都（22）金屬酶表型陽性菌株數(shù)35310百分率11.115.611.13.10.0金屬酶基因型陽性菌株數(shù)36410百分率11.118.814.83.10.0第32頁 VIM-2基因整合子結(jié)構(gòu)圖A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 結(jié)構(gòu)同In72B： S5， S9， S10， S11， S12（S15、H22除外） intI1 attI1 aacA4 59-b VIM-2 59-be aadB 59-be 3-CS intI1 attI1 aacA4 59-be VIM-2 59-be 3-CSAB第33頁 H

10、22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker50kbAB H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54MarkerPFGE譜分析結(jié)果：共有七種類型，來自上海六株為同一類型，來自北京三株分兩個類型，來自杭州四株一樣也分兩個類型。各地域之間類型各不相同。重復(fù)嘗試經(jīng)過接合試驗及質(zhì)粒抽提物電轉(zhuǎn)化傳遞金屬酶基因均未獲成功。經(jīng)XbaI內(nèi)切酶消化染色體PFGE與VIM-2探針雜交顯示其中10株銅綠假單胞菌50-kb大小酶切片段雜交陽性，而其余3株（H22、H26、B2）沒有陽性片段。第34頁類酶

11、包含陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌中由染色體介導(dǎo)NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導(dǎo)KPC-1-4酶、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)GES-2酶。碳青霉烯類抗生素水解酶第35頁二株產(chǎn)IMI-1陰溝腸桿菌PFGE結(jié)果第36頁AntibioticsMIC(mg/l)E cloacaeE C600 E.coli C600E8 E.coli DH5E.coli pT103Imipenem320.38320.2532Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ce

12、ftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid2561232432Ampicillin/Sulbactam2568641.5NDE cloacae 8, E C600, E.coli C600E8，E.coli pT103和E.coli DH5反抗菌藥品體外抗菌活性第37頁陰溝腸桿菌、接合菌質(zhì)粒電泳圖

13、譜 M1A B M2 54kb 15kb第38頁Schematic representation of the cloned E.coRfragmentIS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp 921bp 882bp 876bp 921bp10629bp(GenBank accession number : AY780889 )Imi-R與ImiR同源性為97%。IMI-2與IMI-1同源性99%，僅在37位由天冬氨酸天冬酰胺，106位由組氨酸酪氨酸 第39頁抗菌藥品肺炎克雷伯菌亞胺培南32亞胺培南/克拉維酸16美羅培南32美羅培南/克拉維酸16厄他培南256頭孢他啶256頭

14、孢他啶/克拉維酸256頭孢噻肟256頭孢噻肟/克拉維酸256頭孢吡肟256頭孢曲松256頭孢西丁256氨曲南256頭孢哌酮/舒巴坦256哌拉西林/三唑巴坦256環(huán)丙沙星32阿米卡星256多重耐藥肺炎克雷伯菌第40頁轉(zhuǎn)化試驗抽提亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5，在含1g/ml亞胺培南MH平板上篩選成功篩選到亞胺培南耐藥轉(zhuǎn)化菌（轉(zhuǎn)化質(zhì)粒約60kb）染色體帶61kb第41頁P(yáng)CRPCR篩選內(nèi)酰胺酶耐藥基因包含TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM 、 OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA為模板PCR陽性為TEM、SHV和KPC轉(zhuǎn)化菌和克隆菌只有KP

15、C陽性PCR產(chǎn)物測序分別為TEM-1、SHV-12和KPC-2第42頁轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒（亞胺培南耐藥基因克隆）EcoR, Hind，Nhe等酶切NhepTeasy VectorpTeasy Vector1.5kb在含亞胺培南1g/ml MH平板篩選第43頁克隆片段測序?qū)χ亟M質(zhì)粒插入片段進(jìn)行步移測序，取得1554bp核苷酸 DNAssist軟件分析，1個開放讀碼框(ORF)經(jīng)GenBank Blast程序分析，該ORF與KPC-2 (GenBank注冊號:AY210886) 核苷酸序列同源性為100% 第44頁D類酶 （OXA酶）在Bush分群中屬于2d類，對苯唑西林水解活性很強(qiáng)。OXA型碳青霉烯酶對

16、亞胺培南水解活性較低，對頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉維酸抑制。OXA型碳青霉烯酶編碼基因可位于質(zhì)?；蛉旧w上，或定位在I型整合子基因盒中，具備向其它菌種轉(zhuǎn)移能力 碳青霉烯類抗生素水解酶第45頁blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我國鮑曼不動桿菌最主要碳青霉烯酶，ISAba1與OXA基因表示和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)342株亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中339株檢測到最少一個OXA基因，303株檢測到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只檢測到OXA-23-like基因，17株只檢測到OXA-51-like基因

