核因子受體活化因子配基試劑盒使用方法使用目的

1、核因子受體活化因子配基試劑盒使用方法使用目的： 本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中核因子B 受體活化因子配基（ RANKL）含量。核因子受體活化因子配基試劑檢測說明實驗原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠核因子B 受體活化因子配基（RANKL）水平。用純化的大鼠核因子B 受體活化因子配基（RANKL）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入核因子B 受體活化因子配基（RANKL），再與 HRP標(biāo)記的核因子B 受體活化因子配基（RANKL）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在

2、酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核因子B 受體活化因子配基（RANKL）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠核因子B 受體活化因子配基（RANKL）濃度。試劑盒組成1 30 倍濃縮洗滌液 20ml1 瓶 7 終止液 6ml1 瓶2 酶標(biāo)試劑 6ml1 瓶 8 標(biāo)準(zhǔn)品（960 pmol/L） 0.5ml1 瓶3 酶標(biāo)包被板 12 孔8 條 9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml1 瓶4 樣品稀釋液 6ml1 瓶 10 說明書 1 份5 顯色劑 A 液 6ml1 瓶 11 封板膜 2 張6 顯色劑 B 液 6ml1/瓶 12 密封袋 1

3、個標(biāo)本 要求1標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。核因子受體活化因子配基試劑檢測說明操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。480 pmol/L 5 號標(biāo)準(zhǔn)品 150l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液240 pmol/L 4 號標(biāo)準(zhǔn)品 150l 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液120 pmol/L 3 號標(biāo)準(zhǔn)品 150l 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150

4、l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液60 pmol/L 2 號標(biāo)準(zhǔn)品 150l 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液30 pmol/L 1 號標(biāo)準(zhǔn)品 150l 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50l，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40l，然后再加待測樣品 10l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37溫育 30 分鐘。4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用5. 洗滌：

5、小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)： ：計算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查

6、出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。核因子受體活化因子配基試劑檢測說明注意事項1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（n5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請避光保存。