17、；其中在313株菌株OXA-23-like基因上游34bp處檢測到ISAba1，在13株菌株OXA-51-like基因上游7bp處檢測到ISAba1。第46頁氨基糖苷類鈍化酶分為： 磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH） 乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC） 核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）氨基糖苷類鈍化酶作用機(jī)制： 三者分別使抗生素羥基磷酸化、氨基乙酰化和羥基核苷化，使之不能再與細(xì)菌核糖體結(jié)合。氨基糖苷類耐藥第47頁慶大霉素高水平耐藥（HLGR ） 主要耐藥機(jī)制 氨基糖苷類修飾酶 耐藥基因 百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90% APH(2)-Ic aph(2)-Ic APH(2)

18、-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib 10%氨基糖苷類耐藥第48頁8,724bpORF1ORF2ORF4ORF353ISEcp1 (tnpA) aph-Ie repD str部分序列 一個新質(zhì)粒介導(dǎo)腸球菌氨基糖苷類耐藥基因aph(2”)-Ie第49頁三、靶位改變第50頁主要抗菌藥品作用靶位-內(nèi)酰胺類 青霉素結(jié)合蛋白（PBP）氨基糖苷類 核糖體30S亞基大環(huán)內(nèi)酯類 核糖體50S亞基氟喹諾酮類 DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶 ）、拓?fù)洚悩?gòu)酶糖肽類 D-丙氨酰D-丙氨酸四環(huán)素類 核糖體50S亞基 第51頁P(yáng)BP2a作用PBP2a與-內(nèi)酰胺抗生素親和力低，替換正常PBP功效 8

19、7KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP4第52頁第53頁第54頁DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR1mecAorfXJ1J3J2SCCmec第55頁第56頁IV型第57頁VSHA-MRSACA-MRSA 高 耐藥性 較低 陰性 PVL 陽性I、II、III SCCmec IV、V第58頁金葡菌耐藥性發(fā)展歷程S. aureusPenicillin-resistantS. aureusMethicillin-resistantS. aureus (MRSA)PenicillinMethicillinVancomyc

20、in-resistantenterococcus (VRE)Vancomycin (glycopeptide)-Intermediate-ResistantS. Aureus （VISA、GISA）Vancomycin-ResistantS. Aureus（VRSA）Vancomycin19401960s1990s1996Superbugs第59頁氟喹喏酮耐藥機(jī)理拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV(parC, parE)拓?fù)洚悩?gòu)酶 II (gyrA, gyrB)左氧氟沙星氟喹喏酮第60頁糖肽類抗生素包含萬古霉素、替考拉寧等，是高分子量疏水性化合物。主要耐藥機(jī)制： VRE細(xì)胞壁肽糖前體末端D-丙氨酰-D-丙氨酸發(fā)

21、生了改變，萬古霉素不能與之相結(jié)合，所以不能抑制VRE細(xì)胞壁合成。 耐萬古霉素腸球菌（VRE）第61頁transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp (ZY02, HS3 )表示PCR擴(kuò)增vanYvanZ10Kb （ZY01）轉(zhuǎn)座功效（轉(zhuǎn)座酶transposase基因和解離酶revolsase基因，分別編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中發(fā)揮作用）調(diào)控耐藥基因（VanR和VanS）產(chǎn)生耐糖肽類縮肽（VanH脫氫酶、VanA連接酶和VanX二肽酶）輔助蛋白（VanY和VanZ）含VanA基因簇轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座入各種質(zhì)粒，或經(jīng)過接合轉(zhuǎn)座造成VRE耐藥性傳輸 第6

22、2頁大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制核糖體靶位點(diǎn)改變: erm 編碼，高耐; 法國、西班牙、中國主動外排泵: mef 編碼，低耐 ，加拿大、美國、修飾酶第63頁16S rRNA甲基化酶氨基糖苷類抗生素作用位點(diǎn)：細(xì)菌16S rRNA以往認(rèn)為最主要氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制：修飾酶，作用位點(diǎn)在藥品，引發(fā)一個或幾個藥品耐藥最新發(fā)覺一類新氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制： 16S rRNA甲基化酶，引發(fā)藥品作用位點(diǎn)甲基化，造成細(xì)菌對全部氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，當(dāng)前發(fā)覺4種：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐藥鮑曼不動桿菌在我國各省市廣泛流行，該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率和耐藥水平高16S rRNA甲基化酶是否在

23、介導(dǎo)該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中發(fā)揮作用需要系統(tǒng)研究第64頁700株鮑曼不動桿菌對5種氨基糖苷類抗生素體外抗菌活性5種氨基糖苷類抗生素耐藥率均大于60；377株（53.9）菌株對5種氨基糖苷類抗生素均耐藥；334株（47.7）菌株armA陽性；armA陽性菌株對上述全部氨基糖苷類抗生素均高水平耐藥,MIC256mg/L 重復(fù)進(jìn)行接合試驗、質(zhì)粒抽提、電轉(zhuǎn)化均未成功 Southern-blot雜交證實armA基因位于克隆A、B、C約220kb、300kb、220kb大小染色體ApaI酶切條帶上armA基因定位于鮑曼不動桿菌染色體第65頁四、主動外運(yùn) 有些抗菌藥品（常見如四環(huán)素類及喹諾酮類）能誘導(dǎo)細(xì)

24、菌主動外運(yùn)，抗菌藥品難以在細(xì)菌內(nèi)積累到有效濃度，造成反抗菌藥品耐藥程度普遍提升。第66頁外排泵結(jié)構(gòu)外排系統(tǒng)由3個部分組成：位于內(nèi)膜腫瘤耐藥分化家族(resistantnodulationdivision family，RND)質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)外膜之間膜周連接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜孔道形成蛋白(0EP) 第67頁組間外排泵表示量均值比較第68頁 是指細(xì)菌粘附于固體或有機(jī)腔道表面，形成微菌落，并分泌細(xì)胞外多糖蛋白復(fù)合物將本身包裹其中而形成膜狀物。其生化組成為藻酸鹽多糖和蛋白復(fù)合物。菌膜可阻止巨噬細(xì)胞、抗體、藥品作用于菌體五、細(xì)菌生物被膜（Biofilm）第69頁生 物 被 膜第70頁 細(xì)菌

25、形成生物被膜后，往往反抗菌藥品產(chǎn)生高度耐藥性，原因有細(xì)菌生物被膜可降低抗菌藥品滲透吸附抗菌藥品鈍化酶，促進(jìn)抗菌藥品水解細(xì)菌生物被膜下細(xì)菌代謝低下，反抗菌藥品不敏感生物被膜存在阻止了機(jī)體對細(xì)菌免疫力，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，減弱機(jī)體免疫力與抗菌藥品協(xié)同殺菌作用第71頁其它耐藥機(jī)制缺乏自溶酶替換路徑酶過量產(chǎn)生等靶位保護(hù)機(jī)制第72頁質(zhì)粒介導(dǎo)喹喏酮耐藥 1998年George.A.Jacoby等從一株肺炎克雷伯菌（UAB1）中發(fā)覺能介導(dǎo)各種抗生素耐藥質(zhì)粒pMG252，經(jīng)接合傳遞后其接合子對環(huán)丙沙星耐藥性增加近30倍(MIC 0.0080.25g /mL)。 在該質(zhì)粒內(nèi)發(fā)覺了喹諾酮耐藥（quinolone r

26、esistance）基因，命名為qnr (Lancet1998; 351: 79799) 第73頁作用機(jī)制保護(hù)DNA旋轉(zhuǎn)酶Qnr經(jīng)過與旋轉(zhuǎn)酶特異地結(jié)合從而影響酶內(nèi)在活性,降低了酶與DNA結(jié)合,造成喹諾酮類藥品作用靶位數(shù)量降低Qnr與旋轉(zhuǎn)酶結(jié)合,改變了藥品結(jié)合區(qū)域構(gòu)象,從而降低了藥品識別靶位效率保護(hù)拓?fù)洚悩?gòu)酶細(xì)菌對拓?fù)洚悩?gòu)酶保護(hù)作用與DNA旋轉(zhuǎn)酶類似Hegde, S.S. et al. Science 308:1480, QnrDNA旋轉(zhuǎn)酶第74頁表 5株qnrA陽性大腸埃希菌及其接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP6312825664322561621225

27、6Tc631410.52564414256140642566432322888256Tc1401421162884256142484162564424256Tc1420.50.511322882256Z8161616321284256256256256TcZ80.060.060.1250.06128464256256256Z11326416321284256256256256TcZ110.060.060.1250.0664464256256256J53 0.015 0.125 0.125 0.03 0.06 0.1254 1 1 2 J53為受體菌第75頁表3 8株qnrA陽性肺炎克雷伯菌及其

28、接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP14-26412864128322111256Tc14-20.250.510.251622212562564256643225616422256Tc2518121284414256316425612812825616212256Tc31181225684122569628221282428256Tc961812256841425615181684644428256Tc1511110.25321212256152864441282428256Tc1520.520.50.56414142561533212816163264256256256256Tc1530.51121612122561564821644428256Tc1562820.2564441425